DNA methylation patterns of candidate genes regulated by thymine DNA glycosylase in patients with TP53 germline mutations

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is a rare, autosomal dominant, hereditary cancer predisposition disorder. In Brazil, the p.R337H TP53 founder mutation causes the variant form of LFS, Li-Fraumeni-like syndrome. The occurrence of cancer and age of disease onset are known to vary, even in patients carrying the same mutation, and several mechanisms such as genetic and epigenetic alterations may be involved in this variability. However, the extent of involvement of such events has not been clarified. It is well established that p53 regulates several pathways, including the thymine DNA glycosylase (TDG) pathway, which regulates the DNA methylation of several genes. This study aimed to identify the DNA methylation pattern of genes potentially related to the TDG pathway (CDKN2A, FOXA1, HOXD8, OCT4, SOX2, and SOX17) in 30 patients with germline TP53mutations, 10 patients with wild-type TP53, and 10 healthy individuals. We also evaluated TDG expression in patients with adrenocortical tumors (ADR) with and without the p.R337H TP53 mutation. Gene methylation patterns of peripheral blood DNA samples assessed by pyrosequencing revealed no significant differences between the three groups. However, increased TDG expression was observed by quantitative reverse transcription PCR in p.R337H carriers with ADR. Considering the rarity of this phenotype and the relevance of these findings, further studies using a larger sample set are necessary to confirm our results.

Mode de vie, habitudes alimentaires et cancer du sein: Étude cas-témoins chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations des gènes BRCA

Le cancer du sein (CS) est la deuxième cause de décès liés au cancer parmi les femmes dans la plupart des pays industrialisés. Les personnes qui ont le CS peuvent ne pas hériter des mutations causant le cancer de leurs parents. Ainsi, certaines cellules subissent des mutations qui mènent au cancer. Dans le cas de cancer héréditaire, les cellules tumorales contiennent généralement des mutations qui ne sont pas trouvées ailleurs dans l'organisme, mais peuvent maintenir des mutations qui vont répartir dans toutes les cellules. La genèse du CS est le résultat des mutations de gènes qui assurent la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Deux gènes semblent particulièrement concernés par les mutations. Les gènes ‘Breast Cancer 1’ (BRCA1) et ‘Breast Cancer 2’ (BRCA2), sont impliqués dans la prédisposition génétique de CS. On estime que 5-10% des cas de cancer du sein sont attribuables à une prédisposition génétique. La plupart de ces cancers sont liés à une anomalie du gène BRCA1 ou BRCA2. Plusieurs études ont été menées chez les femmes atteintes de CS sporadique et quelques études se sont concentrées sur celles qui sont porteuses de mutations de BRCA. Alors, notre recherche a été entreprise afin de vérifier l’hypothèse d’une association entre le CS, le mode vie et les habitudes alimentaires chez les Canadiennes-françaises non porteuses des 6 mutations de BRCA les plus fréquentes parmi cette population. Nous avons mené une étude cas-témoins dans cette population. Quelque 280 femmes atteintes du cancer du sein et non-porteuses de mutations de BRCA, ont été recrutées en tant que cas. Les témoins étaient recrutés parmi les membres de la famille des cas (n=15) ou à partir d'autres familles atteintes de CS (n=265). Les participantes étaient de tous âges, recrutées à partir d’une étude de cohorte qui est actuellement en cours, menée par une équipe de chercheurs au Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (CHUM) Hôtel-Dieu à Montréal. Les apports alimentaires ont été recueillis par un questionnaire de fréquence semi-quantitatif validé et administré par une nutritionniste, qui portait sur la période avant les deux ans précédant le premier diagnostic de CS pour les cas et la période avant les deux ans précédant l’entrevue téléphonique pour les témoins. Un questionnaire de base était administré par l’infirmière de recherche aux participantes afin de colliger des renseignements sociodémographiques et sur les facteurs de risque du CS. Une association positive et significative a été détectée entre l’âge (plus de 50 ans) auquel les sujets avaient atteint leur Indice de Masse Corporel (IMC) le plus élevé et le CS rapport de cotes (OR) =2,83; intervalle de confiance à 95% (IC95%) (2,34-2,91). De plus, une association positive a été détectée entre un gain de poids de >34 lbs comparativement à un gain de poids de ≤15 lbs, dès l’âge de 20 ans OR=1,68; IC95% (1,10-2,58). Un gain de poids de >24 lbs comparativement à un gain de poids de ≤9 lbs, dès l’âge de 30 ans a aussi montré une augmentation de risque de CS OR=1,96; IC95% (1,46-3,06). Une association positive a aussi été détecté entre, un gain de poids de >12 lbs comparativement à un gain de poids de ≤1 lb, dès l’âge de 40 ans OR=1,91; IC95% (1,53-2,66). Concernant le tabagisme, nous avons observé une association positive et significative reliée à la consommation de plus de 9 paquets-années OR = 1,59; IC95% (1,57-2,87). Il fut suggéré que l’activité physique modéré confère une protection contre le CS: une pratique de > 24,8 (‘metabolic equivalent’) MET-hrs par semaine par rapport à ≤10,7 MET-hrs par semaine, diminue le risque du CS de 52% OR = 0,48 ; IC95% (0,31-0,74). L’activité physique totale (entre 16,2 et 33,2 MET-hrs par semaine), a aussi montré une réduction de risque de CS de 43% OR = 0,57 ; IC95% (0,37-0,87). Toutefois, il n'y avait aucune association entre une activité physique vigoureuse et le risque de CS. L’analyse portant sur les macro- et micro-nutriments et les groupes alimentaires a montré qu’un apport en énergie totale de plus de 2057 Kcal par jour augmentait le risque de CS de 2,5 fois OR = 2,54; IC95% (1,67-3,84). En ce qui concerne la consommation de café, les participantes qui buvaient plus de 8 tasses de café par jour avaient un risque de CS augmenté de 40% OR = 1,40; IC95% (1,09-2,24). Les sujets ayant une consommation dépassant 9 g d’alcool (éthanol) par jour avaient également un risque élevé de 55% OR = 1,55; IC95% (1,02-2,37). De plus, une association positive et significative a été détectée entre le CS et la consommation de plus de deux bouteilles de bière par semaine OR = 1,34; IC95% (1,28-2,11), 10 onces de vin par semaine OR = 1,16; IC95% (1,08-2,58) ou 6 onces de spiritueux par semaine OR = 1,09; IC95% (1,02-2,08), respectivement. En résumé, les résultats de cette recherche supportent l’hypothèse selon laquelle le mode de vie et les habitudes alimentaires jouent un rôle important dans l’étiologie de CS chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations de BRCA. Les résultats nous permettent de constater que le gain de poids et le tabagisme sont liés à des risques élevés de CS, tandis que l'activité physique modérée aide à réduire ce risque. De plus, nos résultats suggèrent qu’un apport énergétique total relativement élevé et une consommation élevée de café et d'alcool peuvent accroître le risque de ce cancer. Ce travail a permis de mettre l’accent sur une nouvelle direction de recherche, jusqu'à présent non investiguée. Les résultats de ce travail de recherche pourraient contribuer à recueillir de nouvelles informations et des conseils pouvant influencer et aider la population à modifier son mode de vie et ses habitudes alimentaires afin de diminuer le risque de cancer du sein.

Deletion of the RNR4 gene causes hyperresistance to the carcinogen 4-NQO in the yeast model

La stabilité génomique, qui est essentielle à la vie, est possible grâce à la réplication et la réparation de l’ADN. Une des enzymes responsables de la réplication et de la réparation de l’ADN est la ribonucleotide reductase (RNR), qui est retrouvée chez la levure et chez l’humain. Cette enzyme catalyse la formation de déoxyribonucléotides et maintien le pool de dNTP requis pour la réparation et la réplication de l’ADN. L’enzyme RNR est un tétramère α2β2 constitué d’une grande (R1, α2) et d’une petite (R2, β2) sous-unité. Chez S. cerevisiae, les gènes RNR1 et RNR3 encodent la sous-unité α2 (R1). L’activité catalytique de RNR dépend d’une interaction avec le fer et de la formation d’un complexe entre R1 et R2. L’expression de toutes les sous-unités est inductible par les dommages causés à l’ADN. Dans cette étude, nous démontrons que des cellules qui n’expriment pas une des sous-unités, Rnr4, du complexe RNR sont sensibles à divers agents endommageant l’ADN, tels que le méthyl méthane sulfonate, la bléomycine, le péroxyde d’hydrogène et les rayons ultraviolets (UVC 254 nm). Au contraire, le mutant est résistant au 4-nitroquinoline-1- oxide (4-NQO), un composé qui engendre des lésions encombrantes. Par conséquent, le mutant rnr4Δ démontre une réduction marquée en mutations induites par le 4-NQO comparativement à la souche parentale. Nous voulions identifier la voie de réparation de l’ADN qui conférait cette résistance au 4-NQO ainsi que les protéines impliquées. Les voies BER, NER et MMR n’ont pas aboli la résistance au 4-NQO de la souche rnr4Δ. La protéine recombinante Rad51 ne joue pas un rôle critique dans la réparation de l’ADN et dans la résistance au 4-NQO. La délétion du gène REV3, qui encode une polymérase de contournement, impliquée dans la réparation post-réplication, a partiellement aboli la résistance au 4-NQO dans rnr4Δ. Ces résultats suggèrent que la polymérase Rev3 et possiblement d’autres polymérases translésion (Rev1, Rev7, Rad30) pourraient être impliquées dans la réparation de lésions encombrantes dans l’ADN dans des conditions de carence en dNTP. La réparation de l’ADN, un mécanisme complexe chez la levure, implique une vaste gamme de protéines, dont certaines encore inconnues. Nos résultats indiquent qu’il y aurait plus qu’une protéine impliquée dans la résistance au 4-NQO. Des investigations plus approfondies seront nécessaires afin de comprendre la recombinaison et la réparation post-réplication.

Mutations du gène HFE dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus agressif avec le plus haut taux de mortalité. La croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire est limitée par les nutriments de l’environnement, le fer étant un des éléments indispensables à leur prolifération. L’hémochromatose héréditaire est une maladie associée à une accumulation corporelle de fer. Cette maladie est liée à deux mutations majeures du gène HFE soit H63D et C282Y. Étant donnée l’influence de la protéine HFE sur l’entrée du fer dans la cellule, des mutations du gène HFE pourraient être associées à une croissance rapide des cellules cancéreuses. Des études de génotypage du gène HFE effectuées chez 526 patientes avec cancer épithélial de l’ovaire, ont révélées une fréquence allélique de la mutation C282Y significativement plus élevées chez les patientes avec tumeur ovarienne comparativement aux patientes du groupe contrôle (5.9% versus 1.3%, p = 0.02). De plus, le taux de survie des patientes avec mutations C282Y et tumeur ovarienne de G3, après 2 ans, est faible (20%) lorsque comparé à celui des patientes sans mutations (60%, p = 0.005). Une analyse de régression multivariée de Cox a démontrée un risque relatif de 3.1, suggérant que les patientes avec mutations C282Y ont 3 fois plus de chance d’avoir une faible survie (p=0.001). Également, des études de corrélation ont démontrées que les niveaux de ferritine du sérum étaient plus élevés chez les patientes avec grade avancé du cancer épithélial de l’ovaire (r = 0.445 et p= 0.00001), suggérant que ce paramètre pourrait servir comme marqueur tumoral. Afin de comprendre ces résultats, nous avons tout d’abord étudiés l’influence des mutations HFE sur les cellules cancéreuses. Pour ce faire, la lignée du cancer de l’ovaire TOV-112D, homozygote pour la mutation C282Y, a été transfectée avec les vecteurs HFEwt et HFEC282Y. Bien qu’aucune différence significative n’ait été trouvée en termes de TfR totaux, des analyses par FACS ont démontrées un phénotype de déficience de fer pour les clones stables HFEwt. In vitro, la restauration de la protéine HFE, dans la lignée TOV-112D du cancer de l’ovaire, n’influence pas la croissance cellulaire. Ensuite, nous avons étudiés l’influence des niveaux de fer sur la progression tumorale. Une expérience in vivo préliminaire a démontré une tendance à un volume tumoral supérieur dans un modèle de souris de surcharge de fer,HfeRag1-/-. De plus, les souris HfeRag1-/-, injectées avec la lignée du cancer de l’ovaire TOV-21G, ont montrées des niveaux significativement plus faibles de fer sérique comparativement à leur contrôle (fer sérique 40±7μM versus 27±6μM, p = 0.001). En conclusion, des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre davantage le rôle des mutations HFE sur la progression tumorale. Notamment, les niveaux élevés de fer pourraient rendre les cellules tumorales résistantes aux traitements ou encore, augmenter la toxicité et ainsi, contribuer à un mauvais prognostique.

Analyse fonctionnelle de deux nouvelles mutations récessives de l’AQP2 impliquées dans le diabète insipide néphrogénique par expression dans les ovocytes de Xenopus laevis

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives.

The in vivo characterization of the DNA repair gene apn-1 in the model organism Caenorhabditis elegans

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

Mutations impliquées dans la progression du cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Role of the Protein Tyrosine Kinase 7 gene in human neural tube defects

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations.

Deletion Analysis of 15 exons located outside and inside a “Hot Spot” in the Duchenne Muscular Dystrophy gene in Duchenne’s Muscular dystrophy patients

Introduction. Duchenne and Becker Muscular Dystrophies (DMD/DMB) are X-linked recessive diseases characterized by progressive muscle weakness and wasting, loss of motor skills and death after the second decade of life. Deletions are the most prevalent mutations that affect the dystrophin gene, which spans 79 exons.Objective: Identify deletions on the dystrophin gene in 58 patients affected with DMD.Methods: Through multiplex PCR identify deletions on the dystrophin gene in 58 patients with DMD and observe the frequency of this mutation in our population.Results: We found deletions in 1.72% of patients (1 of 58 persons). Deletions were not the principal cause of disease in our population. It is possible that duplications and point mutations caused this illness in our patients.Conclusions: The frequency of deletions in the 15 exons analyzed from the dystrophin gene was low. The predominant types of mutation in our patients` samples were not deletions as has been observed in the literature worldwide, therefore, it is important to determine other types of mutations as are duplications and point mutations.

Characterization of recombinant influenza B viruses with key neuraminidase inhibitor resistance mutations

Objectives and methods: An influenza B virus plasmid-based rescue system was used to introduce site-specific mutations, previously observed in neuraminidase (NA) inhibitor-resistant viruses, into the NA protein of six recombinant viruses. Three mutations observed only among in vitro selected zanamivir-resistant influenza A mutants were introduced into the B/Beijing/1/87 virus NA protein, to change residue E116 to glycine, alanine or aspartic acid. Residue E116 was also mutated to valine, a mutation found in the clinic among oseltamivir-resistant viruses. An arginine to lysine change at position 291 (292 N2 numbering) mimicked that seen frequently in influenza A N2 clinical isolates resistant to oseltamivir. Similarly, an arginine to lysine change at position 149 (152 in N2 numbering) was made to reproduce the change found in the only reported zanamivir-resistant clinical isolate of influenza B virus. In vitro selection and prolonged treatment in the clinic leads to resistance pathways that require compensatory mutations in the haemagglutinin gene, but these appear not to be important for mutants isolated from immunocompetent patients. The reverse genetics system was therefore used to generate mutants containing only the NA mutation. Results and conclusions: With the exception of a virus containing the E116G mutation, mutant viruses were attenuated to different levels in comparison with wild-type virus. This attenuation was a result of altered NA activity or stability depending on the introduced mutation. Mutant viruses displayed increased resistance to zanamivir, oseltamivir and peramivir, with certain viruses displaying cross-resistance to all three drugs.

Identification of mutations conferring insecticide-insensitive AChE in the cotton-melon aphid, Aphis gossypii Glover

We have identified two mutations in the ace1 gene of Aphis gossypii that are associated with insensitivity of acetylcholinesterase (AChE) to carbamate and organophosphate insecticides. The first of these, S431F (equivalent to F331 in Torpedo californica), is associated with insensitivity to the carbamate insecticide pirimicarb in a range of A. gossypii clones. The S431F mutation is also found in the peach-potato aphid, Myzus persicae (Sulzer), and a rapid RFLP diagnostic allows the identification of individuals of both aphid species with a resistant genotype. This diagnostic further revealed the presence of S431 in several other pirimicarb-susceptible aphid species. The serine at this position in the wild-type enzyme has only been reported for aphids and provides a molecular explanation of why pirimicarb has a specific aphicidal action. A less specific insensitivity to a wide range of carbamates and organophosphates is associated with a second mutation, A302S (A201 in T. californica).

Influence of mutations affecting gonadotropin production or responsiveness on expression of inhibin subunit mRNA and protein in the mouse ovary

Measurement of inhibins A and B in the serum of normal cyclic rodents has implicated FSH in the regulation of these peptides within the ovary. To extend these observations we have used a panel of mutant mice carrying mutations which affect either the production of, or the ability to respond to, FSH and LH. As a consequence, the females are infertile and show different degrees of follicular development. The aim of this study was to measure inhibin gene transcription in the ovaries of these mutant females together with inhibin protein levels in ovaries and serum and to relate these to follicular development within the ovary. Comparison was made with a pool of normal/heterozygous females. In hpg females where lack of GnRH production results in the absence of gonadotropin synthesis, in FSHbeta knockout (FSHbetaKO) females where disruption of the gene encoding FSHbeta results in the absence of FSH production, and in FSH receptor knockout (FSHRKO) females which are unable to respond to circulating FSH, follicular development remains at the pre-antral stage in these three mutants. Only in the hpg females were common inhibin alpha subunit mRNA levels significantly lower than normal. In these three mutants, however, mRNA levels for both the betaA and betaB subunits were extremely low compared with normal mice. At the protein level, neither inhibin A nor B was detected in the serum of these three mutants; however inhibin B, albeit at very low levels, was detectable within the ovaries. These observations confirm a major role for FSH in the control of transcription of the RA and betaB genes but suggest that the constitutive transcription of the alpha subunit is less dependent on FSH. In contrast, in LH receptor knockout (LuRKO) female mice inhibin betaA subunit mRNA levels were similar to those measured in normal/heterozygous females but levels of inhibin alpha and betaB subunit mRNAs were significantly higher than in the normal group. This was reflected in significantly higher inhibin B protein levels in ovaries and serum. An inability to respond to LH combined with high circulating levels of FSH leads to a high proportion of antral follicles in LuRKO females, with granulosa cells constituting the major cell type within the ovary. The high percentage of antral granulosa cells is likely to account for the significantly higher levels of inhibin B production in these ovaries.

Reversible phase variation in the phnE gene, which is required for phosphonate metabolism in Escherichia coli K-12

It is known that Escherichia coli K-12 is cryptic (Phn(-)) for utilization of methyl phosphonate (MePn) and that Phn(+) variants can be selected for growth on MePn as the sole P source. Variants arise from deletion via a possible slip strand mechanism of one of three direct 8-bp repeat sequences in phnE, which restores function to a component of a putative ABC type transporter. Here we show that Phn(+) variants are present at the surprisingly high frequency of >10(-2) in K-12 strains. Amplified-fragment length polymorphism analysis was used to monitor instability in phnE in various strains growing under different conditions. This revealed that, once selection for growth on MePn is removed, Phn(+) revertants reappear and accumulate at high levels through reinsertion of the 8-bp repeat element sequence. It appears that, in K-12, phnE contains a high-frequency reversible gene switch, producing phase variation which either allows ("on" form) or blocks ("off" form) MePn utilization. The switch can also block usage of other metabolizable alkyl phosphonates, including the naturally occurring 2-aminoethylphosphonate. All K-12 strains, obtained from collections, appear in the "off" form even when bearing mutations in mutS, mutD, or dnaQ which are known to enhance slip strand events between repetitive sequences. The ability to inactivate the phnE gene appears to be unique to K-12 strains since the B strain is naturally Phn(+) and lacks the inactivating 8-bp insertion in phnE, as do important pathogenic strains for which genome sequences are known and also strains isolated recently from environmental sources.