Intracellular targeting of GLUT4 in transfected insulinoma cells: evidence for association with constitutively recycling vesicles distinct from synaptophysin and insulin vesicles.

In adipocytes and muscle cells, the GLUT4 glucose transporter isoform is present in intracellular vesicles which continuously recycle between an intracytoplasmic location and the plasma membrane. It is not clear whether the GLUT4-vesicles represent a specific kind of vesicle or resemble typical secretory granules or synaptic-like microvesicles. To approach this question, we expressed GLUT4 in the beta cell line RINm5F and determined its intracellular localization by subcellular fractionation and by immunofluorescence and immunoelectron microscopy. GLUT4 was not found in insulin granules but was associated with a subpopulation of smooth-surface vesicles present in the trans-Golgi region and in vesicular structures adjacent to the plasma membrane. In the trans-Golgi region, GLUT4 did not colocalize with synaptophysin or TGN38. Incubation of the cells with horseradish peroxidase (HRP) led to colocalization of HRP and GLUT4 in some endosomal structures adjacent to the plasma membrane and in occasional trans-Golgi region vesicles. When cells were incubated in the presence of Bafilomycin A, analysis by confocal microscopy revealed GLUT4 in numerous large spots present throughout the cytoplasm, many of which costained for TGN38 and synaptophysin. By immunoelectron microscopy, numerous endosomes were observed which stained strongly for GLUT4. Together our data demonstrate that ectopic expression of GLUT4 in insulinoma cells reveals the presence of a subset of vesicular structures distinct from synaptic-like vesicles and insulin secretory granules. Furthermore, they indicate that GLUT4 constitutively recycles between the plasma membrane and its intracellular location by an endocytic route also taken by TGN38 and synaptophysin.

Cuticular defects lead to full immunity to a major plant pathogen.

In addition to its role as a barrier, the cuticle is also a source of signals perceived by invading fungi. Cuticular breakdown products have been shown previously to be potent inducers of cutinase or developmental processes in fungal pathogens. Here the question was addressed as to whether plants themselves can perceive modifications of the cuticle. This was studied using Arabidopsis thaliana plants with altered cuticular structure. The expression of a cell wall-targeted fungal cutinase in A. thaliana was found to provide total immunity to Botrytis cinerea. The response observed in such cutinase-expressing plants is independent of signal transduction pathways involving salicylic acid, ethylene or jasmonic acid. It is accompanied by the release of a fungitoxic activity and increased expression of members of the lipid transfer protein, peroxidase and protein inhibitor gene families that provide resistance when overexpressed in wild-type plants. The same experiments were made in the bodyguard (bdg) mutant of A. thaliana. This mutant exhibits cuticular defects and remained free of symptoms after inoculation with B. cinerea. The expression of resistance was accompanied by the release of a fungitoxic activity and increased expression of the same genes as observed in cutinase-expressing plants. Structural defects of the cuticle can thus be converted into an effective multi-factorial defence, and reveal a hitherto hidden aspect of the innate immune response of plants.

Etileno e peróxido de hidrogênio na formação de aerênquima em milho tolerante a alagamento intermitente

Resumo:O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do etileno e do peróxido de hidrogênio (H2O2) na formação do aerênquima em ciclos de seleção genética da cultivar de milho BRS 4154, sob alagamento. Plantas dos ciclos C1 e C18 foram submetidas a alagamento por 7 dias, com coleta das raízes aos 0 (controle, sem alagamento), 1 e 7 dias. Foram analisados: a expressão gênica das enzimas ACC sintase (ACS), ACC oxidase (ACO), dismutase do superóxido (SOD) e peroxidase do ascorbato (APX); a produção de etileno e o conteúdo de H2O2; a atividade da enzima ACO; e a proporção de aerênquima no córtex. Não houve expressão de ACS e ACO. Houve variação na atividade de ACO e na produção de etileno. A expressão da SOD foi maior em plantas C1 e a da APX, em C18, com redução aos 7 dias. O conteúdo de H2O2 não diferiu entre os tratamentos. A proporção de aerênquima aumentou com o tempo, tendo sido maior em plantas C18 e relacionada à taxa de formação do aerênquima. O tempo de alagamento e o nível de tolerância do ciclo de seleção influenciam a produção do etileno. A expressão da APX indica maior produção de H2O2 no início do alagamento.

Ensimmäisen ja toisen sukupolven nestemäisten liikennebiopolttoaineiden kasvihuonekaasupäästöjenvertailu

Elinkaariarviointia voidaan käyttää ensimmäisen ja toisensukupolven nestemäisten liikennebiopolttoaineiden kasvihuonekaasupäästöjen ja primäärienergian kulutuksen vertailuun. Elinkaariarviointia käyttämällä pyritään tuottamaan luotettavaa tietoa koko elinkaaren ajalta. Nestemäisiä liikennebiopolttoaineita käsittelevissä tutkimuksissa elinkaari jaetaan yleensä kahteen osaan,joista suurempi painoarvo on elinkaaren alkuosalla. Tässä diplomityössä tehdään yksinkertaistettu elinkaariarviointi selluloosaetanolin ja Fischer-Tropsch-dieselin elinkaaren alkuosalle ja verrataan niitä sitten ohraetanoliin ja rypsimetyyliesteriin. Tässä työssä keskitytään primäärienergian kulutukseen sekä hiilidioksidi-, metaani- ja dityppioksidipäästöihin. Selluloosaetanolin raaka-aineena tarkasteltiin ruokohelpeä, Fischer-Tropsch-dieselin raaka-aineena metsätähdettä. Diplomityö osoitti, että toisen sukupolven nestemäisten liikennebiopolttoaineiden tuotannossa kuluu vähemmän primäärienergiaa ja syntyy vähemmän kasvihuonekaasupäästöjä kuin ensimmäisen sukupolven nestemäisten liikennebiopolttoaineiden tuotannossa. Sama tulos on saatu myös muissa aihetta käsittelevissä tutkimuksissa.

AVALIAÇÃO DA COMPATIBILIDADE DA ENXERTIA EM Prunus sp.

A atividade de peroxidase e concentração de fenóis foi determinada com o objetivo de se avaliar aspectos de compatibilidade entre porta-enxertos e enxertos. As amostras foram processadas e obtidas a partir da casca e lenho dos porta-enxertos de pessegueiros (GF 677, Okinawa, Capdeboscq e Aldrighi) e de ameixeiras (Mirabolano e Marianna), enxertados ou não com as cultivares Diamante, Eldorado e Santa Rosa. Concluiu-se que a atividade de peroxidase e a concentração de fenóis foram relacionadas com união entre enxerto e porta-enxerto, particularmente, em Marianna e Mirabolano, onde a atividade de peroxidase e a concentração de fenóis foram mais elevados. A cultivar Santa Rosa foi compatível tanto com os porta-enxertos de ameixeiras quanto com os de pessegueiros.

Aparência, compostos fenólicos e enzimas oxidativas em uva 'Itália' sob influência do cálcio e do armazenamento refrigerado

O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito da aplicação pré-colheita de cálcio na aparência (secamento do engaço, danos mecânicos e podridões), teor de fenólicos e enzimas oxidativas (polifenoloxidase e peroxidase) em uva. Os cachos de uva 'Itália' de um cultivo comercial em Petrolina, Pernambuco, Brasil, foram marcados e imersos por 10 segundos, em soluções de Ca a 0 e 1,5%, na forma de cloreto de cálcio, aos 57 dias após o início da formação dos frutos (quando as bagas começaram a mudar de cor e amolecer). Após a colheita, os frutos foram armazenados a 3,5±0,2°C e 93±6% UR e avaliados aos 0; 14; 28; 42; 56 e 70 dias. Houve um incremento no secamento do engaço, no aparecimento de sintomas de danos mecânicos e de podridões nas bagas com o tempo de armazenamento. A aplicação de cálcio reduziu a atividade de polifenoloxidase e, conseqüentemente, os sintomas de danos mecânicos, resultando numa melhor aparência. A vida útil das uvas foi de aproximadamente 56 dias, quando sintomas de senescência, podridões e o nível dos sintomas de danos mecânicos começaram a aumentar de forma significativa.

Efeito da "mancha-chocolate" nas características físico-químicas e químicas de frutos de abacaxizeiro-'Pérola'

A "mancha-chocolate" constitui-se de um novo problema surgido na cultura do abacaxi, cuja causa não foi ainda determinada. Caracteriza-se pelo escurecimento da polpa, tornando o fruto impróprio para a comercialização. A proposta desse trabalho foi caracterizar as transformações físico-químicas e químicas que ocorrem em um fruto afetado pela "mancha-chocolate" a fim de subsidiar futuras pesquisas. Estudaram-se frutos da cultivar Pérola, provenientes de Miranorte'- Tocantins, em quatro estádios de maturação (estádio 1- verde; estádios 2 e 3 -- intermediários; e o estádio 4- maduro). Todos os frutos foram cortados no sentido vertical, sendo posteriormente efetuada uma avaliação visual das lesões decorrentes da "mancha-chocolate", separando-se frutos afetados e aparentemente sadios. Os frutos afetados foram separados em três categorias: frutos com manchas fracas (MF), frutos com manchas moderadas (MM) e frutos com manchas intensas (MI) . Foram feitas as seguintes avaliações: teores de compostos fenólicos, polifenoloxidase, peroxidase, vitamina C, acidez titulável, sólidos solúveis, pH, açúcares totais, redutores e não redutores. Verificou-se que os sintomas da "mancha-chocolate" se intensificaram nos frutos mais maduros e caracterizavam-se por apresentar um aumento acentuado no teor de compostos fenólicos e maiores atividades para as enzimas polifenoloxidase e peroxidase, o que conferiu ao problema um distúrbio de natureza fisiológica. Menores teores de vitamina C e de açúcares totais também foram observados nos frutos com manchas severas, quando comparados aos frutos com manchas fracas e os aparentemente sadios.

Proteins influencing foam formation in wine and beer: the role of yeast

This review focuses on the role of proteins in the production and maintenance of foam in both sparkling wines and beer. The quality of the foam in beer but especially in sparkling wines depends, among other factors, on the presence of mannoproteins released from the yeast cell walls during autolysis. These proteins are hydrophobic, highly glycosylated, and their molecular masses range from 10 to 200 kDa characteristics that allow mannoproteins to surround and thus stabilize the gas bubbles of the foam. Both the production and stabilization of foam also depend on other proteins. In wine, these include grape-derived proteins such as vacuolar invertase; in beer, barley-derived proteins, such as LTP1, protein Z, and hordein-derived polypeptides, are even more important in this respect than mannoproteins

The blood-brain barrier: cellular basis.

Perfusion experiments with horseradish peroxidase have established that the morphological substrate of the blood-brain barrier is represented by microvascular endothelial cells. They are characterized by complexly arranged tight junctions and a very low rate of transcytotic vesicular transport. They express transport enzymes, carrier systems and brain endothelial cell-specific molecules of unknown function not expressed by any other endothelial cell population. These blood-brain barrier properties are not intrinsic to these cells but are inducible by the surrounding brain tissue. Type I astrocytes injected into the anterior eye chamber of the rat or onto the chick chorioallantoic membrane are able to induce a host-derived angiogenesis and some blood-brain barrier properties in endothelial cells of non-neural origin. Recently we have shown that this cellular interaction is due to the secretion of a soluble astrocyte derived factor(s). Astrocytes are also implicated in the maintenance, functional regulation and the repair of the blood-brain barrier. Complex interactions between other constituents of the microenvironment surrounding the endothelial cells, such as the basement membrane, pericytes, nerve endings, microglial cells and the extracellular fluid, take place and are required for the proper functioning of the blood-brain barrier, which in addition is regionally different as reflected by endothelial cell heterogeneity.

Alterações pós-colheita da "fruta-de-lobo" (Solanum lycocarpum St. Hil.) durante o amadurecimento: análises físico-químicas, químicas e enzimáticas

Estudaram-se, neste trabalho, algumas modificações físico-químicas, químicas e enzimáticas, em pós-colheita, durante o amadurecimento da fruta-de-lobo, comparando-as com as de outros frutos. Os frutos colhidos de plantas nativas no início do estádio de amadurecimento foram selecionados e armazenados durante 18 dias à temperatura ambiente (17,1 a 26,9ºC). Os frutos foram lavados com água destilada, descascados, picados, congelados em nitrogênio líquido e liofilizados até massa constante. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições de 3 frutos. Os valores de pH e acidez titulável não variaram estatisticamente durante o amadurecimento. A atividade de amilase e os teores de amido diminuíram gradativamente com o aumento dos açúcares solúveis totais e não redutores, enquanto os teores dos redutores se mantiveram constantes. Os teores de pectinas totais e solúveis diminuíram, enquanto a atividade de pectinametilesterase manteve-se constante. As atividades das enzimas poligalacturonase e polimetilgalacturonase não foram detectadas no fruto. Observou-se diminuição dos teores de polifenóis e das atividades das enzimas peroxidase e polifenoloxidase e conseqüente diminuição do escurecimento da polpa do fruto.

Stable carbon isotopes in archaeobotanical remains and palaeoclimate

Es descriu una metodologia recent per a inferir la precipitació en el passat basada en l’anàlisi de la composició isotòpica del carboni (δ13C) en restes arqueobotàniques. Un cop descrita la base fisiològica de la tècnica, s’il·lustra l’aplicabilitat de δ13C mitjançant un exemple referent al NE peninsular. Hom pretén proporcionar una estimació quantitativa de l’evolució de la precipitació estacional (primavera) i anual al llarg dels darrers quatre mil anys basada en δ13C. Les mostres analitzades comprenen carbons (pi blanc) i llavors carbonitzades (blat i ordi), i s’obtenen estimes pluviomètriques superiors en el passat que actualment, amb una tendència gradual cap a condicions progressivament més àrides. No obstant això, aquesta tendència no esdevé uniforme, i es detecten dues fases de major precipitació (1800-900 aC; 300 aC - 300 dC) alternadament amb períodes relativament secs (900-300 aC; 900 dC - present). Dels resultats presentats també es desprèn que la importància relativa de la pluja primaveral en el passat fou variable. Des d’aproximadament el 300 aC en endavant, el període primaveral subministrà una major proporció de pluja anual que actualment. Contràriament, durant el període 1800-800 dC la seva contribució va esdevenir inferior, i va aparèixer una fase transitòria (800-300 aC) que mostra una recuperació sobtada en aportació primaveral. Posteriorment a aquesta fase la sincronia de canvis en δ13C en granes i carbons suggereix l’arribada del clima mediterrani a la regió.

Mangas minimamente processadas amadurecidas naturalmente ou com etileno e armazenadas em diferentes embalagens

Avaliaram-se produtos minimamente processados de mangas 'Tommy Atkins' amadurecidas naturalmente ou com etileno. Os frutos amadurecidos com aplicação de etileno foram colhidos no estádio "meio-maturo" (de vez) e tratados com etileno (1g.L-1) e mantidos em câmaras, por 12 horas, a 23-25ºC e 85-90% UR. Os frutos foram selecionados, lavados com detergente, sanitizados (200mg.L-1 de cloro) e armazenados por 12 horas, a 10ºC. Após este período, foram processados sob condições assépticas, a 12ºC, acondicionados em embalagem PET ou bandeja de poliestireno expandido recoberta por filme de PVC e armazenados a 3ºC. Foram avaliados, a cada 3 dias, a resistência e a coloração da polpa, os teores de ácido ascórbico, sólidos solúveis (SS), acidez titulável (AT), carboidratos solúveis, redutores e amido, relação SS/AT, pH e atividade da peroxidase. Durante o período de armazenamento, os pedaços de manga tornaram-se mais firmes e mantiveram-se amarelos, porém mais escurecidos, o que foi indicado por redução na luminosidade. Os teores de ácido ascórbico nos pedaços das mangas amadurecidas com etileno apresentaram-se menores que os das amadurecidas naturalmente. A acidez apresentou tendência de redução durante o armazenamento, com as amadurecidas com etileno apresentando os maiores valores e os menores pH. Os produtos de mangas amadurecidas com etileno apresentaram os maiores valores de SS, mas menor relação SS/AT, indicando gosto mais azedo. Os teores de carboidratos solúveis e de amido não apresentaram variação com tendência definida, mas os de carboidratos redutores apresentaram tendência de acréscimo, e a atividade da peroxidase, de decréscimo durante o armazenamento. Os produtos de mangas amadurecidas naturalmente foram superiores aos amadurecidos com etileno, mantendo boa qualidade e aparência adequada para a comercialização até o 13º dia, enquanto os das amadurecidas com etileno, por 11 dias.

Registro arqueobotánico de Cataluña occidental durante el II y I milenio a.n.e.

Se presenta una síntesis de los resultados obtenidos en los estudios de semillas y frutos realizados durante los últimos años en la Cataluña Occidental (especialmente en el llamado Llano Occidental Catalán) en yacimientos del II y I milenio a.n.e. Entre las plantas cultivadas destacan claramente los cereales, sobre todo la cebada vestida (Hordeum vulgare) y el trigo común/duro (Triticum aestivum/durum), con escasa presencia de leguminosas, siendo las más representadas la lenteja (Lens culinaris) y el guisante (Pisum sativum). Nuevos cultivos como los mijos (Panicum miliaceum y Setaria italica) o el lino (Linum usitatissimum) se detectan ya desde mediados del II milenio, mientras que otros como la avena (Avena sativa) se introducen en época ibérica. Se han recuperado también testimonios de recolección, como las bellotas (Quercus sp.) o la uva silvestre (Vitis vinifera ssp. sylvestris), así como de la vegetación arvense, principalmente el raygrás (Lolium sp.).

When cholesterol is not cholesterol: a note on the enzymatic determination of its concentration in model systems containing vegetable extracts

Background: Experimental evidences demonstrate that vegetable derived extracts inhibit cholesterol absorption in the gastrointestinal tract. To further explore the mechanisms behind, we modeled duodenal contents with several vegetable extracts. Results: By employing a widely used cholesterol quantification method based on a cholesterol oxidase-peroxidase coupled reaction we analyzed the effects on cholesterol partition. Evidenced interferences were analyzed by studying specific and unspecific inhibitors of cholesterol oxidase-peroxidase coupled reaction. Cholesterol was also quantified by LC/MS. We found a significant interference of diverse (cocoa and tea-derived) extracts over this method. The interference was strongly dependent on model matrix: while as in phosphate buffered saline, the development of unspecific fluorescence was inhibitable by catalase (but not by heat denaturation), suggesting vegetable extract derived H2O2 production, in bile-containing model systems, this interference also comprised cholesterol-oxidase inhibition. Several strategies, such as cholesterol standard addition and use of suitable blanks containing vegetable extracts were tested. When those failed, the use of a mass-spectrometry based chromatographic assay allowed quantification of cholesterol in models of duodenal contents in the presence of vegetable extracts. Conclusions: We propose that the use of cholesterol-oxidase and/or peroxidase based systems for cholesterol analyses in foodstuffs should be accurately monitored, as important interferences in all the components of the enzymatic chain were evident. The use of adequate controls, standard addition and finally, chromatographic analyses solve these issues.

Review. Characterization and selection of hexaploid wheats containing resistance to Heterodera avenae or Mayetiola destructor introgressed from Aegilops

Cereal cyst nematode (CCN, Heterodera avenae) and Hessian fly (HF, Mayetiola destructor) are two major pests affecting wheat crops worldwide including important cereal areas of Spain. Aegilops ventricosa and Ae. triuncialis were used as donors in a strategy to introduce resistance genes (RG) for these pests in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Two 42 chromosomes introgression lines have been derived from Ae. ventricosa: H-93-8 and H-93-33 carrying genes Cre2 and H27 conferring resistance to CCN and HF, respectively. Line TR-3531 with 42 chromosomes has been derived from Ae. triuncialis and carries RGs conferring resistance for CCN (Cre7) and for HF (H30). Alien material has been incorporated in lines H-93 by chromosomal substitution and recombination, while in line TR-3531 homoeologous recombination affecting small DNA fragments has played a major role. It has been demonstrated that Cre2, Cre7, H27 and H30 are major single dominant genes and not allelic of other previously described RGs. Biochemical and molecular-biology studies of the defense mechanism triggered by Cre2 and Cre7 have revealed specific induction of peroxidase and other antioxidant enzymes. In parallel to these basic studies advanced lines carrying resistance genes for CNN and/or HF have been developed. Selection was done using molecular markers for eventually «pyramiding» resistance genes. Several isozyme and RAPD markers have been described and, currently, new markers based on transposable elements and NBS-LRR sequences are being developed. At present, two advanced lines have already been included at the Spanish Catalogue of Commercial Plant Varieties.