Genetic association of SNPs in the FTO gene and predisposition to obesity in Malaysian Malays

The common variants in the fat mass- and obesity-associated (FTO) gene have been previously found to be associated with obesity in various adult populations. The objective of the present study was to investigate whether the single nucleotide polymorphisms (SNPs) and linkage disequilibrium (LD) blocks in various regions of the FTO gene are associated with predisposition to obesity in Malaysian Malays. Thirty-one FTO SNPs were genotyped in 587 (158 obese and 429 non-obese) Malaysian Malay subjects. Obesity traits and lipid profiles were measured and single-marker association testing, LD testing, and haplotype association analysis were performed. LD analysis of the FTO SNPs revealed the presence of 57 regions with complete LD (D’ = 1.0). In addition, we detected the association of rs17817288 with low-density lipoprotein cholesterol. The FTO gene may therefore be involved in lipid metabolism in Malaysian Malays. Two haplotype blocks were present in this region of the FTO gene, but no particular haplotype was found to be significantly associated with an increased risk of obesity in Malaysian Malays.

Effects of rosiglitazone on serum paraoxonase activity and metabolic parameters in patients with type 2 diabetes mellitus

Human serum paraoxonase contributes to the anti-atherogenic effect of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and has been shown to protect both low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and HDL-C against lipid peroxidation. We investigated the effects of rosiglitazone on paraoxonase activity and metabolic parameters in patients with type 2 diabetes mellitus [50 patients (30 males, 20 females); mean±SD age: 58.7±9.2 years, body mass index: 28.2±4.1'kg/m2], in whom glucose control could not be achieved despite treatment with metformin, sulphonylurea, and/or insulin. The patients were given 4'mg/day rosiglitazone for 3 months in addition to their usual treatment. Serum paraoxonase activity, malondialdehyde, homocysteine, and lipid profile were measured at the time of initiation and at the end of therapy with rosiglitazone. After rosiglitazone therapy, serum levels of HDL-C, apolipoprotein A-1, and paraoxonase activity increased significantly (P<0.05) and malondialdehyde, homocysteine, lipoprotein(a), and glucose levels decreased significantly (P<0.05), but no significant changes in levels of total cholesterol and apolipoprotein B were observed. Triglyceride levels also increased significantly (P<0.05). Rosiglitazone treatment led to an improvement in glycemic control and to an increase in paraoxonase activity and HDL-C levels. Although rosiglitazone showed favorable effects on oxidant/antioxidant balance and lipid profile, further studies are needed to determine the effect of rosiglitazone on cardiovascular risk factors and cardiovascular morbidity and mortality.

Ox-LDL increases OX40L in endothelial cells through a LOX-1-dependent mechanism

Oxidative low-density lipoprotein (Ox-LDL) is a key risk factor for the development of atherosclerosis, and it can stimulate the expression of a variety of inflammatory signals. As a new and highly sensitive inflammation index, OX40L may be a key to understanding the mechanisms that regulate interactions between cells within the vessel wall and inflammatory mediators during the development of atherosclerosis. To investigate whether Ox-LDL regulates OX40L expression through an oxidized LDL-1 receptor (LOX-1)-mediated mechanism, we investigated the effect of different concentrations of Ox-LDL (50, 100, 150 µg/mL) on endothelial cell proliferation and apoptosis. Stimulation with Ox-LDL increased OX40L protein 1.44-fold and mRNA 4.0-fold in endothelial cells, and these effects were inhibited by blocking LOX-1. These results indicate that LOX-1 plays an important role in the chronic inflammatory process in blood vessel walls. Inhibiting LOX-1 may reduce blood vessel inflammation and provide a therapeutic option to limit atherosclerosis progression.

Associations between CD36 gene polymorphisms and susceptibility to coronary artery heart disease

Associations between polymorphisms of the CD36 gene and susceptibility to coronary artery heart disease (CHD) are not clear. We assessed allele frequencies and genotype distributions of CD36 gene polymorphisms in 112 CHD patients and 129 control patients using semi-quantitative polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Additionally, we detected CD36 mRNA expression by real-time quantitative PCR, and we quantified plasma levels of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). There were no significant differences between the two groups (P>0.05) in allele frequencies of rs1761667 or in genotype distribution and allele frequencies of rs3173798. The genotype distribution of rs1761667 significantly differed between CHD patients and controls (P=0.034), with a significantly higher frequency of the AG genotype in the CHD group compared to the control group (P=0.011). The plasma levels of ox-LDL in patients with the AG genotype were remarkably higher than those with the GG and AA genotypes (P=0.010). In a randomized sample taken from patients in the two groups, the CD36 mRNA expression of the CHD patients was higher than that of the controls. In CHD patients, the CD36 mRNA expression in AG genotype patients was remarkably higher than in those with an AA genotype (P=0.005). After adjusted logistic regression analysis, the AG genotype of rs1761667 was associated with an increased risk of CHD (OR=2.337, 95% CI=1.336-4.087, P=0.003). In conclusion, the rs1761667 polymorphism may be closely associated with developing CHD in the Chongqing Han population of China, and an AG genotype may be a genetic susceptibility factor for CHD.

Peroxiredoxin isoforms are associated with cardiovascular risk factors in type 2 diabetes mellitus

The production of oxygen free radicals in type 2 diabetes mellitus contributes to the development of complications, especially the cardiovascular-related ones. Peroxiredoxins (PRDXs) are antioxidant enzymes that combat oxidative stress. The aim of this study was to investigate the associations between the levels of PRDX isoforms (1, 2, 4, and 6) and cardiovascular risk factors in type 2 diabetes mellitus. Fifty-three patients with type 2 diabetes mellitus (28F/25M) and 25 healthy control subjects (7F/18M) were enrolled. We measured the plasma levels of each PRDX isoform and analyzed their correlations with cardiovascular risk factors. The plasma PRDX1, -2, -4, and -6 levels were higher in the diabetic patients than in the healthy control subjects. PRDX2 and -6 levels were negatively correlated with diastolic blood pressure, fasting blood sugar, and hemoglobin A1c. In contrast, PRDX1 levels were positively correlated with low-density lipoprotein and C-reactive protein levels. PRDX4 levels were negatively correlated with triglycerides. In conclusion, PRDX1, -2, -4, and -6 showed differential correlations with a variety of traditional cardiovascular risk factors. These results should encourage further research into the crosstalk between PRDX isoforms and cardiovascular risk factors.

IGF2, LEPR, POMC, PPARG, and PPARGC1 gene variants are associated with obesity-related risk phenotypes in Brazilian children and adolescents

Association studies of genetic variants and obesity and/or obesity-related risk factors have yielded contradictory results. The aim of the present study was to determine the possible association of five single-nucleotide polymorphisms (SNPs) located in the IGF2, LEPR, POMC, PPARG, and PPARGC1genes with obesity or obesity-related risk phenotypes. This case-control study assessed overweight (n=192) and normal-weight (n=211) children and adolescents. The SNPs were analyzed using minisequencing assays, and variables and genotype distributions between the groups were compared using one-way analysis of variance and Pearson's chi-square or Fisher's exact tests. Logistic regression analysis adjusted for age and gender was used to calculate the odds ratios (ORs) for selected phenotype risks in each group. No difference in SNP distribution was observed between groups. In children, POMC rs28932472(C) was associated with lower diastolic blood pressure (P=0.001), higher low-density lipoprotein (LDL) cholesterol (P=0.014), and higher risk in overweight children of altered total cholesterol (OR=7.35, P=0.006). In adolescents, IGF2 rs680(A) was associated with higher glucose (P=0.012) and higher risk in overweight adolescents for altered insulin (OR=10.08, P=0.005) and homeostasis model of insulin resistance (HOMA-IR) (OR=6.34, P=0.010). PPARGrs1801282(G) conferred a higher risk of altered insulin (OR=12.31, P=0.003), and HOMA-IR (OR=7.47, P=0.005) in overweight adolescents. PARGC1 rs8192678(A) was associated with higher triacylglycerols (P=0.005), and LEPR rs1137101(A) was marginally associated with higher LDL cholesterol (P=0.017). LEPR rs1137101(A) conferred higher risk for altered insulin, and HOMA-IR in overweight adolescents. The associations observed in this population suggested increased risk for cardiovascular diseases and/or type 2 diabetes later in life for individuals carrying these alleles.

Cholesterol, cardiovascular disease and statin use in older persons

Older age increases the risk of developing a chronic atherosclerotic cardiovascular disease (CVD), such as coronary heart disease. Complications of CVDs, myocardial infarction or stroke often lead to loss of functional capacity or premature death. Dyslipidemia, high serum levels of total or low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c) and low levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-c), is among the most important modifiable risk factors for CVDs; it can be treated with lifestyle modifications, and with lipid-lowering drugs, primarily statins. In older persons, however, the association of cholesterol levels with cardiovascular and all-cause mortality has been inconsistent in previous studies. Furthermore, the beneficial effects of statins in older persons without previous CVD are still somewhat unclear, and older persons are more prone to adverse effects from statins. This thesis presents a prospective cohort study (TUVA), exploring associations of cholesterol levels with mortality and the changes in cholesterol levels of a 70-year-old population in long-term follow-up. Further, prevalence of CVDs, risk factors and preventive medication use in the TUVA cohort is compared with respective prevalences in another age-matched cohort (UTUVA) 20 years later in order to examine the changes in cardiovascular risk over time. Additionally, to evaluate statin use patterns among older persons, an observational register study was conducted covering the total Finnish population aged 70 and older during 2000-2008. Based on individual-level data retrieved from national health registries, the population was classified into low, moderate and high risk groups according to estimated CVD risk. The prevalence, incidence and persistence of statin use among the risk groups was then evaluated based upon yearly statin purchases tracked from the Prescription Register. The prospective cohort study demonstrated that low total cholesterol, LDL-c and HDL-c were associated with higher mortality in a cohort of home-dwelling 70-year-olds. However, after adjusting for traditional cardiovascular risk factors and cancer this association disappeared. Further, low total cholesterol seemed to be protective, whereas low HDL-c strongly predicted increased risk of CVD death. Cholesterol levels of those elderly who remained available for follow-up and were still home-dwelling at the age of 85 seemed to improve with advancing age. Compared to the TUVA cohort, the later born UTUVA cohort had less CVDs and their risk factors were better controlled, which was reflected in the higher use of preventive medications such as statins and antihypertensives. The register studies confirmed that statin use has increased significantly during 2000-2008 among older persons, especially among the oldest (80+) age groups and among those at high risk for cardiovascular events. Two-thirds of new statin users persisted with their use during the four years of follow-up; the most discontinuations were made during the first year of use. In conclusion, statins are commonly used among older age groups in Finland. Most of the older statin users had a high cardiovascular event risk, indicating that the treatment is well directed towards those who are likely to benefit from it the most. No age-limits should be put on the screening and treatment of dyslipidemia in older persons, but the benefits and adverse effects of statin treatment should be carefully weighed based on an individual assessment of the person’s general health status and functional capacity. Physicians should pay more attention to medication adherence, especially when prescribing preventive medications.

An exploratory study for the discovery of non-invasive hepatocellular carcinoma biomarkers among high-risk hepatitis C virus infected patients

Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a major healthcare problem, representing the third most common cause of cancer-related mortality worldwide. Chronic infections with Hepatitis B virus (HBV) and/or Hepatitis C virus (HCV) are the major risk factors for the development of HCC. The incidence of HBV -associated HCC is in decline as a result of an effective HBV vaccine; however, since an equally effective HCV vaccine has not yet been developed, there are 130 million HCV infected patients worldwide who are at a high-risk for developing HCC. Because reliable parameters and/or tools for the early detection of HCC among high-risk individuals are severely lacking, HCC patients are always diagnosed at a late stage where surgical solutions or effective treatment are not possible. Using urine as a non-invasive sample source, two different approaches (proteomic-based and genomic-based approaches) were pursued with the common goal of discovering potential biomarker candidates for the early detection of HCC among high-risk chronic HCV infected patients. Urine was collected from 106 HCV infected Egyptian patients, 32 of whom had already developed HCC and 74 patients who were diagnosed as HCC-free at the time of initial sample collection. In addition to these patients, urine samples were also collected from 12 healthy control individuals. Total urinary proteins, Trans-renal nucleic acid (Tr-NA) and microRNA (miRNA) were isolated from urine using novel methodologies and silicon carbide-loaded spin columns. In the first, "proteomic-based", approach, liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to identify potential candidates from pooled urine samples. This was followed by validating relative expression levels of proteins present in urine among all the patients using quantitative real time-PCR (qRT-PCR). This approach revealed that significant over-expression of three proteins: DJ-1, Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) and 11 Moemen Abdalla HCC Biomarkers Heat Shock Protein 60 (HSP60), were characteristic events among HCC-post HCV infected patients. As a single-based HCC biomarker, CAF-1 over-expression identified HCC among HCV infected patients with a specificity of 90%, sensitivity of 66% and with an overall diagnostic accuracy of 78%. Moreover, the CAF-lIHSP60 tandem identified HCC among HCV infected patients with a specificity of 92%, sensitivity of 61 % and with an overall diagnostic accuracy of 77%. In the second genomic-based approach, two different approaches were processed. The first approach was the miRNA-based approach. The expression levels of miRNAs isolated from urine were studied using the Illumina MicroRNA Expression Profiling Assay. This was followed by qRT-PCR-based validation of deregulated expression of identified miRNA candidates among all the patients. This approach shed the light on the deregulated expression of a number of miRNAs, which may have a role in either the development of HCC among HCV infected patients (i.e. miR-640, miR-765, miR-200a, miR-521 and miR-520) or may allow for a better understanding of the viral-host interaction (miR-152, miR-486, miR-219, miR452, miR-425, miR-154 and miR-31). Moreover, the deregulated expression of both miR-618 and miR-650 appeared to be a common event among HCC-post HCV infected patients. The results of the search for putative targets of these two miRNA suggested that miR-618 may be a potent oncogene, as it targets the tumor-suppressor gene Low density lipoprotein-related protein 12 (LPR12), while miR-650 may be a potent tumor-suppressor gene, as it is supposed to downregulate the TNF receptor-associated factor-4 (TRAF4) oncogene. The specificity of miR-618 and miR-650 deregulated expression patterns for the early detection of HCC among HCV infected patients was 68% and 58%, respectively, whereas the sensitivity was 64% and 72%, respectively. When the deregulated expression of both miRNAs was combined as a tandem biomarker, the specificity and the sensitivity were 75% and 58% respectively. 111 Moemen Abdalla HCC Biomarkers In the second, "Trans-renal nucleic acid-based", approach, the urinary apoptotic nucleic acid (uaNA) levels of 70ng/mL or more were found to be a good predictor of HCC among chronic HCV infected patients. The specificity and the sensitivity of this diagnostic approach were 76% and 86%, respectively, with an overall diagnostic value of 81 %. The uaNA levels positively correlated to HCC disease progression as monitored by epigenetic changes of a panel of eight tumor-suppressor genes (TSGs) using methylation-sensitive PCR. Moreover, the pairing of high uaNA levels (:::: 70 ng/mL) and CAF-1 over-expreSSIOn produced a highly specific (l 00%) multiple-based HCC biomarker with an acceptable sensitivity of 64%, and with a diagnostic accuracy of 82%. In comparison to the previous pairing, the uaNA levels (:::: 70 ng/mL) in tandem with HSP60 over-expression was less specific (89%) but highly sensitive (72%), resulting in a diagnostic accuracy of 64%. The specificities of miR-650 deregulated expression in combination with either high uaNA content or HSP 60 over-expression were 82% and 79%, respectively, whereas, the sensitivities of these combinations were 64% and 58%, respectively. The potential biomarkers identified in this study compare favorably with the diagnostic accuracy of the a-fetoprotein levels test, which has a specificity of 75%, sensitivity of 68% and an overall diagnostic accuracy of 70%. Here we present an intriguing study which shows the significance of using urine as a noninvasive sample source for the identification of promising HCC biomarkers. We have also introduced new techniques for the isolation of different urinary macromolecules, especially miRNA, from urine. Furthermore, we strongly recommend the potential biomarkers indentified in this study as focal points of any future research on HCC diagnosis. A larger testing pool will determine if their use is practical for mass population screening. This explorative study identified potential targets that merit further investigation for the development of diagnostically accurate biomarkers isolated from 1-2 mL urine samples that were acquired in a non-invasive manner.

The influence of recreational ball hockey play on cardiovascular risk factors in sedentary males

Introduction: The prevalence of coronary artery disease (CAD) is ever increasing in western industrialized societies. An individuals overall risk for CAD may be quantified by integrating a number of factors including, but not limited to, cardiorespiratory fitness, body composition, blood lipid profile and blood pressure. It might be expected that interventions aimed at improving any or all of these independent factors might improve an individual 's overall risk. To this end, the influence of standard endurance type exercise on cardiorespiratory fitness, body composition, blood lipids and blood pressure, and by extension the reduction of coronary risk factors, is well documented. On the other hand, interval training (IT) has been shown to provide an extremely powerful stimulus for improving indices of cardiorespiratory function but the influence of this training type on coronary risk factors is unknown. Moreover, the vast majority of studies investigating the effects of IT on fitness have used laboratory type training protocols. As a result of this, the influence of participation in interval-type recreational sports on cardiorespiratory fitness and coronary risk factors is unknown. Aims: The aim of the present study was to evaluate the effectiveness of recreational ball hockey, a sport associated with interval-type activity patterns, on indices of aerobic function and coronary risk factors in sedentary men in the approximate age range of 30 - 60 years. Individual risk factors were compiled into an overall coronary risk factor score using the Framingham Point Scale (FPS). Methods: Twenty-four sedentary males (age range 30 - 60) participated in the study. Subject activity level was assessed apriori using questionnaire responses. All subjects (experimental and control) were assessed to have been inactive and sedentary prior to participation in the study. The experimental group (43 ± 3 years; 90 ± 3 kg) (n = 11) participated in one season of recreational ball hockey (our surrogate for IT). Member of this group played a total of 16 games during an 11 week span. During this time, the control group (43 ± 2 years; 89 ± 2 kg) (n = 11) performed no training and continued with their sedentary lifestyle. Prior to and following the ball hockey season, experimental and control subjects were tested for the following variables: 1) cardiorespiratory fitness (as V02 Max) 2) blood lipid profile 3) body composition 5) waist to hip ratio 6) blood glucose levels and 7) blood pressure. Subject V02 Max was assessed using the Rockport submaximal walking test on an indoor track. To assess body composition we determined body mass ratio (BMI), % body fat, % lean body mass and waist to hip ratio. The blood lipid profile included high density lipoprotein, low density lipoprotein and total cholesterol levels; in addition, the ratio of total cholesterol to high density was calculated. Blood triglycerides were also assessed. All data were analyzed using independent t - tests and all data are expressed as mean ± standard error. Statistical significance was accepted at p :S 0.05. Results: Pre-test values for all variables were similar between the experimental and control group. Moreover, although the intervention used in this study was associated with changes in some variables for subjects in the experimental group, subjects in the control group did not exhibit any changes over the same time period. BODY COMPOSITION: The % body fat of experimental subjects decreased by 4.6 ± 0.5%, from 28.1 ± 2.6 to 26.9 ± 2.5 % while that of the control group was unchanged at 22.7 ± 1.4 and 22.2 ± 1.3 %. However, lean body mass of experimental and control subjects did not change at 64.3 ± 1.3 versus 66.1 ± 1.3 kg and 65.5 ± 0.8 versus 64.7 ± 0.8 kg, respectively. In terms of body mass index and waist to hip ratio, neither the experimental nor the control group showed any significant change. Respective values for the waist to hip ratio and body mass index (pre and post) were as follows: 1 ± 0.1 vs 0.9 ± 0.1 (experimental) and 0.9 ± 0.1 versus 0.9 ± 0.1 (controls) while for BMI they were 29 ± 1.4 versus 29 ± 1.2 (experimental) and 26 ± 0.7 vs. 26 ± 0.7 (controls). CARDIORESPIRATORY FITNESS: In the experimental group, predicted values for absolute V02 Max increased by 10 ± 3% (i.e. 3.3 ± 0.1 to 3.6 ± 0.1 liters min -1 while that of control subjects did not change (3.4 ± 0.2 and 3.4 ± 0.2 liters min-I). In terms of relative values for V02 Max, the experimental group increased by 11 ± 2% (37 ± 1.4 to 41 ± 1.4 ml kg-l min-I) while that of control subjects did not change (41 ± 1.4 and 40 ± 1.4 ml kg-l min-I). BLOOD LIPIDS: Compared to pre-test values, post-test values for HDL were decreased by 14 ± 5 % in the experiment group (from 52.4 ± 4.4 to 45.2 ± 4.3 mg dl-l) while HDL data for the control group was unchanged (49.7 ± 3.6 and 48.3 ± 4.1 mg dl-l, respectively. On the other hand, LDL levels did not change for either the experimental or control group (110.2 ± 10.4 versus 112.3 ± 7.1 mg dl-1 and 106.1 ± 11.3 versus 127 ± 15.1 mg dl-1, respectively). Further, total cholesterol did not change in either the experimental or control group (181.3 ± 8.7 mg dl-1 versus 178.7± 4.9 mg dl-l) and 190.7 ± 12.2 versus 197.1 ± 16.1 mg dl-1, respectively). Similarly, the ratio of TC/HDL did not change for either the experimental or control group (3.8 ± 0.4 versus 4.5 ± 0.5 and 4 ± 0.4 versus 4.2 ± 0.4, respectively). Blood triglyceride levels were also not altered in either the experimental or control group (100.3 ± 19.6 versus 114.8 ± 15.3 mg dl-1 and 140 ± 23.5 versus 137.3 ± 17.9 mg dl-l, respectively). BLOOD GLUCOSE: Fasted blood glucose levels did not change in either the experimental or control group. Pre- and post-values for experimental and control groups were 92.5 ± 4.8 versus 93.3 ± 4.3 mg dl-l and 92.3 ± 11.3 versus 93.2 ± 2.6 mg dl-1 , respectively. BLOOD PRESSURE: No aspect of blood pressure was altered in either the experimental or control group. For example, pre- and post-test systolic blood pressures were 131 ± 2 versus 129 ± 2 mmHg (experimental) and 123 ± 2 and 125 ± 2 mmHg (controls), respectively. Pre- and post-test diastolic blood pressures were 84 ± 2 and 83 ± 2 mmHg (experimental) and 81 ± 1 versus 82 ± 1 mmHg, respectively. Similarly, calculated pulse pressure was not altered in the experimental or control as pre- and post-test values were 47 ± 1 versus 47 ± 2 mmlHg and 42 ± 2 versus 43 ± 2 mmHg, respectively. FRAMINGHAM POINT SCORE: The concerted changes reported above produced an increased risk in the Framingham Point Score for the subjects in the experimental group. For example, the pre- and post-test FPS increased from 1.4 ± 0.9 to 2.7 ± 0.7. On the other hand, pre- and post-test scores for the control group were 1.8 ± 1 versus 1.8 ± 0.9. Conclusions: Our data confirms previous studies showing that interval-type exercise is a useful intervention for increasing aerobic fitness. Moreover, the increase in V02 Max we found in response to limited participation in ball hockey (i.e. 16 games) suggests that recreational sport may help reduce this aspect of coronary risk in previously sedentary individual. On the other hand, our results showing little or no positive change in body composition, blood lipids or blood pressures suggest that one season of recreational sport in not in of itself a powerful enough stimulus to reduce the overall risk of coronary artery disease. In light of this, it is recommended that, in addition to participation in recreational sport, the performance of regular physical activity is used as an adjunct to provide a more powerful overall stimulus for decreasing coronary risk factors. LIMITATIONS: The increase in the FPS we found for the experimental group, indicative of an increased risk for coronary disease, was largely due to the large decrease in HDL we observed after compared to above one season of ball hockey. In light of the fact that cardiorespiratory fitness was increased and % body fat was decreased, as well as the fact that other parameters such as blood pressure showed positive (but non statistically significant) trends, the possibility that the decrease in HDL showed by our data was anomalous should be considered. FUTURE DIRECTIONS: The results of this study suggesting that recreational sport may be a potentially useful intervention in the reduction of CAD require to be corroborated by future studies specifically employing 1) more rigorous assessment of fitness and fitness change and 2) more prolonged or frequent participants.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Rôle des Cellules Endothéliales Progénitrices dans la Régulation de la Fonction Plaquettaire

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.

Regulation of cholesterol intake by the corpus luteum

Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research.

La PCSK9 humaine, une molécule aux multiples facettes métaboliques et une cible thérapeutique prometteuse : études de régulation in vitro et in vivo

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire.