Effetto di una auxina sulla crescita e composizione della microalga verde Desmodesmus communis

La coltivazione massiva di microalghe ha lo scopo di produrre biomassa su larga scala per ottenere prodotti e processi utili, grazie al loro elevato contenuto di carboidrati, proteine, lipidi, pigmenti e altri composti, che sono utilizzati a livello industriale in campo alimentare, medico e nutraceutico. L’elevata potenzialità di utilizzo di questa biomassa ha assunto un ruolo primario nell’ambito della produzione di energia ecocompatibile o di processi utili per l’ambiente. Dalle microalghe è possibile estrarre lipidi da utilizzare come biocarburanti e possono trovare applicazione anche nel trattamento di reflui domestici ed industriali, nella produzione di composti bioattivi atti alla produzione di biopolimeri, fertilizzanti e ammendanti. Le problematiche inerenti ad una produzione industriale, riguardano la riduzione dell’impatto energetico, ambientale ed i costi di produzione con l’obbiettivo di massimizzare la resa della coltura; questo potrebbe essere realizzato attraverso l’utilizzo di sostanze di crescita che diversi studi mostrano come siano presenti naturalmente nelle microalghe. Il lavoro di questa tesi si è incentrato sulla valutazione degli effetti di ormoni vegetali sulla crescita e la composizione molecolare della microalga verde Desmodesmus communis, organismo noto nell’ambito del trattamento delle acque reflue e specie alternativa nella produzione di energia rinnovabile grazie alle sue caratteristiche fisiologiche. La crescita è stata monitorata attraverso conteggio cellulare, consumo di nutrienti, misurazione del peso secco e dell’efficienza fotosintetica; la composizione molecolare è stata quantificata analizzando il contenuto di polisaccaridi, proteine e lipidi delle cellule. Dapprima è stato eseguito uno screening preliminare di cinque fitormoni a concentrazioni diverse, allo scopo di selezionare lo stimolante biochimico con maggior effetto. Selezionato l’ormone, si è poi proceduto ad allestire colture batch, in cui il composto, l’auxina acido fenilacetico, è stato aggiunto alla concentrazione prescelta e successivamente, avvalendosi dell’utilizzo di due fotobioreattori colonnari, è stato valutato l’effetto dell’ormone selezionato in un sistema di coltura semicontinuo, ipotizzando una coltivazione industriale su larga scala.

Valutazione del coinvolgimento dell'oncogene c-myc e dei trasportatori abc nella farmacoresistenza dell'osteosarcoma ad alto grado

L’insorgenza di fenomeni coinvolti nello sviluppo della farmacoresistenza costituisce al momento la principale causa di mancata risposta al trattamento chemioterapico nell’osteosarcoma. Questo è in parte dovuto ad una sovraespressione di diversi trasportatori ABC nelle cellule tumorali che causano un aumento dell’efflusso extracellulare del chemioterapico e pertanto una ridotta risposta al trattamento farmacologico. L'oncogene C-MYC è coinvolto nella resistenza al metothrexate, alla doxorubicina e al cisplatino ed è un fattore prognostico avverso, se sovraespresso al momento della diagnosi, in pazienti affetti da osteosarcoma. C-MYC è in grado di regolare l'espressione di diversi trasportatori ABC, probabilmente coinvolti nella resistenza ai farmaci nell’osteosarcoma, e questo potrebbe spiegare l’impatto prognostico avverso dell’oncogene in questo tumore. L’espressione genica di C-MYC e di 16 trasportatori ABC, regolati da C-MYC e / o responsabili dell'efflusso di diversi chemioterapici, è stata valutata su due diverse casistiche cliniche e su un pannello di linee cellulari di osteosarcoma umano mediante real-time PCR. L'espressione della proteina è stata valutata per i 9 trasportatori ABC risultati più rilevanti.Infine l'efficacia in vitro di un inibitore, specifico per ABCB1 e ABCC1, è stata valutata su linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 e ABCC1 sono i trasportatori più espressi nelle linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 è sovraespresso al momento della diagnosi in circa il 40-45% dei pazienti affetti da osteosarcoma e si conferma essere un fattore prognostico avverso se sovraespresso al momento della diagnosi. Pertanto ABCB1 diventa il bersaglio di elezione per lo sviluppo di strategie terapeutiche alternative, nel trattamento dell’osteosarcoma, atte al superamento della farmacoresistenza. L’inibizione dell'attività di tale trasportatore causa un aumento della sensibilità al trattamento chemioterapico nelle linee cellulari di osteosarcoma farmacoresistenti, indicando questo approccio come una possibile strategia per superare il problema della mancata risposta al trattamento farmacologico nei pazienti con osteosarcoma che sovraesprimono ABCB1.

Ruolo delle alterazioni mitocondriali indotte dall'ipossia nella patogenesi della malattia di alzheimer

Le alterazioni della funzionalità mitocondriale detengono un ruolo cruciale nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD), sostenendo il processo neurodegenerativo attraverso meccanismi quali la riduzione della disponibilità energetica e la iperproduzione di ROS. Alle numerose ipotesi di patogenesi dell’AD, si è recentemente affiancata la cosiddetta ipotesi vascolare. Nei soggetti AD è stata riscontrata una significativa riduzione della disponibilità di ossigeno a livello neuronale (ipossia neuronale). Da numerosi studi è poi emerso che l’ipossia gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dell’AD contribuendo a più vie patogenetiche contemporaneamente. Tuttavia, non sono stati ancora chiariti tutti i meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno. Lo scopo di questo studio è stato quello di contribuire a chiarire il ruolo patologico dell’ipossia nell’AD, analizzando principalmente le alterazioni della funzionalità mitocondriale indotte dalla riduzione della disponibilità di ossigeno. Nella prima fase dello studio cellule PC12 sono state coltivate in presenza di β-amiloide e ipossia. In questo modello abbiamo osservato un potenziamento dei fenomeni di deplezione dell’ATP e di generazione delle ROS indotti dalla Aβ quando anche l’ipossia era presente come fonte di danno cellulare, ipotizzando per i due fattori un effetto congiunto di tipo additivo. Nella seconda fase abbiamo esposto all’ipossia fibroblasti prelevati da pazienti AD portatori di mutazioni a carico dei geni APP e PSEN. La presenza di mutazioni predisponenti ad un fenotipo AD era in grado di determinare un danno bioenergetico e ossidativo. Le alterazioni bioenergetiche riscontrate in normossia risultavano ulteriormente potenziate quando i fibroblasti erano coltivati in ipossia, mentre lo stato di stress ossidativo veniva evidenziato solo in condizioni ipossiche. Sulla base dei risultati finora conseguiti si può ipotizzare che uno dei meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno nella AD, possa essere dovuto alla capacità di potenziare ulteriormente le alterazioni della funzionalità mitocondriale.

Caratteristiche anatomiche del corpo genicolato mediale nel tursiope (Tursiops truncatus).

La conoscenza del sistema nervoso centrale dei Cetacei si limita alla morfologia esterna, mentre la storia evolutiva, invece, è ben documentata. Il sistema nervoso centrale, che funziona da interfaccia tra il corpo dell’animale e l’ambiente circostante, integra le informazioni afferenti in una reazione adatta alla sopravvivenza dell’individuo. L’aumento o la diminuzione delle aree cerebrali dipende dall’implicazione funzionale che esse hanno per l’organismo e, nel tursiope, quelle particolarmente sviluppate sono connesse alla trasmissione ed elaborazione delle informazioni acustiche comprendendo le cortecce acustiche, il pulvinar, il nucleo genicolato mediale, il collicolo caudale ed alcuni nuclei pontini. Esse sono basilari per la sopravvivenza nell’ ambiente acquatico. Questo studio si è occupato di delineare le caratteristiche citoarchitettoniche (con riferimento alla morfologia ed alle dimensioni dei neuroni) e l'espressione della calbindina-D28k del corpo genicolato mediale, importante centro di integrazione delle informazioni acustiche. Le sue caratteristiche morfofunzionali sono state studiate soprattutto nei Roditori, nei Carnivori e nei Primati, ed è emersa la presenza di tre aree citoarchitettoniche: nucleo dorsale (MGd), nucleo ventrale (MGv) e nucleo mediale (MGm). Nel tursiope, in base alla densità di distribuzione dei neuroni, si possono evidenziare, invece, due nuclei principali: il ventro-laterale ed il dorso-mediale. Nel primo nucleo i neuroni presenti appaiono più densamente stipati che nel secondo. Nel corpo genicolato mediale di tursiope, come nei Chirotteri, le cellule calbindina-D28k-immunoreattive sono distribuite in maniera diffusa ed uniforme. Tali cellule ricevono informazioni modulatorie afferenti soprattutto dalla corteccia cerebrale; di conseguenza è possibile ipotizzare come le infomazioni modulatorie che dalla neocorteccia si portano al corpo genicolato mediale non terminino in aree specifiche, come accade in molti Mammiferi terrestri, ma si distribuiscano in maniera diffusa a tutto il corpo. Tale caratteristica anatomica potrebbe indicare la presenza di un maggior controllo modulatorio, eventualmente correlato al fenomeno dell’ecolocazione, operato dalla corteccia cerebrale sul corpo genicolato mediale.

Ciclo riproduttivo annuale del corallo solitario Caryophyllia inornata (Scleractinia, Caryophylliidae) caratterizzato da un inusuale modello di embriogenesi

La varietà dei processi riproduttivi dei coralli riflette la loro straordinaria abilità rigenerativa. Le scleractinie sono un noto esempio di animali clonali, che possono esibire una strategia mista di riproduzione sessuale e asessuale per mantenere la loro popolazione. Questo studio descrive per la prima volta il ciclo riproduttivo annuale e l’embriogenesi del corallo temperato Caryophyllia inornata. I campioni sono stati raccolti mediante immersioni subacquee dal relitto di un aereo, a largo delle coste dell’Isola d’Elba. Sono state eseguite analisi citometriche per definire lo sviluppo annuale delle cellule germinali e l’embriogenesi. Caryophyllia inornata è risultata gonocorica con una sex ratio di 1:3.3 a favore dei maschi. I polipi erano sessualmente maturi a 7 mm di lunghezza. Lo sviluppo degli embrioni è stato osservato in maschi, femmine ed individui sessualmente inattivi. Gli spermiari richiedevano circa 10 mesi di maturazione, mentre l’ovogenesi sembrava essere più rapida. I polipi femmina sono stati trovati solo da Febbraio a Luglio. Il tasso di sviluppo gonadico aumentava sensibilmente da Marzo a Maggio e la fecondazione avveniva tra Maggio e Luglio, quando le cellule germinali all’interno dei polipi iniziavano a scomparire. La gametogenesi ha mostrato una forte influenza stagionale mentre gli embrioni sono stati trovati durante tutto l’anno nei maschi e negli individui sessualmente inattivi, non presentando un andamento ben definito. Questo modello di embriogenesi è poco comune ed è stato osservato solo in quattro scleractinie tropicali (Pocillopora damicornis, Tubastrea Diaphana, T. coccinea e Oulastrea crispata) in cui avviene una produzione interna di embrioni per via agamica. La natura precisa di questo processo è ancora sconosciuta.

Segmentazione di immagini mammografiche con convolutional neural networks

Il tumore al seno si colloca al primo posto per livello di mortalità tra le patologie tumorali che colpiscono la popolazione femminile mondiale. Diversi studi clinici hanno dimostrato come la diagnosi da parte del radiologo possa essere aiutata e migliorata dai sistemi di Computer Aided Detection (CAD). A causa della grande variabilità di forma e dimensioni delle masse tumorali e della somiglianza di queste con i tessuti che le ospitano, la loro ricerca automatizzata è un problema estremamente complicato. Un sistema di CAD è generalmente composto da due livelli di classificazione: la detection, responsabile dell’individuazione delle regioni sospette presenti sul mammogramma (ROI) e quindi dell’eliminazione preventiva delle zone non a rischio; la classificazione vera e propria (classification) delle ROI in masse e tessuto sano. Lo scopo principale di questa tesi è lo studio di nuove metodologie di detection che possano migliorare le prestazioni ottenute con le tecniche tradizionali. Si considera la detection come un problema di apprendimento supervisionato e lo si affronta mediante le Convolutional Neural Networks (CNN), un algoritmo appartenente al deep learning, nuova branca del machine learning. Le CNN si ispirano alle scoperte di Hubel e Wiesel riguardanti due tipi base di cellule identificate nella corteccia visiva dei gatti: le cellule semplici (S), che rispondono a stimoli simili ai bordi, e le cellule complesse (C) che sono localmente invarianti all’esatta posizione dello stimolo. In analogia con la corteccia visiva, le CNN utilizzano un’architettura profonda caratterizzata da strati che eseguono sulle immagini, alternativamente, operazioni di convoluzione e subsampling. Le CNN, che hanno un input bidimensionale, vengono solitamente usate per problemi di classificazione e riconoscimento automatico di immagini quali oggetti, facce e loghi o per l’analisi di documenti.

Analisi fosfo-proteomica di campioni di tumore: il problema della stratificazione dei pazienti ed eterogeneità intra-tumorale nell'era della terapia personalizzata

Nella presente tesi indaghiamo la potenzialità di LCM e Reverse Phase Protein microarray negli studi clinici. Si analizza la possibilità di creare una bio banca con line cellular primarie, al fine di conseguire drug test di sensibilità prima di decidere il trattamento da somministrare ai singoli pazienti. Sono stati ottenuti profili proteomici da biopsie pre e post terapia. I risultati dimostrano che questa piattaforma mostra il meccanismo di resistenza acquisito durante la terapia biologica. Questo ci ha portato ad analizzare una possibile stratificazione per pazienti con mCRC . I dati hanno rivelato distinti pathway di attivazione tra metastasi resecabile e non resecabili. I risultati mostrano inoltre due potenziali bersagli farmacologici. Ma la valutazione dell'intero tumore tramite singole biopsie sembra essere un problema a causa dell’eterogeneità intratumorale a livello genomico. Abbiamo indagato questo problema a livello dell'architettura del segnale in campioni di mCRC e ccRCC . I risultati indicano una somiglianza complessiva nei profili proteomici all'interno dello stesso tumore. Considerando che una singola biopsia è rappresentativa di un intera lesione , abbiamo studiato la possibilità di creare linee di cellule primarie, per valutare il profilo molecolare di ogni paziente. Fino ad oggi non c'era un protocollo per creare linee cellulari immortalizzate senza alcuna variazione genetica . abbiamo cosiderato, però, l'approccio innovativo delle CRCs. Ad oggi , non è ancora chiaro se tali cellule mimino il profilo dei tessuti oppure I passaggi in vitro modifichino i loro pathways . Sulla base di un modello di topo , i nostri dati mostrano un profilo di proteomica simile tra le linee di cellule e tessuti di topo LCM. In conclusione, i nostri dati dimostrano l'utilità della piattaforma LCM / RPPA nella sperimentazione clinica e la possibilità di creare una bio - banca di linee cellulari primarie, per migliorare la decisione del trattamento.

Drugs down-regulating E2F-1 expression hinders cell proliferation through a p53-indipendent mechanism

E2F-1 is a transcription factor that plays a key role in cell-cycle control at G1/S check-point level by regulating the timely expression of many target genes whose products are required for S phase entry and progression. In mammalian cells, E2F-1 is negatively regulated by hypo-phosphorylated Retinoblastoma protein (pRb) whereas it is protected against degradation by its binding to Mouse Double Minute 2 protein (MDM2). In this study we experimented a drug combination in order to obtain a strong down-regulation of E2F-1 by acting on two different mechanisms of E2F-1 regulation mentioned above. This was achieved by combining drugs inhibiting the phosphorylation of pRb with drugs inactivating the MDM2 binding capability. The mechanism of action of these drugs in down-regulating E2F-1 level and activity is p53 independent. As expected, when combined, these drugs strongly inhibits E2F-1 and hinder cell proliferation in p53-/- and p53-mutated cells by blocking them in G1 phase of cell cycle, suggesting that E2F-1 down-regulation may represent a valid chemotherapeutic approach to inhibit proliferation in tumors independently of p53 status.

Pharmacological screening and biotecnological production of alkaloids from tissues and cells cultured by plants of the Amaryllidaceae family.

In this work particular attention was given to the study of secondary metabolites produced by some plants belonging to the Amaryllidaceae family, in the specific case isoquinoline alkaloids. At the first instance were characterized both qualitatively and quantitatively three different plants belonging to Amaryllidaceae family, such as: Crinum angustum Steud., Pancratium illyricum L., and Leucojum nicaeense Ard. The alkaloids extracts obtained were separately tested against enzymes involved in specific diseases or liable in multifactorial pathologies, like: MMPs, AChE,and PPO. From leaves extract of P.illyricum was isolated a new compound, 11α-hydroxy-O-methylleucotamine, with important role in AChE inbition. Considering the protection role against external bodies carried out by these metabolites in plant, extracts were also assayed against ATCC microorganisms and clinical isolates. Plants with promising pharmacological activities have been the basis for development of in vitro plant models.

Studio delle citochine nella distrofia muscolare di Emery-Dreifuss: Possibili marker patogenetici e bersagli di cura della malattia

La distrofia muscolare di Emery-Dreifuss (EDMD) è una miopatia degenerativa ereditaria caratterizzata da debolezza e atrofia dei muscoli senza coinvolgimento del sistema nervoso. Individui EDMD presentano, inoltre, cardiomiopatia con difetto di conduzione che provoca rischio di morte improvvisa. Diversi studi evidenziano un coinvolgimento di citochine in diverse distrofie muscolari causanti infiammazione cronica, riassorbimento osseo, necrosi cellulare. Abbiamo effettuato una valutazione simultanea della concentrazione di citochine, chemochine, fattori di crescita, presenti nel siero di un gruppo di 25 pazienti EDMD. L’analisi effettuata ha evidenziato un aumento di citochine quali IL-17, TGFβ2, INF-γ e del TGFβ1. Inoltre, una riduzione del fattore di crescita VEGF e della chemochina RANTES è stata rilevata nel siero dei pazienti EDMD rispetto ai pazienti controllo. Ulteriori analisi effettuate tramite saggio ELISA hanno evidenziato un aumento dei livelli di TGFβ2 e IL-6 nel terreno di coltura di fibroblasti EDMD2. Per testare l’effetto nei muscoli, di citochine alterate, abbiamo utilizzato terreno condizionante di fibroblasti EDMD per differenziare mioblasti murini C2C12. Una riduzione del grado di differenziamento è stata osservata nei mioblasti condizionati con terreno EDMD. Trattando queste cellule con anticorpi neutralizzanti contro TGFβ2 e IL-6 si è avuto un miglioramento del grado di differenziamento. In C2C12 che esprimevano la mutazione H222P del gene Lmna,non sono state osservate alterazioni di citochine e benefici di anticorpi neutralizzanti. I dati mostrano un effetto patogenetico delle citochine alterate come osservato in fibroblasti e siero di pazienti, suggerendo un effetto sul tessuto fibrotico di muscoli EDMD. Un effetto intrinseco alla mutazione della lamina A è stato rilevato sul espressione di caveolina 3 in mioblasti differenziati EDMD. I risultati si aggiungono a dati forniti sulla patogenesi dell' EDMD confermando che fattori intrinseci ed estrinseci contribuiscono alla malattia. Utilizzo di anticorpi neutralizzanti specifici contro fattori estrinseci potrebbe rappresentare un approccio terapeutico come mostrato in questo studio.

Caratterizzazione e ruolo di PKCε e PKCδ in modelli di differenziamento megacariocitario normale e patologico

La PKCε e la PKCδ, chinasi ubiquitariamente distribuite e ad azione pleiotropica, sono implicate del differenziamento, sopravvivenza e proliferazione cellulare. Esse sono coinvolte nel processo differenziativo delle cellule staminali ematopoietiche e in fenomeni patologici associati al compartimento sanguigno. In questa tesi sono presentati i risultati riguardanti lo studio in vitro del ruolo di PKCε e PKCδ nel contesto del differenziamento megacariocitario, in particolare si caratterizza l’espressione e la funzione di queste chinasi nel modello umano e nel modello murino di Megacariocitopoiesi, normale e patologica. Confrontando le cinetiche dei due modelli presi in analisi nello studio è stato possibile osservare come in entrambi PKCε e PKCδ dimostrino avere una chiara e specifica modulazione nel progredire del processo differenziativo. Questi dati, se confrontati, permettono di affermare che PKCε e PKCδ presentano un pattern di espressione opposto e, nel modello umano rispetto a quello murino, reciproco: nell’uomo i livelli di PKCε devono essere down-modulati, mentre nel topo, al contrario, i livelli della chinasi risultano up-modulati durante lo stesso processo. Analogamente, le CD34+ in differenziazione presentano una costante e maggiore espressione di PKCδ durante la maturazione MK, mentre nel modello murino tale proteina risulta down-modulata nella fase più tardiva di formazione della piastrina. Le chinasi mostrano in oltre di agire, nei due modelli, attraverso pathways distinti e cioè RhoA nel topo e Bcl-xL nell’uomo. È stato inoltre verificato che l’aberrante differenziamento MK osservato nella mielofibrosi primaria (PMF), è associato a difetti di espressione di PKCε e di Bcl-xL e che una forzata down-modulazione di PKCε porta ad un ripristino di un normale livello di espressione di Bcl-xL così come della popolazione di megacariociti formanti propiastrine. I dati ottenuti indicano quindi che PKCε e PKCδ svolgono un ruolo importante nel corretto differenziamento MK e che PKCε potrebbe essere un potenziale nuovo target terapeutico nelle PMF.

Histone deacetylase inhibitors in adult patients with diffuse large b-cell lymphoma relapsed/refractory: a phase II study with Panobinostat

Backgrounds:Treatment of patients with relapsed/refractory (R/R) diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) not eligible to high dose therapy represents an unmet medical need. Panobinostat showed encouraging therapeutic activity in studies conducted in lymphoma cell lines and in vivo in patients with advanced hematologic malignancies.Purpose:FIL-PanAL10 (NCT01523834) is a phase II, prospective multicenter trial of the Fondazione Italiana Linfomi (FIL) to evaluate safety and efficacy of single agent Panobinostat as salvage therapy for R/R DLBCL patients and to evaluate a possible relationships between response and any biological features. Patients and Methods:Patients with R/R DLBCL were included. The treatment plan included 6 induction courses with Panobinostat monotherapy followed by other 6 courses of consolidation. The primary objective was to evaluate Panobinostat activity in terms of overall response (OR); secondary objectives were: CR rate, time to response (TTR), progression-free survival (PFS), safety and feasibility of Panobinostat. We included evaluation of the impact of pharmacogenetics, immunohistochemical patterns and patient’s specific gene expression and mutations as potential predictors of response to Panobinostat as explorative objectives. To this aim a pre-enrollment new tissue biopsy was mandatory. ResultsThirty-five patients, 21 males (60%), were enrolled between June 2011 and March 2014. At the end of induction phase, 7 responses (20%) were observed, including 4 CR (11%), while 28 patients (80%) discontinued treatment due to progressive disease (PD) in 21 (60%) or adverse events in 7 (20%). Median TTR in 9 responders was 2.6 months (range 1.8-12). With a median follow up of 6 months (range 1-34), the estimated 12 months PFS and OS were 27% and 30.5%, respectively. Grade 3-4 thrombocytopenia and neutropenia were the most common toxicities (in 29 (83%) and 12 (34%) patients, respectively. Conclusions The results of this study indicate that Panobinostat might be remarkably active in some patients with R/R DLBCL, showing durable CR

Monitoring the extracellular matrix mineralization processes in biological scaffolds using bioreactors, x-ray μct technology and 3-d modeling methods (monitoraggio dei processi di mineralizzazione della matrice extracellulare in scaffolds biologici, utilizzando bioreattore, tecnologia μct a raggi x e metodi di modellizzazione 3d)

Al fine di migliorare le tecniche di coltura cellulare in vitro, sistemi a bioreattore sono sempre maggiormente utilizzati, e.g. ingegnerizzazione del tessuto osseo. Spinner Flasks, bioreattori rotanti e sistemi a perfusione di flusso sono oggi utilizzati e ogni sistema ha vantaggi e svantaggi. Questo lavoro descrive lo sviluppo di un semplice bioreattore a perfusione ed i risultati della metodologia di valutazione impiegata, basata su analisi μCT a raggi-X e tecniche di modellizzazione 3D. Un semplice bioreattore con generatore di flusso ad elica è stato progettato e costruito con l'obiettivo di migliorare la differenziazione di cellule staminali mesenchimali, provenienti da embrioni umani (HES-MP); le cellule sono state seminate su scaffold porosi di titanio che garantiscono una migliore adesione della matrice mineralizzata. Attraverso un microcontrollore e un'interfaccia grafica, il bioreattore genera tre tipi di flusso: in avanti (senso orario), indietro (senso antiorario) e una modalità a impulsi (avanti e indietro). Un semplice modello è stato realizzato per stimare la pressione generata dal flusso negli scaffolds (3•10-2 Pa). Sono stati comparati tre scaffolds in coltura statica e tre all’interno del bioreattore. Questi sono stati incubati per 21 giorni, fissati in paraformaldehyde (4% w/v) e sono stati soggetti ad acquisizione attraverso μCT a raggi-X. Le immagini ottenute sono state poi elaborate mediante un software di imaging 3D; è stato effettuato un sezionamento “virtuale” degli scaffolds, al fine di ottenere la distribuzione del gradiente dei valori di grigio di campioni estratti dalla superficie e dall’interno di essi. Tale distribuzione serve per distinguere le varie componenti presenti nelle immagini; in questo caso gli scaffolds dall’ipotetica matrice cellulare. I risultati mostrano che sia sulla superficie che internamente agli scaffolds, mantenuti nel bioreattore, è presente una maggiore densità dei gradienti dei valori di grigio ciò suggerisce un migliore deposito della matrice mineralizzata. Gli insegnamenti provenienti dalla realizzazione di questo bioreattore saranno utilizzati per progettare una nuova versione che renderà possibile l’analisi di più di 20 scaffolds contemporaneamente, permettendo un’ulteriore analisi della qualità della differenziazione usando metodologie molecolari ed istochimiche.

Modelli matematici di potenziale d'azione atriale umano e analisi degli effetti di malattie genetiche aritmogene.

Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è quello di sviluppare il primo modello matematico di potenziale d'azione pacemaker umano: è vero che gli studi elettrofisiologici pubblicati sull'uomo non hanno ancora raggiunto la mole di risultati ottenuti, invece, sugli altri mammiferi da laboratorio, ma i tempi possono ritenersi "maturi", in quanto i dati disponibili in letteratura sono sufficienti e adeguati allo scopo. Il secondo obiettivo di questo lavoro di tesi nasce direttamente dall'esigenza clinica di definire le relazioni causa-effetto tra la mutazione T78M della proteina caveolina-3 e le varie forme di aritmie cardiache riscontrate, ad essa associate. Lo scopo è quello di stabilire quale sia il link tra genotipo della mutazione e fenotipo risultante, ovvero colmare il gap esistente tra i dati sperimentali in vitro in possesso ed i meccanismi di alterazione delle correnti ioniche affette, per arrivare a osservare l'effetto che ne deriva sull'attività elettrica delle cellule. Proprio in relazione a quest'ultimo punto, i due obiettivi del lavoro convergono: l'analisi degli effetti indotti dalla mutazione T78M è, infatti, effettuata sul modello di potenziale d'azione di nodo senoatriale umano sviluppato (oltre che su altri modelli atriali).

Patogenesi molecolare delle osteomieliti associate all'impianto

L’osteomielite associata all’impianto è un processo infettivo a carico del tessuto osseo spesso accompagnato dalla distruzione dell’osso stesso. La patogenesi delle osteomieliti associate all’impianto si basa su due concetti fondamentali: l’internalizzazione del patogeno all’interno degli osteoblasti e la capacità dei batteri di formare il biofilm. Entrambi i meccanismi consentono infatti di prevenire l’eliminazione del batterio da parte delle difese immunitarie dell’ospite e di ostacolare l’azione della maggior parte degli antibiotici (che non penetrano e non agiscono pertanto su microrganismi intracellulari), così sostenendo ed alimentando l’infezione. Il saggio di invasione messo a punto su micropiastra ha consentito di investigare in modo approfondito e dettagliato il ruolo ed il peso dell’internalizzazione nella patogenesi delle infezioni ortopediche peri-protesiche causate da S. aureus, S. epidermidis, S. lugdunensis ed E. faecalis. Lo studio ha evidenziato che l’invasione delle cellule MG-63 non rappresenta un meccanismo patogenetico delle infezioni ortopediche associate all’impianto causate da S. epidermidis, S. lugdunensis ed E. faecalis; al contrario, in S. aureus la spiccata capacità invasiva rappresenta un’abile strategia patogenetica che consente al patogeno di sfuggire alla terapia sistemica e alla risposta immunitaria dell’ospite. È stato studiato inoltre il ruolo dell’immunità innata nella difesa contro il biofilm batterico. In seguito all’incubazione del biofilm opsonizzato di S. epidermidis con i PMN è stato possibile osservare la formazione delle NETs. Le NETs rappresentano ottime armi nella difesa contro il biofilm batterico, infatti le trappole sono in grado di limitare la diffusione batterica e quindi di confinare l’infezione. La comprensione del ruolo dell’internalizzazione nella patogenesi delle osteomieliti associate all’impianto e lo studio della risposta immunitaria innata a questo tipo di infezioni, spesso caratterizzate dalla presenza di biofilm, sono presupposti per identificare e affinare le migliori strategie terapeutiche necessarie ad eradicare l'infezione.