Electrospun Polymeric Scaffolds with Enhanced Biomimetic Properties for Tissue Engineering Applications

This PhD Thesis is focused on the development of fibrous polymeric scaffolds for tissue engineering applications and on the improvement of scaffold biomimetic properties. Scaffolds were fabricated by electrospinning, which allows to obtain scaffolds made of polymeric micro or nanofibers. Biomimetism was enhanced by following two approaches: (1) the use of natural biopolymers, and (2) the modification of the fibers surface chemistry. Gelatin was chosen for its bioactive properties and cellular affinity, however it lacks in mechanical properties. This problem was overcome by adding poly(lactic acid) to the scaffold through co-electrospinning and mechanical properties of the composite constructs were assessed. Gelatin effectively improves cell growth and viability and worth noting, composite scaffolds of gelatin and poly(lactic acid) were more effective than a plain gelatin scaffold. Scaffolds made of pure collagen fibers were fabricated. Modification of collagen triple helix structure in electrospun collagen fibers was studied. Mechanical properties were evaluated before and after crosslinking. The crosslinking procedure was developed and optimized by using - for the first time on electrospun collagen fibers - the crosslinking reactant 1,4-butanediol diglycidyl ether, with good results in terms of fibers stabilization. Cell culture experiments showed good results in term of cell adhesion and morphology. The fiber surface chemistry of electrospun poly(lactic acid) scaffold was modified by plasma treatment. Plasma did not affect thermal and mechanical properties of the scaffold, while it greatly increased its hydrophilicity by the introduction of carboxyl groups at the fiber surface. This fiber functionalization enhanced the fibroblast cell viability and spreading. Surface modifications by chemical reactions were conducted on electrospun scaffolds made of a polysophorolipid. The aim was to introduce a biomolecule at the fiber surface. By developing a series of chemical reactions, one oligopeptide every three repeating units of polysophorolipid was grafted at the surface of electrospun fibers.

Computer aided design and finite element modeling to predict bulk mechanical properties of bone scaffolds using triply periodic minimal surfaces (progettazione assistita al calcolatore ed analisi con il metodo degli elementi finiti per predire il comportamento meccanico di scaffolds ossei creati con l'uso di superfici minime periodiche in tre direzioni)

The aim of Tissue Engineering is to develop biological substitutes that will restore lost morphological and functional features of diseased or damaged portions of organs. Recently computer-aided technology has received considerable attention in the area of tissue engineering and the advance of additive manufacture (AM) techniques has significantly improved control over the pore network architecture of tissue engineering scaffolds. To regenerate tissues more efficiently, an ideal scaffold should have appropriate porosity and pore structure. More sophisticated porous configurations with higher architectures of the pore network and scaffolding structures that mimic the intricate architecture and complexity of native organs and tissues are then required. This study adopts a macro-structural shape design approach to the production of open porous materials (Titanium foams), which utilizes spatial periodicity as a simple way to generate the models. From among various pore architectures which have been studied, this work simulated pore structure by triply-periodic minimal surfaces (TPMS) for the construction of tissue engineering scaffolds. TPMS are shown to be a versatile source of biomorphic scaffold design. A set of tissue scaffolds using the TPMS-based unit cell libraries was designed. TPMS-based Titanium foams were meant to be printed three dimensional with the relative predicted geometry, microstructure and consequently mechanical properties. Trough a finite element analysis (FEA) the mechanical properties of the designed scaffolds were determined in compression and analyzed in terms of their porosity and assemblies of unit cells. The purpose of this work was to investigate the mechanical performance of TPMS models trying to understand the best compromise between mechanical and geometrical requirements of the scaffolds. The intention was to predict the structural modulus in open porous materials via structural design of interconnected three-dimensional lattices, hence optimising geometrical properties. With the aid of FEA results, it is expected that the effective mechanical properties for the TPMS-based scaffold units can be used to design optimized scaffolds for tissue engineering applications. Regardless of the influence of fabrication method, it is desirable to calculate scaffold properties so that the effect of these properties on tissue regeneration may be better understood.

Monitoring the extracellular matrix mineralization processes in biological scaffolds using bioreactors, x-ray μct technology and 3-d modeling methods (monitoraggio dei processi di mineralizzazione della matrice extracellulare in scaffolds biologici, utilizzando bioreattore, tecnologia μct a raggi x e metodi di modellizzazione 3d)

Al fine di migliorare le tecniche di coltura cellulare in vitro, sistemi a bioreattore sono sempre maggiormente utilizzati, e.g. ingegnerizzazione del tessuto osseo. Spinner Flasks, bioreattori rotanti e sistemi a perfusione di flusso sono oggi utilizzati e ogni sistema ha vantaggi e svantaggi. Questo lavoro descrive lo sviluppo di un semplice bioreattore a perfusione ed i risultati della metodologia di valutazione impiegata, basata su analisi μCT a raggi-X e tecniche di modellizzazione 3D. Un semplice bioreattore con generatore di flusso ad elica è stato progettato e costruito con l'obiettivo di migliorare la differenziazione di cellule staminali mesenchimali, provenienti da embrioni umani (HES-MP); le cellule sono state seminate su scaffold porosi di titanio che garantiscono una migliore adesione della matrice mineralizzata. Attraverso un microcontrollore e un'interfaccia grafica, il bioreattore genera tre tipi di flusso: in avanti (senso orario), indietro (senso antiorario) e una modalità a impulsi (avanti e indietro). Un semplice modello è stato realizzato per stimare la pressione generata dal flusso negli scaffolds (3•10-2 Pa). Sono stati comparati tre scaffolds in coltura statica e tre all’interno del bioreattore. Questi sono stati incubati per 21 giorni, fissati in paraformaldehyde (4% w/v) e sono stati soggetti ad acquisizione attraverso μCT a raggi-X. Le immagini ottenute sono state poi elaborate mediante un software di imaging 3D; è stato effettuato un sezionamento “virtuale” degli scaffolds, al fine di ottenere la distribuzione del gradiente dei valori di grigio di campioni estratti dalla superficie e dall’interno di essi. Tale distribuzione serve per distinguere le varie componenti presenti nelle immagini; in questo caso gli scaffolds dall’ipotetica matrice cellulare. I risultati mostrano che sia sulla superficie che internamente agli scaffolds, mantenuti nel bioreattore, è presente una maggiore densità dei gradienti dei valori di grigio ciò suggerisce un migliore deposito della matrice mineralizzata. Gli insegnamenti provenienti dalla realizzazione di questo bioreattore saranno utilizzati per progettare una nuova versione che renderà possibile l’analisi di più di 20 scaffolds contemporaneamente, permettendo un’ulteriore analisi della qualità della differenziazione usando metodologie molecolari ed istochimiche.

Biomimetic Scaffolds for the Controlled Release of Bioactive Molecules for Tissue Engineering Applications

The temporospatial controlled delivery of growth factors is crucial to trigger the desired healing mechanisms in target tissues. The uncontrolled release of growth factors has been demonstrated to cause severe side effects in its surrounding tissues. Thus, the first working hypothesis was to tune and optimize a newly developed multiscale delivery platform based on a nanostructured silicon particle core (pSi) and a poly (dl-lactide-co-glycolide) acid (PLGA) outer shell. In a murine subcutaneous model, the platform was demonstrated to be fully tunable for the temporal and spatial control release of the payload. Secondly, a multiscale approach was followed in a multicompartment collagen scaffold, to selectively integrate different sets of PLGA-pSi loaded with different reporter proteins. The spatial confinement of the microspheres allowed the release of the reporter proteins in each of the layers of the scaffold. Finally, the staged and zero-order release kinetics enabled the temporal biochemical patterning of the scaffold. The last step of this PhD project was to test if by fully embedding PLGA microspheres in a highly structured and fibrous collagen-based scaffold (camouflaging), it was possible to prevent their early detection and clearance by macrophages. It was further studied whether such a camouflaging strategy was efficient in reducing the production of key inflammatory molecules, while preserving the release kinetics of the payload of the PLGA microspheres. Results demonstrated that the camouflaging allowed for a 10-fold decrease in the number of PLGA microspheres internalized by macrophages, suggesting that the 3D scaffold operated by cloaking the PLGA microspheres. When the production of key inflammatory cytokines induced by the scaffold was assessed, macrophages' response to the PLGA microspheres-integrated scaffolds resulted in a response similar to that observed in the control (not functionalized scaffold) and the release kinetic of a reporter protein was preserved.

Design methods and geometric modelling of scaffolds for bone tissue engineering

Every year, thousand of surgical treatments are performed in order to fix up or completely substitute, where possible, organs or tissues affected by degenerative diseases. Patients with these kind of illnesses stay long times waiting for a donor that could replace, in a short time, the damaged organ or the tissue. The lack of biological alternates, related to conventional surgical treatments as autografts, allografts, e xenografts, led the researchers belonging to different areas to collaborate to find out innovative solutions. This research brought to a new discipline able to merge molecular biology, biomaterial, engineering, biomechanics and, recently, design and architecture knowledges. This discipline is named Tissue Engineering (TE) and it represents a step forward towards the substitutive or regenerative medicine. One of the major challenge of the TE is to design and develop, using a biomimetic approach, an artificial 3D anatomy scaffold, suitable for cells adhesion that are able to proliferate and differentiate themselves as consequence of the biological and biophysical stimulus offered by the specific tissue to be replaced. Nowadays, powerful instruments allow to perform analysis day by day more accurateand defined on patients that need more precise diagnosis and treatments.Starting from patient specific information provided by TC (Computed Tomography) microCT and MRI(Magnetic Resonance Imaging), an image-based approach can be performed in order to reconstruct the site to be replaced. With the aid of the recent Additive Manufacturing techniques that allow to print tridimensional objects with sub millimetric precision, it is now possible to practice an almost complete control of the parametrical characteristics of the scaffold: this is the way to achieve a correct cellular regeneration. In this work, we focalize the attention on a branch of TE known as Bone TE, whose the bone is main subject. Bone TE combines osteoconductive and morphological aspects of the scaffold, whose main properties are pore diameter, structure porosity and interconnectivity. The realization of the ideal values of these parameters represents the main goal of this work: here we'll a create simple and interactive biomimetic design process based on 3D CAD modeling and generative algorithmsthat provide a way to control the main properties and to create a structure morphologically similar to the cancellous bone. Two different typologies of scaffold will be compared: the first is based on Triply Periodic MinimalSurface (T.P.M.S.) whose basic crystalline geometries are nowadays used for Bone TE scaffolding; the second is based on using Voronoi's diagrams and they are more often used in the design of decorations and jewellery for their capacity to decompose and tasselate a volumetric space using an heterogeneous spatial distribution (often frequent in nature). In this work, we will show how to manipulate the main properties (pore diameter, structure porosity and interconnectivity) of the design TE oriented scaffolding using the implementation of generative algorithms: "bringing back the nature to the nature".

Interaction between axial force, shear and bending moment in reinforced concrete elements

Il collasso di diverse colonne, caratterizzate da danneggiamenti simili, quali ampie fessure fortemente inclinate ad entrambe le estremità dell’elemento, lo schiacciamento del calcestruzzo e l’instabilità dei ferri longitudinali, ha portato ad interrogarsi riguardo gli effetti dell’interazione tra lo sforzo normale, il taglio ed il momento flettente. Lo studio è iniziato con una ricerca bibliografica che ha evidenziato una sostanziale carenza nella trattazione dell’argomento. Il problema è stato approcciato attraverso una ricerca di formule della scienza delle costruzioni, allo scopo di mettere in relazione lo sforzo assiale, il taglio ed il momento; la ricerca si è principalmente concentrata sulla teoria di Mohr. In un primo momento è stata considerata l’interazione tra solo due componenti di sollecitazione: sforzo assiale e taglio. L’analisi ha condotto alla costruzione di un dominio elastico di taglio e sforzo assiale che, confrontato con il dominio della Modified Compression Field Theory, trovata tramite ricerca bibliografica, ha permesso di concludere che i risultati sono assolutamente paragonabili. L’analisi si è poi orientata verso l’interazione tra sforzo assiale, taglio e momento flettente. Imponendo due criteri di rottura, il raggiungimento della resistenza a trazione ed a compressione del calcestruzzo, inserendo le componenti di sollecitazione tramite le formule di Navier e Jourawsky, sono state definite due formule che mettono in relazione le tre azioni e che, implementate nel software Matlab, hanno permesso la costruzione di un dominio tridimensionale. In questo caso non è stato possibile confrontare i risultati, non avendo la ricerca bibliografica mostrato niente di paragonabile. Lo studio si è poi concentrato sullo sviluppo di una procedura che tenta di analizzare il comportamento di una sezione sottoposta a sforzo normale, taglio e momento: è stato sviluppato un modello a fibre della sezione nel tentativo di condurre un calcolo non lineare, corrispondente ad una sequenza di analisi lineari. La procedura è stata applicata a casi reali di crollo, confermando l’avvenimento dei collassi.

Sintesi e caratterizzazione di macromolecole ramificate per la funzionalizzazione di scaffolds osteocondrali

L’osteoartrosi è la malattia delle articolazioni più comune al mondo ed è spesso causa di condizioni fortemente disabilitanti. Date le limitazioni dei trattamenti attualmente proposti per la gestione dei pazienti osteoartrosici è di grande interesse la ricerca di soluzioni alternative. A tal fine Fin-Ceramica S.p.A. desidera progettare un innovativo sostituto osteocondrale in collagene attivato con un’emergente classe di macromolecole polimeriche: i dendrimeri. Questi polimeri offrono un’unica opportunità di mostrare all’interfaccia con il tessuto naturale una pluralità di gruppi funzionali favorendo, con un’adeguata ingegnerizzazione, le interazioni biologiche e sostenendo la vitalità e l’attività cellulare. In questo lavoro di tesi, con in mente una futura convalida di processo necessaria a garantire la sicurezza e l’affidabilità del prodotto, sono stati sviluppati nuovi metodi per verificare ed ottimizzare la reazione di sintesi del dendrimero, per caratterizzare il materiale ottenuto e per creare legami covalenti fra collagene e dendrimero attivando potenzialmente il sostituto osteocondrale. Il primo obiettivo è stato conseguito sfruttando la presenza o l’assenza di gruppi amminici disponibili ai terminali del dendrimero in crescita e la formazione di un prodotto di scarto cromoforo durante la sintesi. In relazione a questi elementi sono stati individuati metodi semplici ed efficaci, quali la spettrofotometria ultravioletta ed i saggi colorimetrici con TNBS e ninidrina, per monitorare ogni step di reazione portandolo a compimento e ricavare i tempi necessari a tale scopo. Il dendrimero ottenuto è stato quindi caratterizzato tramite spettrometria infrarossa in trasformata di Fourier. Nota la composizione teorica della nostra macromolecola quest’analisi ha consentito l’identificazione del materiale prodotto ed ha inoltre permesso di dimostrare la ripetibilità dello specifico processo di sintesi dendrimerica. Infine per individuare una possibile procedura di funzionalizzazione del collagene con il dendrimero sono stati sperimentati due differenti metodi relativi a due diversi agenti crosslinkanti. Per rilevare un’eventuale modifica delle proprietà superficiali dei campioni realizzati, conseguente alla presenza dei dendrimeri, ne è stata valutata la bagnabilità attraverso la misura dell’angolo di contatto. La determinazione per uno dei due metodi di un significativo aumento di idrofilicità rispetto al campione di controllo ha verificato la fattibilità della reazione di funzionalizzazione del collagene con il dendrimero sintetizzato in questa ricerca identificando un possibile reagente ed una relativa procedura. I risultati ottenuti da queste ricerche costituiscono informazioni necessarie all’attività di convalida del processo di sintesi del dendrimero ed alla realizzazione del sostituto osteocondrale attivato progettato da Fin-Ceramica.

Nuovi copolimeri triblocco biodegradabili a base di PLA per imballaggi alimentari

Nella presente Tesi si procede alla preparazione e caratterizzazione di nuovi poliesteri alifatici a base di PLLA che offrano garanzie di completa biodegradabilità e presentino caratteristiche chimico/fisiche adeguate ad applicazioni nell’ambito dell’imballaggio alimentare. La modifica chimica del PLLA è stata realizzata per introduzione in catena di segmenti opportunamente sintetizzati che fungono da iniziatori nell’apertura dell’anello di lattide nella ROP. I copolimeri triblocco, poli(lattico)-block-poli(propilene/neopentil glicole succinato) PLLAnP(PS80NS20)m, si differenziano per il diverso rapporto in peso tra i due diversi tipi di blocco, quello hard di PLLA e quello soft di P(PS80NS20). I risultati ottenuti sono di rilevante interesse applicativo: i copolimeri presentano migliorate proprietà meccaniche rispetto al PLLA, una maggiore velocità di biodegradazione, senza che abbia avuto luogo un peggioramento della stabilità termica e delle proprietà barriera, addirittura migliore al gas test O2.

Application of crescent shaped braces for reinforced concrete structures

The work done is about the seismic analysis of an existing reinforced concrete structure that is equipped with a special bracing device. The main objective of the research is to provide a simple procedure that can be followed in order to design the lateral bracing system in such a way that the actual behavior of the structure matches the desired pre-defined objective curve. a great attention is devoted to the internal actions in the structural elements produced by the braces. The device used is called: Crescent shaped braces. This device is a special type of bracing because it has a banana-like geometry that allows the designer to have more control over the stiffness of the structure, especially under cyclic behavior, Unlike the conventional bracing that resists only through its axial stiffness. This device has been installed in a hospital in Italy. However, it has not been exposed to any ground motion so far. Different analysis methods, such as static pushover and dynamic time-history have been used in the analysis of the structure.

Experimental characterization of carbon-fiber-reinforced polymer laminates

The goal of this thesis is to make static tensile test on four Carbon Fiber Reinforced Polymer laminates, in such a way as to obtain the ultimate tensile strength of these laminates; in particular, the laminates analyzed were produced by Hand Lay-up technology. Testing these laminates we have a reference point on which to compare other laminates and in particular CFRP laminate produced by RTM technology.

Finite element modeling of flow/compression-induced deformation of alginate scaffolds for bone tissue engineering

Trauma or degenerative diseases such as osteonecrosis may determine bone loss whose recover is promised by a "tissue engineering“ approach. This strategy involves the use of stem cells, grown onboard of adequate biocompatible/bioreabsorbable hosting templates (usually defined as scaffolds) and cultured in specific dynamic environments afforded by differentiation-inducing actuators (usually defined as bioreactors) to produce implantable tissue constructs. The purpose of this thesis is to evaluate, by finite element modeling of flow/compression-induced deformation, alginate scaffolds intended for bone tissue engineering. This work was conducted at the Biomechanics Laboratory of the Institute of Biomedical and Neural Engineering of the Reykjavik University of Iceland. In this respect, Comsol Multiphysics 5.1 simulations were carried out to approximate the loads over alginate 3D matrices under perfusion, compression and perfusion+compression, when varyingalginate pore size and flow/compression regimen. The results of the simulations show that the shear forces in the matrix of the scaffold increase coherently with the increase in flow and load, and decrease with the increase of the pore size. Flow and load rates suggested for proper osteogenic cell differentiation are reported.

Stability of the tunnel face reinforced by bolts under seepage flow conditions

Il presente lavoro tratta la stabilità del fronte di scavo, rinforzato con barre di consolidamento ed interessato da drenaggi in avanzamento, di gallerie sotto falda in rocce tenere o terreni. Tale studio è stato sviluppato dal progetto di Tesi attraverso l’analisi all’equilibrio limite che approssima il fronte di scavo con un rettangolo e considera un meccanismo di rottura composto da un cuneo, a tergo del fronte, caricato da un prisma. Il metodo descritto consente di tenere conto dell’effetto stabilizzante delle barre, mediante una distribuzione della pressione di supporto non uniforme. Nel caso di gallerie sotto falda, lo stesso metodo permette inoltre di considerare l’effetto destabilizzante dei gradienti idraulici. Sono state ricavate soluzioni analitiche per la valutazione della stabilità, ed implementate successivamente nel software di analisi numerica MATLAB. Dalle analisi condotte è emerso che il numero minimo di barre per garantire la stabilità del fronte di scavo è in molti casi elevato e risulta impossibile da porre in opera in terreni scarsamente coesivi o in gallerie sotto elevati battenti d’acqua. Per risolvere questa situazione si può prevedere l’inserimento di drenaggi in avanzamento, con lo scopo di diminuire i gradienti idraulici nei pressi del fronte della galleria. Il modello che descrive il nuovo andamento dei carichi idraulici, considerando la presenza di dreni, è stato realizzato con il software commerciale agli elementi finiti COMSOL. Una volta determinati gli andamenti dei carichi idraulici, sono stati condotti studi parametrici sull’effetto dei dreni combinato con gli elementi di rinforzo. Dopo tali analisi sono stati ricavati nomogrammi adimensionali che tengano conto della presenza contemporanea delle barre e dei dreni. Tali diagrammi costituiscono uno strumento utile e valido per la progettazione del rinforzo del fronte di scavo. Infine sono stati realizzati confronti fra casi di studio reali e risultati ottenuti dal modello.

Teeth restored using fiber-reinforced posts: in vitro fracture tests and finite element analysis

In dentistry the restoration of decayed teeth is challenging and makes great demands on both the dentist and the materials. Hence, fiber-reinforced posts have been introduced. The effects of different variables on the ultimate load on teeth restored using fiber-reinforced posts is controversial, maybe because the results are mostly based on non-standardized in vitro tests and, therefore, give inhomogeneous results. This study combines the advantages of in vitro tests and finite element analysis (FEA) to clarify the effects of ferrule height, post length and cementation technique used for restoration. Sixty-four single rooted premolars were decoronated (ferrule height 1 or 2 mm), endodontically treated and restored using fiber posts (length 2 or 7 mm), composite fillings and metal crowns (resin bonded or cemented). After thermocycling and chewing simulation the samples were loaded until fracture, recording first damage events. Using UNIANOVA to analyze recorded fracture loads, ferrule height and cementation technique were found to be significant, i.e. increased ferrule height and resin bonding of the crown resulted in higher fracture loads. Post length had no significant effect. All conventionally cemented crowns with a 1-mm ferrule height failed during artificial ageing, in contrast to resin-bonded crowns (75% survival rate). FEA confirmed these results and provided information about stress and force distribution within the restoration. Based on the findings of in vitro tests and computations we concluded that crowns, especially those with a small ferrule height, should be resin bonded. Finally, centrally positioned fiber-reinforced posts did not contribute to load transfer as long as the bond between the tooth and composite core was intact.

The effect of a slow mode of BMP-2 delivery on the inflammatory response provoked by bone-defect-filling polymeric scaffolds

We investigated the inflammatory response to, and the osteoinductive efficacies of, four polymers (collagen, Ethisorb, PLGA and Polyactive) that bore either an adsorbed (fast-release kinetics) or a calcium-phosphate-coating-incorporated (slow-release kinetics) depot of BMP-2. Titanium-plate-supported discs of each polymer (n = 6 per group) were implanted at an ectopic (subcutaneous) ossification site in rats (n = 48). Five weeks later, they were retrieved for a histomorphometric analysis of the volumes of ectopic bone and foreign-body giant cells (a gauge of inflammatory reactivity), and the degree of polymer degradation. For each polymer, the osteoinductive efficacy of BMP-2 was higher when it was incorporated into a coating than when it was directly adsorbed onto the material. This mode of BMP-2 carriage was consistently associated with an attenuation of the inflammatory response. For coated materials, the volume density of foreign-body giant cells was inversely correlated with the volume density of bone (r(2) = 0.96), and the volume density of bone was directly proportional to the surface-area density of the polymer (r(2) = 0.97). Following coating degradation, other competitive factors, such as the biocompatibility and the biodegradability of the polymer itself, came into play.

A comparative assessment by optical coherence tomography of the performance of the first and second generation of the everolimus-eluting bioresorbable vascular scaffolds

The first generation of the everolimus-eluting bioresorbable vascular scaffold (BVS 1.0) showed an angiographic late loss higher than the metallic everolimus-eluting stent Xience V due to scaffold shrinkage. The new generation (BVS 1.1) presents a different design and manufacturing process than the BVS 1.0. This study sought to evaluate the differences in late shrinkage, neointimal response, and bioresorption process between these two scaffold generations using optical coherence tomography (OCT).