Evolution of Bioaffinity Reagents by Phage Display

Antibodies are natural binding proteins produced in vertebrates as a response to invading pathogens and foreign substances. Because of their capability for tight and specific binding, antibodies have found use as binding reagents in research and diagnostics. Properties of cloned recombinant antibodies can be further improved by means of in vitro evolution, combining mutagenesis with subsequent phage display selection. It is also possible to isolate entirely new antibodies from vast naïve or synthetic antibody libraries by phage display. In this study, library techniques and phage display selection were applied in order to optimise binding scaffolds and antigen recognition of antibodies, and to evolve new and improved bioaffinity reagents. Antibody libraries were generated by random and targeted mutagenesis. Expression and stability were mainly optimised by the random methods whereas targeted randomisation of the binding site residues was used for optimising the binding properties. Trinucleotide mutagenesis allowed design of defined randomisation patterns for a synthetic antibody library. Improved clones were selected by phage display. Capture by a specific anti- DHPS antibody was exploited in the selection of improved phage display of DHPS. Efficient selection for stability was established by combining phage display selection with denaturation under reducing conditions. Broad-specific binding of a generic anti-sulfonamide antibody was improved by selection with one of the weakest binding sulfonamides. In addition, p9 based phage display was studied in affinity selection from the synthetic library. A TIM barrel protein DHPS was engineered for efficient phage display by combining cysteinereplacement with random mutagenesis. The resulting clone allows use of phage display in further engineering of DHPS and possibly use as an alternative-binding scaffold. An anti-TSH scFv fragment, cloned from a monoclonal antibody, was engineered for improved stability to better suite an immunoassay. The improved scFv tolerates 8 – 9 °C higher temperature than the parental scFv and should have sufficient stability to be used in an immunoanalyser with incubation at 36 °C. The anti-TSH scFv fragment was compared with the corresponding Fab fragment and the parental monoclonal antibody as a capturing reagent in a rapid 5-min immunoassay for TSH. The scFv fragment provided some benefits over the conventionally used Mab in anayte-binding capacity and assay kinetics. However, the recombinant Fab fragment, which had similar kinetics to the scFv, provided a more sensitive and reliable assay than the scFv. Another cloned scFv fragment was engineered in order to improve broad-specific recognition of sulfonamides. The improved antibody detects different sulfonamides at concentrations below the maximum residue limit (100 μg/kg in EU and USA) and allows simultaneous screening of different sulfonamide drug residues. Finally, a synthetic antibody library was constructed and new antibodies were generated and affinity matured entirely in vitro. These results illuminate the possibilities of phage display and antibody engineering for generation and optimisation of binding reagents in vitro and indicate the potential of recombinant antibodies as affinity reagents in immunoassays.

Nematoides fitoparasitas em seringais do Estado de São Paulo

A seringueira, Hevea brasiliensis, é nativa da região Amazônica e a espécie mais importante do gênero. O estado de São Paulo é o maior produtor nacional com uma área plantada de cerca de 90.000 hectares. Por muito tempo as mudas de seringueira foram produzidas diretamente no solo ou em sacolas plásticas com substrato a base de terra de barranco sem tratamento, o que propiciou a disseminação de pragas e patógenos do sistema radicular. O objetivo do presente estudo foi determinar a incidência de fitonematoides em seringais do estado de São Paulo. Foi realizada a amostragem de 75 seringais distribuídos em 64 municípios do Estado, no período de 2011 e 2012. As amostragens foram realizadas em solo e raiz de seringais georreferenciados, com mais de oito anos de produção, formados com diferentes clones, com predominância do clone RRIM 600. As amostras foram acondicionadas em sacos plásticos, etiquetados e encaminhadas ao Laboratório de Nematologia da FCA/UNESP, Botucatu, SP, onde foram processadas para extração dos nematoides. Pratylenchus brachyurusfoi encontrado em 66% dos municípios amostrados. Nematoides do gênero Meloidogyne,tiveram ocorrência em 49,3% dos municípios. Os nematoides dos gêneros Rotylenchuluse Paratrichodorusforam detectados em 5,3% e 2,6% das amostras, respectivamente. Representantes da família Criconematidae foram encontrados em 1,3% dos seringais amostrados. De acordo com os resultados obtidos, observa-se que P. brachyuruse o gênero Meloidogynejá se encontram distribuidos na maioria dos cultivos de seringueira do estado, porém, em nível populacional relativamente baixo.

Colonização do xilema de eucalipto por Ceratocystis spp. isolado de diferentes hospedeiros

Ceratocystis sp. é um fungo que coloniza o xilema, agente causal de murcha e seca em diversas plantas lenhosas. O presente trabalho teve como objetivo acompanhar a colonização deste fungo na superfície de plantas de eucalipto (Eucalyptus sp.). Foram utilizados 5 isolados de Ceratocystis de diferentes hospedeiros (eucalipto, cacau, manga, teca e atemóia). Para isso, plantas de eucaliptos (clone 219) tiveram parte do seu sistema vascular exposto. Nesta região foi depositada uma suspensão contendo 106 esporos. Como testemunha, uma planta foi inoculada somente com água destilada autoclavada. Após a inoculação, estas plantas foram mantidas em câmara úmida a 25 oC no escuro. Parte da área inoculada foi coletada em intervalos de tempo pré-determinados (6, 12 e 24 horas), e fixadas em solução de "Karnovsky". As amostras foram preparadas e analisadas ao microscópio eletrônico de varredura. Todos os isolados foram capazes de germinar, penetrar e se desenvolver nos elementos de vasos de plantas de eucalipto no período de 6 horas. O isolado de cacau foi o que aparentemente teve o desenvolvimento mais lento dentro dos períodos estudados. Foi observada a germinação de ascósporos, clamidósporos e de conídios do tipo cilíndrico neste período. Doze horas após a inoculação ocorreu aumento da quantidade de micélio de todos os isolados testados. Nos casos dos isolados de manga e eucalipto foi possível observar a formação de novos clamidósporos. Vinte e quatro horas após a inoculação, com exceção do isolado de cacau, todos os outros isolados já apresentavam a formação de conidióforos cilíndricos. Este estudo comprova que isolados deste fungo, mesmo que provindos de outros hospedeiros, são capazes de se desenvolver no xilema do eucalipto.

Avaliação sazonal da produção de borracha e da dinâmica de carboidratos solúveis em plantas de seringueira (Heveabrasiliensis Müll. Arg.) cultivadas em Lavras, Minas Gerais

O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de látex de seringueira (Heveabrasiliensis) e as possíveis alterações no teor de carboidratos em função das variações de fatores climáticos. Foram utilizadas plantas do clone RRIM 600 com 8 anos de idade e no primeiro ano de exploração. As análises dos teores de açúcares solúveis totais e açúcares redutores foram realizadas em duas datas distintas, 29/8/97 (inverno) e 23/12/97 (verão), com amostragens em intervalos de 3 horas, em um ciclo de 24 horas de avaliação. A produção de borracha seca foi avaliada em duas sangrias, em cada estação. Os resultados evidenciaram que, além da relação da produção de borracha com a disponibilidade de água, as variações de temperatura entre as estações também tiveram uma importante influência sobre a disponibilidade de carboidratos para a síntese de látex.

Determinação do tempo ótimo do enraizamento de miniestacas de clones de Eucalyptus spp.

Foi feita uma análise temporal da curva de enraizamento de dois clones híbridos de eucalipto (C1 - E. grandis x E. urophylla; C2 - E. grandis x E. saligna), visando determinar o tempo ótimo de permanência dos propágulos vegetativos na casa de enraizamento, sob o ponto de vista técnico e do risco de incidência de doenças. Constatou-se que o tempo ótimo necessário para induzir a rizogênese depende do clone de eucalipto e que o conhecimento do modelo temporal pode fornecer subsídios ao gerenciamento de viveiros florestais. Além disso, foram estabelecidos dois critérios úteis para determinar o tempo ótimo de indução do enraizamento, sendo estes o intercepto da curva de incremento corrente diário (ICD) e incremento médio diário (IMD) e o tempo em que ocorre o máximo valor da velocidade de enraizamento. Para os clones 1 e 2, pelo critério do intercepto das curvas de ICD e IMD, 20 e 30 dias foram definidos como tempo ótimo, enquanto pelo critério de máxima velocidade de enraizamento os valores foram de 15 e 22 dias, respectivamente, sendo este último critério o mais indicado, levando-se em consideração o custo das instalações e o risco de incidência de doenças na propagação clonal do eucalipto.

Avaliação de resistência de clones de eucalipto às infecções naturais de Cryphonectria cubensis, com nova metodologia

Apresenta-se uma metodologia de avaliação de suscetibilidade ou resistência de clones de Eucalyptus grandis às infecções naturais da doença cancro, causado por Cryphonectria cubensis, no Estado do Amapá, com as árvores tendo cinco anos de idade. Os parâmetros usados relacionam-se, direta ou indiretamente, com a expressão dos mecanismos de defesa das árvores em nível de casca e lenho, quais sejam: a) freqüência de incidência da doença; b) freqüência de mortalidade por ela causada; e c) freqüência de lesões e de cancros, com os seus respectivos posicionamentos, se basais e altos, e os seus aprofundamentos ou superficialidades nos troncos, bem como os seus tamanhos, se pequenos ou grandes. Para cada genótipo calculou-se um índice de doença por infecções naturais (IDIN). Para facilitar as comparações entre os genótipos testados, o IDIN do clone mais suscetível foi dividido por um fator, de modo a deixá-lo igual a 100. Esse mesmo fator dividiu também os IDINs dos demais genótipos. Finalmente, os clones foram agrupados nas categorias AS (altamente suscetíveis), MS (moderadamente suscetíveis), MR (moderadamente suscetíveis) e AR (altamente resistentes ou imunes). Cada categoria agrupou genótipos cuja média de seus IDIN foi significativamente diferente da das demais, mediante o teste de contraste de médias.

Seleção precoce de clones de eucalipto para ambientes com disponibilidade diferenciada de água no solo: relações hídricas de plantas em tubetes

O presente trabalho objetivou identificar características em cinco clones de eucalipto crescendo em tubete plástico de 60 mL, de modo a subsidiar a seleção precoce de material genético para plantios em ambientes com disponibilidade diferenciada de água no solo. Avaliaram-se a condutância estomática, a transpiração foliar, o potencial hídrico foliar e a fotossíntese líquida de plantas mantidas plenamente irrigadas e de plantas sob deficiência hídrica. Com a suspensão da irrigação, os clones 1250 e 1260 apresentaram menor condutância estomática e transpiração, produzindo ligeira diminuição nos valores de potencial hídrico foliar nas plantas. Observaram-se uma acentuada redução no potencial hídrico e abscisão foliar nos clones 0321 e 1277, e, ao final de vários ciclos de seca, estes dois clones apresentaram as maiores taxas de fotossíntese líquida, em resposta à suspensão da irrigação. Com a re-irrigação, o clone 1277 emitiu, imediatamente, novas folhas, indicando sua capacidade de recuperação quando as condições hídricas do solo se tornam favoráveis. Esses resultados evidenciam que o clone 1277 deve tolerar ambientes sujeitos à deficiência hídrica.

Chapa aglomerada de cimento-madeira de Hevea brasiliensis Müll. Arg.

Chapas de partículas de cimento-madeira foram confeccionadas com a madeira de quatro clones de Hevea brasiliensis Müll. Arg. (seringueira): IAN 717, IAN 873, GT 711 e AVROS 1301. Confeccionaram-se as chapas na proporção de 1:4:1 (madeira:cimento:água) por peso e nas dimensões de 450 x 450 x 13 mm e densidade nominal de 1,4 g/cm³, com a adição de 4% de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O) como acelerador. Foram testadas partículas fervidas e não-fervidas dos quatro clones, totalizando oito tratamentos, sendo em cada um destes, com quatro repetições, avaliadas as propriedades mecânicas e físicas das chapas, segundo a norma ASTM D 1037 - 96a. De forma geral, os melhores resultados de propriedades físicas e mecânicas foram obtidos nas chapas com partículas do clone AVROS 1301. No teste de hidratação do cimento, a madeira de seringueira in natura foi classificada como de "inibição extrema", porém com a adição de CaCl2 o foi como de "baixa inibição". Essa madeira se mostrou tecnicamente viável à produção de chapas de cimento-madeira, independentemente do clone.

Classificação de clones de Eucalyptus sp visando à produção de polpa celulósica

Este trabalho objetivou classificar e selecionar clones de Eucalyptus sp, tendo em vista a qualidade das polpas kraft obtidas a partir de cada material. Os clones foram classificados quanto a rendimento depurado, viscosidade da polpa e álcali ativo usado no processo de polpação. A classificação dos clones foi realizada por meio da análise de agrupamento, utilizando-se o método de otimização de Tocher. A análise de agrupamento permitiu a separação dos clones em cinco grupos distintos, sendo encontrados grupos de clones com alto, médio e baixo potenciais para produção de polpa celulósica. As características que mais contribuíram para a divergência foram o rendimento depurado (58,1%) e a viscosidade da polpa celulósica (35,0%). Em geral, nos clones avaliados foram verificadas grandes variações com relação aos parâmetros estudados.

Caracterização tecnológica, para produção de celulose, da nova geração de clones de Eucalyptus do Brasil

Foram analisados clones de Eucalyptus de última geração, pertencentes às principais empresas brasileiras de celulose. Os estudos consistiram numa caracterização tecnológica detalhada da qualidade das madeiras utilizadas no processamento fabril das empresas. Foram realizadas análise químicas detalhadas das madeiras e cozimentos kraft, simulando-se uma das modernas técnica de digestor contínuo. Os resultados indicaram a alta qualidade dos clones de Eucalyptus atualmente plantados no Brasil para produção de celulose.

Efeito do manejo da entrelinha da seringueira sobre as propriedades químicas do solo, o estado nutricional e o crescimento

O trabalho teve por objetivo analisar a influência do manejo do solo da entrelinha da cultura da seringueira (Hevea brasiliensis) sobre as propriedades químicas do solo, o teor de nutrientes e o crescimento da seringueira. Para isso, implantou-se a seringueira (clones PB 235 e RRIM 701) em Latossolo Vermelho-Escuro, em 1992, no Município de Jaboticabal, SP. Os tratamentos consistiram do manejo da entrelinha com: grade, roçadeira e cultura de cobertura utilizando uma leguminosa kudzu tropical (Pueraria phaseoloides). Após oito anos, foram analisadas algumas propriedades químicas do solo (pH, M.O., H+Al, Ca+2, Mg+2, K+ e P) na entrelinha da cultura, bem como o teor de macro e micronutrientes e o crescimento da cultura em circunferência à altura do peito. Os diferentes manejos da entrelinha da cultura da seringueira afetaram todos os atributos químicos do solo da camada superficial (0-20 cm de profundidade) analisados. O manejo da entrelinha da seringueira com roçadeira mostrou-se importante no sistema solo-planta. A influência do manejo da entrelinha da seringueira na sua nutrição depende do clone utilizado no sistema de produção.

Crescimento de plantas de clones de Eucalyptus grandis [Hill ex Maiden] submetidas a diferentes tratamentos de desrama artificial, na região do cerrado

O crescimento em diâmetro à altura do peito (DAP), altura e volume foi avaliado em plantas de clone de Eucalyptus grandis, submetidas a diferentes intensidades de desrama artificial (altura de 1,0; 1,5; e 2,0 m a partir do solo) e idades de aplicação da primeira intervenção de desrama (20 e 28 meses de idade), em Abaeté, MG. A segunda intervenção de desrama em todos os tratamentos foi realizada aos 33 meses de idade, até atingir 3 m de altura do fuste da planta. Aos 40 meses de idade, observou-se que a desrama artificial não afetou, significativamente (p>0,05), o crescimento em DAP, altura e volume das plantas submetidas à primeira intervenção de desrama aos 20 meses, porém afetou o DAP e o volume quando a primeira intervenção foi realizada aos 28 meses de idade. Observou-se rápida recuperação da copa das plantas desse clone, independentemente do tratamento de desrama. Considerando não ter havido diferença entre tratamentos para o crescimento das plantas que tiveram a primeira intervenção aos 20 meses de idade e que os galhos vivos ainda apresentavam diâmetro reduzido e praticamente não existiam galhos mortos por ocasião da primeira intervenção nessa idade, recomenda-se a aplicação da desrama nesse clone, na região de cerrado, aproximadamente, aos 20 meses de idade, visando obter madeira de melhor qualidade para serraria.

Crescimento de mudas e produtividade de minijardins clonais de eucalipto tratados com rizobactérias selecionadas

O efeito de rizobactérias promotoras do crescimento foi avaliado sobre a produção de biomassa radicular, número de miniestacas por minicepa e produtividade de minijardins clonais (número de miniestacas x porcentagem de enraizamento) de eucalipto, em viveiro. Com exceção do clone 57, em todos os demais testados foi observado incremento da biomassa radicular, com média igual a 53, 52 e 69%, respectivamente, nos clones 129, 1274 e 7074. Em geral, verificaram-se diferenças significativas em produção de miniestacas, mas não no índice de produtividade. O isolado S1 destacou-se quanto à produção de miniestacas, com incrementos que variaram de 11 a 23% para os clones 129 e 1274, respectivamente. Para o clone 7074, o incremento médio foi de 15%. Os resultados indicam claramente que rizobactérias podem ser utilizadas para maximizar a propagação vegetativa do eucalipto, por estaquia.

Imazapyr root exudation from eucalypt seedlings cultivated in nutritive solution

Imazapyr has been used in Brazilian eucalypt cultivation for the maintenance of clearings and coppicing control in areas undergoing stand reform. However, inquiries have been made as to the final fate of the molecule. Imazapyr root exudation in eucalypt plants was evaluated through a bioassay under greenhouse conditions, by applying different herbicide doses (0.000, 0.375, 0.750, 1.125, and 1.500 kg ha-1 a.i.) on Eucalyptus grandis seedlings derived from vegetative propagation, hydroponically cultivated in 2.500 ml vases. Forty-day-old seedlings of the same clone were used as bioindicators, transplanted to the vases two days after herbicide application. After a period of 13 days of coexistence, the sprayed plants were removed and discarded; ten days later, the visual symptoms of toxicity were evaluated and the total dry biomass (aerial part and roots) of the bioindicators were determined. The lowest herbicide dose (0.375 kg ha-1 a.i.) affected the total biomass and growth, being most evident in the aerial part, with larger I50 for root dry biomass. The E. grandis seedlings exuded imazapyr, and/or its metabolites, in concentrations capable of affecting the growth of plants of the same species.

Critério técnico para determinação da idade ótima de mudas de eucalipto para plantio

Atualmente, a produção de mudas de Eucalyptus, em larga escala, é realizada pela miniestaquia, sob condições controladas. Todavia, ainda hoje não existe um critério técnico para determinar a idade ótima das mudas para plantio, o que pode refletir negativamente sobre a qualidade, sobretudo do sistema radicular, e, conseqüentemente, grandes perdas podem ocorrer no campo. Assim, o presente trabalho estabeleceu um critério técnico com base nas curvas de velocidade de crescimento e no intercepto entre as curvas de incremento corrente diário e incremento médio diário das variáveis altura, biomassa radicular e da parte aérea. Em virtude da restrição de volume explorável pelo sistema radicular, constataram-se reduções significativas na velocidade de crescimento das mudas que devem ser plantadas, preferencialmente, com 80 (clone A) a 100 (clone B) dias de idade, uma vez que mudas mais velhas sofrem redução na velocidade de crescimento e tendem a desenvolver problemas de malformação radicular. As implicações da baixa qualidade do sistema radicular residem na mortalidade de plantas, principalmente em períodos menos favoráveis, e na conseqüente influência na operação de replantio, bem como na realização dos testes clonais e na maior suscetibilidade das plantas aos estresses do ambiente.