The roles of TL1A and Pno1 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique. Elle est caractérisée par une inflammation persistante touchant de multiples petites articulations, causant douleurs, rougeurs, gonflements et déformations. Des études menées auprès de patients et d’animaux ont démontré que certains auto-anticorps, cytokines et enzymes tissue-déstructives sont des médiateurs importants dans le développement de la PR. Au cours des deux dernières décennies, les traitements de fond (DMARDs en anglais) ont été démontrés très efficaces pour traiter la PR. D'autre part, des effets secondaires ont été rapportés pour ces traitements, par exemple l'augmentation du risque d'infections opportunistes. L’objectif de ce travail est d’acquérir des connaissances sur le rôle du TL1A (TNF-like molécule 1 A; TNFSF15) et son partenaire Nob1 (Pno1 ; YOR145c) dans la pathogenèse de la PR afin de découvrir de nouveaux médicaments contre ces molécules dans l'avenir. TL1A est un membre de la famille du TNF. Il déclenche des signaux co-stimulateurs via le récepteur de mort 3 (DR3) et induit la prolifération ainsi que la production des cytokines pro inflammatoires par les lymphocytes. Des données multiples suggèrent l'implication de la cascade TL1A-DR3 dans plusieurs maladies auto-immunes. Donc, nous avons proposé les hypothèses suivantes:1) la production locale de TL1A dans les articulations est un composant d’un cercle vicieux qui aggrave la PR; 2) dans la PR, la production de TL1A dans les organes lymphoïde augmente la production d’auto-anticorps pathogénique. Au cours de ce travail, nous avons démontré que la TL1A aggrave la maladie chez les souris où l’arthrite a été induite par le collagène (AIC). Par ailleurs, nous avons constaté que l’expression de TL1A est élevée dans les tissus atteints de PR ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant de la souris AIC. Mécaniquement, nous avons découvert que la TL1A est induite par le TNF-α et IL-17 produits par les cellules T in vitro. Ces résultats montrent directement que les TL1A-DR3 jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la PR. De plus, afin de poursuivre notre étude, la TL1A a été génétiquement supprimée dans les souris (TL1A KO). Nous avons montré que les souris TL1A KO n’ont aucune anomalie apparente et aucun dysfonctionnement du système immunitaire dans des conditions normales. Cependant, ces souris manifestent des AIC améliorées et une réduction significative des niveaux d'anticorps, anti-collagène du type II i dans le sérum. Nous avons trouvé que les ganglions lymphatiques de drainage (dLNs) de souris KO étaient plus petites avec une cellularité inférieure comparativement aux souris WT de 14 jours après l’immunisation. De plus, nous avons découvert que le DR3 a été exprimé par les cellules plasmatiques dans l’étape de la différenciation terminale et ces cellules surviennent mieux en présence de TL1A. La conclusion de cette étude apporte des nouvelles connaissances sur le rôle de TL1A qui amplifie les réponses humorales d’AIC. Nous avons suggéré que TL1A pourrait augmenter la réponse d’initiation d'anticorps contre collagène II (CII) ainsi que prolonger la survie des cellules plasmatiques. Une autre molécule qui nous intéresse est Pno1. Des études antérieures menées chez la levure ont suggéré que Pno1 est essentielle pour la néogénèse du protéasome et du ribosome Le protéasome étant crucial pour la différenciation terminale des cellules plasmatiques pendant les réponses humorales chez les mammifères, nous avons donc supposé que Pno1 joue un rôle dans la production d'anticorps pathogenique dans la PR via la voie du protéasome. Nous avons donc généré des souris génétiquement modifiées pour Pno1 afin d’étudier la fonction de Pno1 in vivo. Cependant, une mutation non-sens dans le Pno1 provoque une létalité embryonnaire à un stade très précoce chez les souris. D'autre part, une réduction de 50% de Pno1 ou une surexpression de Pno1 n’ont aucun effet ni sur le fonctionnent des cellules T et B, ni sur les activités du protéasome ainsi que sur la réponse humorale dans l’AIC. Ces résultats suggèrent que Pno1 est une molécule essentielle sans redondance. Par conséquent, il n’est pas une cible appropriée pour le développement de médicaments thérapeutiques. En conclusion, nos études ont révélé que la TL1A n’est pas essentielle pour maintenir les fonctions du système immunitaire dans des conditions normales. En revanche, il joue un rôle critique dans la pathogenèse de la PR en favorisant l'inflammation locale et la réponse humorale contre des auto-antigènes. Par conséquent, une inhibition de la TL1A pourrait être une stratégie thérapeutique pour le traitement de la PR. Au contraire, Pno1 est essentiel pour la fonction normale des cellules. Une délétion totale pourrait entraîner des conséquences graves. Il n’est pas une cible appropriée pour développer des médicaments de la PR.

Inférence topologique

Les données provenant de l'échantillonnage fin d'un processus continu (champ aléatoire) peuvent être représentées sous forme d'images. Un test statistique permettant de détecter une différence entre deux images peut être vu comme un ensemble de tests où chaque pixel est comparé au pixel correspondant de l'autre image. On utilise alors une méthode de contrôle de l'erreur de type I au niveau de l'ensemble de tests, comme la correction de Bonferroni ou le contrôle du taux de faux-positifs (FDR). Des méthodes d'analyse de données ont été développées en imagerie médicale, principalement par Keith Worsley, utilisant la géométrie des champs aléatoires afin de construire un test statistique global sur une image entière. Il s'agit d'utiliser l'espérance de la caractéristique d'Euler de l'ensemble d'excursion du champ aléatoire sous-jacent à l'échantillon au-delà d'un seuil donné, pour déterminer la probabilité que le champ aléatoire dépasse ce même seuil sous l'hypothèse nulle (inférence topologique). Nous exposons quelques notions portant sur les champs aléatoires, en particulier l'isotropie (la fonction de covariance entre deux points du champ dépend seulement de la distance qui les sépare). Nous discutons de deux méthodes pour l'analyse des champs anisotropes. La première consiste à déformer le champ puis à utiliser les volumes intrinsèques et les compacités de la caractéristique d'Euler. La seconde utilise plutôt les courbures de Lipschitz-Killing. Nous faisons ensuite une étude de niveau et de puissance de l'inférence topologique en comparaison avec la correction de Bonferroni. Finalement, nous utilisons l'inférence topologique pour décrire l'évolution du changement climatique sur le territoire du Québec entre 1991 et 2100, en utilisant des données de température simulées et publiées par l'Équipe Simulations climatiques d'Ouranos selon le modèle régional canadien du climat.

L’impact de la stéréoscopie dans la reconnaissance, la perception et la constance de forme 3D

Les buts des recherches présentées dans cette thèse étaient d’évaluer le rôle de la stéréoscopie dans la reconnaissance de forme, dans la perception du relief et dans la constance de forme. La première étude a examiné le rôle de la stéréoscopie dans la perception des formes visuelles en utilisant une tâche de reconnaissance de formes. Les stimuli pouvaient être présentés en 2D, avec disparité normale (3D) ou avec disparité inversée. La performance de reconnaissance était meilleure avec les modes de présentation 2D et 3D qu’avec la 3D inversée. Cela indique que la stéréoscopie contribue à la reconnaissance de forme. La deuxième étude s’est intéressée à la contribution conjointe de l’ombrage et de la stéréoscopie dans la perception du relief des formes. Les stimuli étaient des images d’une forme 3D convexe synthétique présentée sous un point de vue menant à une ambigüité quant à sa convexité. L’illumination pouvait provenir du haut ou du bas et de la gauche ou de la droite, et les stimuli étaient présentés dichoptiquement avec soit de la disparité binoculaire normale, de la disparité inversée ou sans disparité entre les vues. Les participants ont répondu que les formes étaient convexes plus souvent lorsque la lumière provenait du haut que du bas, plus souvent avec la disparité normale qu’en 2D, et plus souvent avec absence de disparité qu’avec disparité inversée. Les effets de direction d’illumination et du mode de présentation étaient additifs, c’est-à-dire qu’ils n’interagissaient pas. Cela indique que l’ombrage et la stéréoscopie contribuent indépendamment à la perception du relief des formes. La troisième étude a évalué la contribution de la stéréoscopie à la constance de forme, et son interaction avec l’expertise perceptuelle. Elle a utilisé trois tâches de discrimination séquentielle de trombones tordus ayant subi des rotations en profondeur. Les stimuli pouvaient être présentés sans stéréoscopie, avec stéréoscopie normale ou avec stéréoscopie inversée. Dans la première moitié de l’Exp. 1, dans laquelle les variations du mode de présentation étaient intra-sujets, les performances étaient meilleures en 3D qu’en 2D et qu’en 3D inversée. Ces effets ont été renversés dans la seconde moitié de l’expérience, et les coûts de rotation sont devenus plus faibles pour la 2D et la 3D inversée que pour la 3D. Dans les Exps. 2 (variations intra-sujets du mode de présentation, avec un changement de stimuli au milieu de l’expérience) et 3 (variations inter-sujets du mode de présentation), les effets de rotation étaient en tout temps plus faibles avec stéréoscopie qu’avec stéréoscopie inversée et qu’en 2D, et plus faibles avec stéréoscopie inversée que sans stéréoscopie. Ces résultats indiquent que la stéréoscopie contribue à la constance de forme. Toutefois, cela demande qu’elle soit valide avec un niveau minimal de consistance, sinon elle devient stratégiquement ignorée. En bref, les trois études présentées dans cette thèse ont permis de montrer que la stéréoscopie contribue à la reconnaissance de forme, à la perception du relief et à la constance de forme. De plus, l’ombrage et la stéréoscopie sont intégrés linéairement.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Vers une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie osseuse reliée à la fibrose kystique

Les patients atteints de la fibrose kystique (FK) ont désormais un âge médian de survie dépassant la cinquantaine. Par contre, avec ce vieillissement surviennent de nouvelles complications dont l'une des plus prévalente est la maladie osseuse associée à la FK. Les souris dont le Cftr est invalidé génétiquement présentent une densité osseuse amoindrie qui découle d’un débalancement du remodelage osseux caractérisé par une diminution de la formation et une augmentation de la résorption osseuse. L'observation que plusieurs modèles murins FK ont un phénotype ostéopénique et ce, même en absence de certains facteurs étiologiques (inflammation chronique, prise de glucocorticoïdes, insuffisance pancréatique etc.) laisse croire que le Cftr, le gène muté dans la FK, joue un rôle non-négligeable dans le métabolisme osseux. Le présent projet étudiera l’impact de l’absence du CFTR, sur les ostéoblastes (Ob) et ostéoclastes (Oc) dans un modèle murin de FK, soit les souris Cftr-/- de souche BALB/c. De plus, les Ob, sont reconnus comme ayant un effet modulateur sur le microenvironnement leucocytaire de la moelle osseuse (MO). Ce projet visera également à investiguer l’impact de l’absence du CFTR sur la niche leucocytaire de la MO. Nos résultats de densitométrie osseuse et de microtomographie à rayons X ont confirmé que les souris Cftr -/- ont une densité osseuse et un contenu minéral osseux abaissé, une diminution du volume osseux trabéculaire, un nombre amoindri de travées osseuses et une plus grande séparation entre les travées comparé aux souris Cftr+/+. Afin de mieux comprendre ce phénotype osseux, nous avons vérifié et confirmé que l’expression génique et protéique du CFTR est présente chez des Ob dérivés de la MO, mais est absent au niveau des Oc dérivés de la MO. Ces observations corroborent nos résultats portant sur la différenciation des cellules osseuses où nous avons démontré que seule la différenciation et fonction ostéoblastique sont affectées par l'absence du CFTR. Ce défaut ostéoblastique semble influencer négativement la leucopoïèse puisque nous observons une quantité moindre de cellules T, de macrophages et de cellules dendritiques chez les souris Cftr -/- vs. Cftr +/+. À la lumière de ces résultats, l'absence du CFTR semble avoir un impact important sur les ostéoblastes et la moelle osseuse.

Martin Heidegger and the problem of transcendence

Cette thèse a pour point de départ l’idée du jeune Heidegger selon laquelle le sens de l’être doit être recherché au moyen d’une phénoménologie ontologique, plus précisément par l’analytique existentiale du Dasein et la destruction de l’histoire de l’ontologie ; ou, comme nous l’interprétons, dans la transcendance du Dasein et la transcendance de l’être. L’étude du problème de la transcendance fait l’objet d’une approche phénoménologique, laquelle porte une attention particulière au vécu en tant que tel ainsi qu’aux conditions de possibilité de ce vécu, et repose sur une lecture attentive et critique des œuvres de Heidegger. C’est une telle approche phénoménologique qui nous permettra de mener à bien notre analyse du problème de la transcendance dans le corpus heideggérien. Nous serons par ailleurs en mesure d’aborder le débat opposant à ce sujet la tradition analytique (plus particulièrement l’approche pragmatiste) et la tradition continentale, notre étude s’inscrivant dans le cadre de cette dernière. Nous proposons ici une phénoménologie du problème de la transcendance qui fait également figure de phénoménologie du sens, de la possibilité et de la normativité. Prenant pour point de départ certaines contributions issues de la tradition continentale, nous soutenons que le sens de l’être peut être compris comme le problème de la transcendance. L’histoire de la philosophie doit être perturbée, déconstruite et repensée afin que le chemin de la philosophie, encore non pensé, puisse être mis au jour. L’accès à cet autre commencement doit être recherché dans la transcendance en tant que telle – de l’appel de la conscience fondé dans la nullité à l’encontre authentique avec la mort et l’ouverture de la temporalité ; de l’avènement historial de l’être jusqu’à, ultimement, le i! ! ! ! refus de l’être et le retrait du rien. L’événement (Ereignis) de l’être est donc compris comme processus de dépassement de soi à partir duquel la transcendance de l’être – ou, comme le formule Heidegger, la fin des questions – est possible.

Contribution différentielle de Neuroligine‐1 et d’EphA4 à la régulation du sommeil

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil.

Array pattern nulling by element position perturbations using a genetic algorithm

A genetic algorithm has been used for null steering in phased and adaptive arrays . It has been shown that it is possible to steer the array null s precisely to the required interference directions and to achieve any prescribed null depths . A comparison with the results obtained from the analytic solution shows the advantages of using the genetic algorithm for null steering in linear array patterns

Studies,Design and Development of Network Security Enhancement Services Using Novel Cryptographic Algorithms

Internet today has become a vital part of day to day life, owing to the revolutionary changes it has brought about in various fields. Dependence on the Internet as an information highway and knowledge bank is exponentially increasing so that a going back is beyond imagination. Transfer of critical information is also being carried out through the Internet. This widespread use of the Internet coupled with the tremendous growth in e-commerce and m-commerce has created a vital need for infonnation security.Internet has also become an active field of crackers and intruders. The whole development in this area can become null and void if fool-proof security of the data is not ensured without a chance of being adulterated. It is, hence a challenge before the professional community to develop systems to ensure security of the data sent through the Internet.Stream ciphers, hash functions and message authentication codes play vital roles in providing security services like confidentiality, integrity and authentication of the data sent through the Internet. There are several ·such popular and dependable techniques, which have been in use widely, for quite a long time. This long term exposure makes them vulnerable to successful or near successful attempts for attacks. Hence it is the need of the hour to develop new algorithms with better security.Hence studies were conducted on various types of algorithms being used in this area. Focus was given to identify the properties imparting security at this stage. By making use of a perception derived from these studies, new algorithms were designed. Performances of these algorithms were then studied followed by necessary modifications to yield an improved system consisting of a new stream cipher algorithm MAJE4, a new hash code JERIM- 320 and a new message authentication code MACJER-320. Detailed analysis and comparison with the existing popular schemes were also carried out to establish the security levels.The Secure Socket Layer (SSL) I Transport Layer Security (TLS) protocol is one of the most widely used security protocols in Internet. The cryptographic algorithms RC4 and HMAC have been in use for achieving security services like confidentiality and authentication in the SSL I TLS. But recent attacks on RC4 and HMAC have raised questions about the reliability of these algorithms. Hence MAJE4 and MACJER-320 have been proposed as substitutes for them. Detailed studies on the performance of these new algorithms were carried out; it has been observed that they are dependable alternatives.

Impedance field and transition from thermal to shot noise in Cd1-xZnxTe semi-insulating Ohmic detectors

Within a drift-diffusion model we investigate the role of the self-consistent electric field in determining the impedance field of a macroscopic Ohmic (linear) resistor made by a compensated semi-insulating semiconductor at arbitrary values of the applied voltage. The presence of long-range Coulomb correlations is found to be responsible for a reshaping of the spatial profile of the impedance field. This reshaping gives a null contribution to the macroscopic impedance but modifies essentially the transition from thermal to shot noise of a macroscopic linear resistor. Theoretical calculations explain a set of noise experiments carried out in semi-insulating CdZnTe detectors.

Mögliche Komponenten in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme in Dictyostelium discoideum

Die Amöbe Dictyostelium discoideum ist ein genetisch leicht manipulierbarer Organismus und dient als Modell für verschiedene zelluläre Prozesse, wie z.B. der Endocytose. Hierbei konnte vieles über die Funktion von beteiligten Proteinen anhand von Untersuchungen an spezifischen Mutanten gelernt werden. Bei AlyA handelt es sich um D. discoideum spezifisches Lysozym. GFP-modifiziertes AlyA lokalisiert in Phagosomen und in einer neuen Klasse von Vesikeln lysososomaler Enzyme. Über Rescue Mutanten konnte der Phänotyp alyA138 Knockout Mutanten, einer erhöhten Phagocytoserate einhergehend mit einem verbesserten Wachstum auf Bakterienrasen, der gerettet werden. In AlyA Null Zellen wurde eine erhöhte Expression von Gp70, einer lysosomalen Esterase, gefunden. Die Überexpression von Gp70 alleine führt mit geringen Unterschieden zu einem Phänotyp ähnlich der alyA Knockout Mutante. Demzufolge scheinen beide Enzyme eine Funktion in einer gemeinsamen Signalskaskade, ausgehend von der Degradation internalisierter Bakterien hin zu einer erhöhten Phagocytoserate, zu haben. Eine erhöhte Lysozymaktivität in Gp70 Überexprimierern wurde nicht gefunden. Mit H5 konnte mittels Microarray Analysen ein Protein identifiziert werden, welches in den alyA138 Knockout Zellen, jedoch nicht in Gp70 Überexprimierern, verstärkt exprimiert wird. Eine Funktion in einer Signalkette zwischen AlyA und Gp70, wie die erhöhte Expression vermuten lässt, konnte jedoch nicht bestätigt werden. So führt die Überexpression von H5 weder zu einer erhöhten Phagocytoserate noch zu einer verstärkten Expression von Gp70. Mittels der Microarray Analysen konnten weiterhin acht Gene identifiziert werden, die in den beiden Mutanten schwächer exprimiert vorliegen. Knockaout Mutanten zweier dieser Gene, sse346 und ssj758, wurden untersucht. Sse346 Null Zellen zeigen eine erhöhte Phagocytoserate einhergehend mit effizienterem Wachstum auf Bakterienrasen, während das Fehlen von Ssj758 nur zu vergrößerten Plaquedurchmessern führte. Beide proteine haben demnach eine Funktion in der postulierten Signalkaskade. Diese scheint, ausgehend von der Überexpression von Gp70, zweigeteilt zu verlaufen.

Biologische Charakterisierung von LC-FACS-Proteinen in Dictyostelium discoideum

Die Endozytose und die anschließende Verwertung der aufgenommenen Substanzen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Dabei wird ein besonderes Augenmerk auf die Proteine gelegt, die an diesen Vorgängen beteiligt sind. In der hier vorliegenden Arbeit wird der Lipid-Status der Zelle und Enzyme des Lipid-Stoffwechsels berücksichtigt. Das Ausschalten einer Long Chain-Fatty Acyl CoA Synthetase 1 (LC-FACS), fcsB, in Dictyostelium discoideum hat eine Veränderung der Menge an neutralen Lipiden zur Folge. In diesen LC-FACS2 „Knock-Out“-Zellen wird ein Zusammenhang zwischen neutralen Lipiden und der Phagozytose von Hefen und Bakterien detektiert. Ein Einfluss auf den endozytotischen Transit kann in diesen Zellen nur induziert werden, wenn man zusätzlich den Triglycerid-Hydrolyse-Inhibitor LSD1 in den Zellen exprimiert. Mit Hilfe der Daten wird ein Modell erstellt, indem die Reduktion der Menge an neutralen Lipiden nicht direkt für diesen Phänotyp verantwortlich ist. Es ist vielmehr das Energie-Niveau der Zellen, das die Phagozytoserate beeinflusst. Möglich macht dies ein Pool aus Fettsäuren im Zytoplasma. Dieser besteht aus unaktivierten Fettsäuren und Acyl-CoAs. Auf ihn greifen Kompartimente wie Lipidtropfen, Mitochondrien und Peroxisomen zu, wenn Fettsäuren verstoffwechselt werden sollen. In LC-FACS2 „Knock-Out“-Zellen, wird das Gleichgewicht im Pool in Richtung der unaktivierten Fettsäuren verschoben. Anhand der Größe dieses Pools kann die Zelle ihren Energiestatus messen. Ein höherer Energie-Status führt dann zu einer Reduktion der Phagozytoserate. Vacuolin B Null Zellen (vacB-) zeigen eine extreme Verzögerung im endozytotischen Transit. Schaltet man in diesen Zellen die LC-FACS1 aus (vacB-/fcsA-), so reduziert man ebenfalls die Menge an Triglyceriden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der Acyl-CoA Anteil des Fettsäure-Pools reduziert ist. Diese Reduktion resultiert hier in einer Beschleunigung des endozytotischen Transits. Die Exozytose von vacB--Zellen und vacB-/ fcsA--Zellen unterscheidet sich nicht. Daher wird die Ursache für diese Beschleunigung in veränderten Fusions- bzw. Fissionseigenschaften der Endosomen vermutet. Somit führt das Ausschalten von LC-FACS-Proteinen in Dictyostelium zu einer veränderten Zusammensetzung des Fettsäure-Pools. Dies hat im Fall der LC-FACS1 Modifikationen der Membran-Dynamik und im Fall der LC-FACS2 Änderungen des Energie-Spiegels zur Folge.

Heterochromatin und epigenetische Kontrolle der Centromere in Dictyostelium discoideum

Heterochromatin Protein 1 (HP1) is an evolutionarily conserved protein required for formation of a higher-order chromatin structures and epigenetic gene silencing. The objective of the present work was to functionally characterise HP1-like proteins in Dictyostelium discoideum, and to investigate their function in heterochromatin formation and transcriptional gene silencing. The Dictyostelium genome encodes three HP1-like proteins (hcpA, hcpB, hcpC), from which only two, hcpA and hcpB, but not hcpC were found to be expressed during vegetative growth and under developmental conditions. Therefore, hcpC, albeit no obvious pseudogene, was excluded from this study. Both HcpA and HcpB show the characteristic conserved domain structure of HP1 proteins, consisting of an N-terminal chromo domain and a C-terminal chromo shadow domain, which are separated by a hinge. Both proteins show all biochemical activities characteristic for HP1 proteins, such as homo- and heterodimerisation in vitro and in vivo, and DNA binding activtity. HcpA furthermore seems to bind to K9-methylated histone H3 in vitro. The proteins thus appear to be structurally and functionally conserved in Dictyostelium. The proteins display largely identical subnuclear distribution in several minor foci and concentration in one major cluster at the nuclear periphery. The localisation of this cluster adjacent to the nucleus-associated centrosome and its mitotic behaviour strongly suggest that it represents centromeric heterochromatin. Furthermore, it is characterised by histone H3 lysine-9 dimethylation (H3K9me2), which is another hallmark of Dictyostelium heterochromatin. Therefore, one important aspect of the work was to characterise the so-far largely unknown structural organisation of centromeric heterochromatin. The Dictyostelium homologue of inner centromere protein INCENP (DdINCENP), co-localized with both HcpA and H3K9me2 during metaphase, providing further evidence that H3K9me2 and HcpA/B localisation represent centromeric heterochromatin. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed that two types of high-copy number retrotransposons (DIRS-1 and skipper), which form large irregular arrays at the chromosome ends, which are thought to contain the Dictyostelium centromeres, are characterised by H3K9me2. Neither overexpression of full-length HcpA or HcpB, nor deletion of single Hcp isoforms resulted in changes in retrotransposon transcript levels. However, overexpression of a C-terminally truncated HcpA protein, assumed to display a dominant negative effect, lead to an increase in skipper retrotransposon transcript levels. Furthermore, overexpression of this protein lead to severe growth defects in axenic suspension culture and reduced cell viability. In order to elucidate the proteins functions in centromeric heterochromatin formation, gene knock-outs for both hcpA and hcpB were generated. Both genes could be successfully targeted and disrupted by homologous recombination. Surprisingly, the degree of functional redundancy of the two isoforms was, although not unexpected, very high. Both single knock-out mutants did not show any obvious phenotypes under standard laboratory conditions and only deletion of hcpA resulted in subtle growth phenotypes when grown at low temperature. All attempts to generate a double null mutant failed. However, both endogenous genes could be disrupted in cells in which a rescue construct that ectopically expressed one of the isoforms either with N-terminal 6xHis- or GFP-tag had been introduced. The data imply that the presence of at least one Hcp isoform is essential in Dictyostelium. The lethality of the hcpA/hcpB double mutant thus greatly hampered functional analysis of the two genes. However, the experiment provided genetic evidence that the GFP-HcpA fusion protein, because of its ability to compensate the loss of the endogenous HcpA protein, was a functional protein. The proteins displayed quantitative differences in dimerisation behaviour, which are conferred by the slightly different hinge and chromo shadow domains at the C-termini. Dimerisation preferences in increasing order were HcpA-HcpA << HcpA-HcpB << HcpB-HcpB. Overexpression of GFP-HcpA or a chimeric protein containing the HcpA C-terminus (GFP-HcpBNAC), but not overexpression of GFP-HcpB or GFP-HcpANBC, lead to increased frequencies of anaphase bridges in late mitotic cells, which are thought to be caused by telomere-telomere fusions. Chromatin targeting of the two proteins is achieved by at least two distinct mechanisms. The N-terminal chromo domain and hinge of the proteins are required for targeting to centromeric heterochromatin, while the C-terminal portion encoding the CSD is required for targeting to several other chromatin regions at the nuclear periphery that are characterised by H3K9me2. Targeting to centromeric heterochromatin likely involves direct binding to DNA. The Dictyostelium genome encodes for all subunits of the origin recognition complex (ORC), which is a possible upstream component of HP1 targeting to chromatin. Overexpression of GFP-tagged OrcB, the Dictyostelium Orc2 homologue, showed a distinct nuclear localisation that partially overlapped with the HcpA distribution. Furthermore, GFP-OrcB localized to the centrosome during the entire cell cycle, indicating an involvement in centrosome function. DnmA is the sole DNA methyltransferase in Dictyostelium required for all DNA(cytosine-)methylation. To test for its in vivo activity, two different cell lines were established that ectopically expressed DnmA-myc or DnmA-GFP. It was assumed that overexpression of these proteins might cause an increase in the 5-methyl-cytosine(5-mC)-levels in the genomic DNA due to genomic hypermethylation. Although DnmA-GFP showed preferential localisation in the nucleus, no changes in the 5-mC-levels in the genomic DNA could be detected by capillary electrophoresis.

Faktorisierung in Schief-Polynomringen

In der Arbeit werden zunächst die wesentlichsten Fakten über Schiefpolynome wiederholt, der Fokus liegt dabei auf Shift- und q-Shift-Operatoren in Charakteristik Null. Alle für die Arithmetik mit diesen Objekten notwendigen Konzepte und Algorithmen finden sich im ersten Kapitel. Einige der zur Bestimmung von Lösungen notwendigen Daten können aus dem Newtonpolygon, einer den Operatoren zugeordneten geometrischen Figur, abgelesen werden. Die Herleitung dieser Zusammenhänge ist das Thema des zweiten Kapitels der Arbeit, wobei dies insbesondere im q-Shift-Fall in dieser Form neu ist. Das dritte Kapitel beschäftigt sich mit der Bestimmung polynomieller und rationaler Lösungen dieser Operatoren, dabei folgt es im Wesentlichen der Darstellung von Mark van Hoeij. Der für die Faktorisierung von (q-)Shift Operatoren interessanteste Fall sind die sogenannten (q-)hypergeometrischen Lösungen, die direkt zu Rechtsfaktoren erster Ordnung korrespondieren. Im vierten Kapitel wird der van Hoeij-Algorithmus vom Shift- auf den q-Shift-Fall übertragen. Außerdem wird eine deutliche Verbesserung des q-Petkovsek-Algorithmus mit Hilfe der Daten des Newtonpolygons hergeleitet. Das fünfte Kapitel widmet sich der Berechnung allgemeiner Faktoren, wozu zunächst der adjungierte Operator eingeführt wird, der die Berechnung von Linksfaktoren erlaubt. Dann wird ein Algorithmus zur Berechnung von Rechtsfaktoren beliebiger Ordnung dargestellt. Für die praktische Benutzung ist dies allerdings für höhere Ordnungen unpraktikabel. Bei fast allen vorgestellten Algorithmen tritt das Lösen linearer Gleichungssysteme über rationalen Funktionenkörpern als Zwischenschritt auf. Dies ist in den meisten Computeralgebrasystemen nicht befriedigend gelöst. Aus diesem Grund wird im letzten Kapitel ein auf Evaluation und Interpolation basierender Algorithmus zur Lösung dieses Problems vorgestellt, der in allen getesteten Systemen den Standard-Algorithmen deutlich überlegen ist. Alle Algorithmen der Arbeit sind in einem MuPAD-Package implementiert, das der Arbeit beiliegt und eine komfortable Handhabung der auftretenden Objekte erlaubt. Mit diesem Paket können in MuPAD nun viele Probleme gelöst werden, für die es vorher keine Funktionen gab.

Unveiling the components of the signaling pathway between endosomes and the phagocytic uptake machinery in Dictyostelium discoideum

The soil amoebae Dictyostelium discoideum take up particles from their environment in order to obtain nutrition. The particle transits through the cell within a phagosome that fuses with organelles of different molecular compositions, undergoing a gradual degradation by different sets of hydrolytic enzymes. Griffiths’ concept of “phagosome individuality” predicts signaling from phagosomes into the cytoplasm, which might regulate many aspects of cell physiology. The finding that Dictyostelium cells depleted of the lysozyme AlyA or over-expressing the esterase Gp70 exhibit increased uptake of food particles, led to the postulation of a signaling cascade between endocytic compartments and the cytoskeletal uptake machinery at the plasma membrane. Assuming that Gp70 acts downstream of AlyA, gene-expression profiling of both mutants revealed different and overlapping sets of misregulated genes that might participate in this signaling cascade. Based on these results, we analyzed the effects of the artificial misregulation of six candidate genes by over-expression or negative genetic interference, in order to reconstruct at least part of the signaling pathway. SSB420 and SSL793 were chosen as candidates for the first signaling step, as they were up-regulated in AlyA-null cells and remained unaltered in the Gp70 over-expressing cells. The over-expression of SSB420 enhanced phagocytosis and raised the expression levels of Gp70, supporting its involvement in the signaling pathway between AlyA and Gp70 as a positive regulator of phagocytosis. However, this was not the case of cells over-expressing SSL793, as this mutation had no effects on phagocytosis. For the signaling downstream of Gp70, we studied four commonly misregulated genes in AlyA-depleted and Gp70 over-expressing cells. The expression levels of SLB350, SSB389 and TipD were lower in both mutants and therefore these were assumed as possible candidates for the negative regulation of phagocytosis. Cells depleted of SLB350 exhibited an increased phagocytic activity and no effect on Gp70 expression, proving its participation in the signaling pathway downstream of Gp70. Unlike SLB350, the disruption of the genes coding for SSB389 and TipD had no effects on particle uptake, excluding them from the pathway. The fourth candidate was Yipf1, the only gene that was commonly up-regulated in both mutants. Yet, the artificial over-expression of this protein had no effects on phagocytosis, so this candidate is also not included in the signaling pathway. Furthermore, localizing the products of the candidate genes within the cell helped unveiling several cellular organelles that receive signals from the phagosome and transduce them towards the uptake machinery.