Diagnóstico biológico e molecular e análise da seqüência de nucleotídeos do gene da proteína capsidial de um isolado do Apple stem pitting virus

O Apple stem pitting virus (ASPV) foi detectado por RT-PCR em amostras de cultivares de pereiras européias (Pyrus communis L.) cvs. Starkrimson e Abate Fetel, e asiáticas (P. pyrifolia var. culta) cvs. Kousui e Housui coletadas no início do outono de 2003 em pomar da Estação Experimental da Embrapa Uva e Vinho, Vacaria, RS. Utilizando várias combinações de oligonucleotídeos, foram amplificados fragmentos de DNA de 269 e 1554 pb, este último contendo o gene completo (1131 nt) da proteína capsidial do ASPV. Outro fragmento amplificado de 291 pb compreende parte do gene da polimerase viral. Estes fragmentos constituem-se em um excelente instrumento de diagnóstico do ASPV em pereiras. A comparação das seqüências de nucleotídeos do gene da proteína capsidial do ASPV com seqüências do banco de dados GenBank, revelou identidades de 89% com seqüências de um isolado alemão de macieira e de 85 a 88% com isolados poloneses, de pereiras. A indicadora herbácea Nicotiana occidentalis cv. 37B, inoculada mecanicamente com extrato foliar da cv. Housui, apresentou lesões locais necróticas, necrose foliar marginal e das nervuras. O ASPV também foi detectado por dot-ELISA nas cvs. Abate Fetel e Kousui, na cv. Starkrimson por imunoblot, e em Pyronia veitchii (Trabut) Guill. por enxertia de borbulhas da cv. Abate Fetel infetada.

Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar

Os vírus pertencentes ao subgrupo do Sugarcane mosaic virus (SCMV, gênero Potyvirus, família Potyviridae) infectam e causam mosaico em diferentes espécies botânicas da subfamília Panicoideae (família Poaceae), porém apenas o SCMV e o Sorghum mosaic virus (SrMV) infectam naturalmente cana-de-açúcar. No Brasil, a espécie SCMV parece ser o único agente causal da doença. Embora a maioria das variedades comerciais de cana-de-açúcar seja considerada resistente ou tolerante ao SCMV, relatos de incidência de mosaico em tais variedades têm ocorrido no campo. Amostras com sintomas, de diversos clones e variedades, foram coletadas em campos experimentais e comerciais de cana-de-açúcar. Dentre as variedades, a RB72-454, uma das mais plantadas no país e considerada resistente à doença, também apresentou plantas com sintomas de mosaico. As amostras foram testadas por DAS-ELISA, com anti-soros policlonais para as espécies SCMV, Johnsongrass mosaic virus (JGMV) e Maize dwarf mosaic virus (MDMV), apresentando resultados negativos. Porém, sintomas de mosaico foram observados em mudas de sorgo "Rio" e "TX2786" quando inoculadas mecanicamente com os isolados, indicando tratar-se de infecção pelo SCMV. RNA total foi extraído das folhas de cana e submetido a RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para SCMV e SrMV. Fragmentos específicos de aproximadamente 880 pares de bases foram amplificados com os oligonucleotídeos para o SCMV, confirmando os resultados da inoculação mecânica. Os produtos de PCR foram clonados e seqüenciados. Um dos isolados de SCMV encontrado constitui uma nova estirpe, mais severa, capaz de infectar plantas da variedade RB72-454 e de outras variedades, consideradas tolerantes, no campo.

Síntese, caracterização e estudos de transferencia de energia do complexo dimérico constituído por Zn e Mn porfirina

Muitos compostos modelo contendo porfirinas têm sido preparados num esforço para entender o sistema de fotossíntese e os processos de aproveitamento de energia solar. Sistemas doadores-receptores contendo porfirinas têm sido freqüentemente estudados para testar várias descrições teóricas sobre transferência de elétrons. O estudo de parâmetros fotoquímicos e fotofísicos como a distância para transferência de energia, geometria molecular e a diferença de potencial eletrônico, tem se mostrado importante para a definição da transferência eletrônica em porfirinas. Neste trabalho apresentamos a síntese, purificação e caracterização por espectroscopia UV/Vis, ¹H e 19F RMN, luminescência e tempos de vida de novos modelos moleculares de porfirinas, que permitam investigar esses parâmetros. Utilizou-se o dímero Zn,Mn(TPPF4)2pip e seus monômeros ZnTPPF4pipH e MnF5TPP. A caracterização do ZnMn(TPPF4)2pip, foi dificultada devido a presença de Mn+3, devido ao forte acoplamento dos orbitais dpi do manganês e o sistema pi da porfirina, que aumenta a interação manganês-porfirina mudando o espectro eletrônico UV/Vis e distorcendo os sinais de ¹H e 19F RMN do dímero. A presença de Mn+3 desloca E1/2 do anel porfirínico para valores mais negativos, o que resulta em reduções mais difíceis, impedindo a transferência de energia da Znporfirina para a Mnporfirina.

Caracterização das frações das substâncias húmicas de diferentes tamanhos moleculares

Neste trabalho realizou-se a extração das substâncias húmicas (SH) provenientes da turfa coletada às margens do rio Mogi-Guaçu, segundo metodologia descrita por Rosa et al., 2000. As SH foram fracionadas em um equipamento de ultrafiltração em três faixas de tamanhos moleculares 30 - 100 KDa, <30 KDa e >100 KDa. As frações foram caracterizadas por diferentes técnicas analíticas, infravermelho (IV), análise elementar, espectroscopia na região do ultravioleta/visível (UV/Vis) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Verificou-se que as frações de menor tamanho molecular (30 - 100 KDa e <30 KDa) possuem um maior número de moléculas com oxigênio ligados, enquanto que a fração de maior tamanho molecular (>100 KDa) apresentou um maior número de moléculas aromáticas. Através dos resultados das análises elementares e de ressonância paramagnética eletrônica, constatou-se que a fração <30 KDa apresentou uma menor porcentagem de carbono, nitrogênio e hidrogênio e uma menor quantidade de radicais livres em relação as demais, indicando que esta fração possui um menor número de anéis aromáticos conjugados. Já nas análises por IV foram observadas bandas características das SH.

Caracterização morfo-fisiológica e patogenicidade de Colletotrichum gloeosporioides da pupunheira

Isolados de Colletotorichum sp. de folhas de pupunheira (Bactris gasipaes) com sintomas de antracnose foram comparados fenotipicamente, visando a sua caracterização e identificação. Foram analisados 17 isolados, oriundos dos Estados do Acre, Rondônia, Espírito Santo, São Paulo e Paraná. Caracterizaram-se os sintomas da doença e os isolados foram comparados em relação à forma e tamanho de conídios e apressórios, e quanto a coloração das colônias, crescimento micelial e esporulação em meio de cultura. A patogenicidade dos isolados foi confirmada em folhas de pupunheira destacadas. Todos os isolados foram identificados como Colletotrichum gloeosporioides e a fase meiospórica in vitro (Glomerella cingulata) ocorreu apenas em um isolado procedente de Linhares, Espírito Santo.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Caracterização da virulência de Magnaporthe grisea em cultivares diferenciadoras japonesas e linhas quase-isogênicas das cultivares IAC-25 e de CO-39 de arroz

Foi estudada a virulência de 681 isolados de Magnaporthe grisea provenientes de oito lavouras de arroz de terras altas, quatro da cv. BRS Bonança e quatro da cv. Primavera, localizadas em cinco municípios no Estado de Goiás. Foram avaliados 321 isolados de M. grisea de folha e de panícula obtidos da cv. BRS Bonança e 360 da cv. Primavera. Para diferenciar a virulência dos isolados foram utilizados nove cultivares diferenciadoras japonesas, seis linhagens quase-isogências (NIL's) da cv. IAC-25, cinco linhagens quase-isogênicas da cv. CO-39, e as cultivares Primavera, BRS Bonança, IAC-25 e CO-39. Os isolados de M. grisea provenientes da cv. BRS Bonança foram mais virulentos nas NIL's de IAC-25 do que isolados da cv. Primavera. A maioria das subpopulações de M. grisea provenientes de folhas e panícula, de ambas as cultivares, foram avirulentos à linhagem quase-isogênica CNA-8212. A virulência, em baixa freqüência, foi observada nos isolados de M. grisea provenientes de BRS Bonança aos genes Pi-z t (Toride-1) e de Primavera aos genes Pi-z (Fukunishiki). Uma baixa freqüência de isolados virulentos foram virulentos nas NIL's C101 LAC (Pi-1) e C101 A 51(Pi-2). Considerando as reações compatíveis e incompatíveis das NIL's de IAC-25 à população de M. grisea de BRS Bonança, o dendrograma mostrou um grupo (90% de similaridade), diferindo do parental recorrente. Por outro lado, a população de 'Primavera', com exceção da CNA-8199, formou um grupo (93% de similaridade), incluindo o parental recorrente. Os genes de resistência Pi-z e Pi-z t das cultivares Fukunishiki e Toride-1, respectivamente, os genes Pi-1 e Pi-2 das NIL's de CO-39 e os genes desconhecidos das NIL's IAC-25, que apresentaram maior espectro de resistência às populações estudadas podem ser utilizados no programa de melhoramento, para desenvolvimento de linhas isogênicas de BRS Bonança e Primavera.

Análise da diversidade genética de isolados de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum do algodoeiro

A mancha angular do algodoeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), é uma doença de importância econômica e pode causar perdas apreciáveis no rendimento. A doença pode ser controlada por resistência varietal desde que haja conhecimento sobre a variabilidade das populações do patógeno. A variabilidade genética e a estabilidade patogênica entre os isolados deste patógeno não foram suficientemente estudadas, principalmente considerando a introdução de novas cultivares e a expansão da cultura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a variabilidade genética entre os 61 isolados de Xam, provenientes de diversas cultivares e regiões do Brasil, através de ensaios moleculares. Análises de ERIC e REP-PCR demonstraram dois grupos distintos de Xam associados a região geográfica de origem. Não foram observadas diferenças nos perfis dos isolados através de PCR-RFLP da região 16S-23S rDNA. A região espaçadora 16S-23S rDNA de três linhagens de Xam foi analisada através de clonagem e sequenciamento e seis diferenças nas seqüências foram encontradas. A técnica de RAPD revelou um maior nível de polimorfismo, distinguindo 6 grupos de Xam a 85% de similaridade. Os resultados indicam a existência de variabilidade muito restrita entre os isolados analisados.

Caracterização de um isolado de Bidens mosaic virus proveniente de alface

Em 2004, plantas de alface com sintomas de mosaico coletadas em São Manuel - SP foram analisadas por microscopia eletrônica, constatando-se presença de partículas típicas de potyvirus com 730 nm de comprimento. Após purificação biológica por monolesionais em Chenopodium quinoa, o extrato vegetal foi inoculado em uma série de plantas diferenciadoras, verificando-se que o isolado testado foi capaz de infectar C. quinoa e C. amaranticolor induzindo lesões locais seguidas de mosaico sistêmico. Ervilha (Pisum sativum) mostrou-se assintomática, e em diferentes cultivares de alface como Trocadero, White Boston, Regina, Verônica, Lucy Brown, Rafaela, Tainá, Vera e Laurel foi observado o mosaico. A cultivar Gizele foi tolerante ao vírus. O sequenciamento da região codificadora da proteína capsidial revelou maior identidade de aminoácidos (97%) deste isolado com o Bidens mosaic virus - BiMV (nº de acesso AY960151). Diferentemente dos isolados de BiMV já descritos, este proveniente de alface não foi capaz de infectar Bidens pilosa, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum TNN e N. glutinosa. A ocorrência natural do BiMV em alface, causando sintomas semelhantes aos do LMV e a suscetibilidade de várias das cultivares hoje plantadas, servem como um alerta para a correta diagnose do vírus a campo.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Caracterização cultural, morfológica e patogênica de Lasiodiplodia theobromae associado a frutíferas tropicais

Lasiodiplodia theobromae é um fungo cosmopolita, polífago e oportunista, com reduzida especialização patogênica, capaz de infectar espécies de plantas em regiões tropicais e temperadas, causando os mais variados sintomas. Este estudo teve como objetivo caracterizar isolados de L. theobromae associados a frutíferas tropicais na região nordeste, considerando os aspectos cultural, morfológico e patogênico. Foram avaliados o crescimento micelial, coloração da colônia, dimensões dos conídios e patogenicidade dos isolados em mudas de cajazeira (Spondia mombin L.), cajueiro (Anacardium occidentale L.), gravioleira (Annona muricata L.) e umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda). Os dados de caracterização morfológica e cultural revelaram diversidade na população do patógeno. Alta variabilidade patogênica foi também detectada, embora não tenha sido possível observar especificidade patogênica em cajueiro. O umbuzeiro apresentou maior resistência relativa ao fungo. Os dados demonstraram também uma interação entre as características morfo-culturais e a patogenicidade dos isolados de L. theobromae.

Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel): detecção de enzimas extracelulares em isolados normais e alterados por temperatura

O fungo Cylindrocladium spathiphylli causa podridão no colo e nas raízes de espatifilo, induzindo amarelecimento e murcha nas folhas da parte aérea. Há poucos estudos com o fungo quanto às enzimas extracelulares. Assim, delineou-se ensaio inteiramente casualizado in vitro, com três tratamentos (dois isolados normais: LFEEI016 - EPAGRI/SC e MMBF 01/01 - IB/SP; mais testemunha) e seis repetições, visando a detecção de enzimas. A amilase (AM), lipase (LP), carboximetilcelulase (CMC) e lacase (LC) foram mensuradas pelo cálculo da área da coroa circular, local de atividade das enzimas. A catalase (CT) e gelatinase (GL) foram mensuradas por símbolos, depois transformados em notas (1 a 4, de ausência à intensa produção). O isolado MMBF 01/01 produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC e depois a LP. LFEEI016 e MMBF 01/01 não apresentaram área para AM e CMC e exibiram intensidade fraca e igual para CT. A intensidade de GT foi moderada no MMBF 01/01 (nota média 3,0) e ausente para o LFEEI016 (nota média 1,0). Após a produção das enzimas extracelulares, os isolados foram alterados vegetativamente por temperatura. Instalou-se ensaio inteiramente ao acaso, em fatorial contendo disco de micélio dos isolados do fungo versus três temperaturas [23ºC (T1); 33ºC (T2) e de 33ºC para 23ºC (T3)] versus quatro períodos (3; 6; 9 e 12 dias), com oito repetições, em placa de Petri com BDA mantida em BOD. O diâmetro das colônias foi medido diariamente (mm) em dois sentidos. As alterações de temperatura vistas foram: inócuo, fungistático (FS) e fungicida (FC). Aplicou-se estatística nas temperaturas T1 e T3 dos isolados para checar efeito FS e escolher aqueles com maior e menor efeito. O isolado LFEEIO16 mostrou efeito FS com três dias às temperaturas 33ºC e de 33ºC para 23ºC. Nos demais períodos, o isolado sofreu efeito FC. O MMBF 01/01 mostrou efeito FS em todos os períodos. Ambos isolados sofreram, estatisticamente, efeito FS. O MMBF 01/01 mostrou maior efeito FS aos nove dias, nas temperaturas referidas e menor com três dias. Após a constatação de alteração na taxa de crescimento micelial dos isolados, procurou-se verificar, novamente, a produção de enzimas extracelulares. Os isolados alterados e utilizados foram o MMBF 01/01 com três e nove dias e o LFEEIO16 com três dias. A produção e a avaliação das enzimas foram realizadas da mesma maneira para os isolados normais. O isolado MMBF 01/01 - três dias produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC. Após LC, a área da LP foi maior que a da CMC nos isolados. Não se detectou área de AM nos isolados. A intensidade de GL foi maior que a da CT nos isolados MMBF 01/01 com três e nove dias. Para LFEEI016 - três dias, a intensidade média de CT foi nota 2,0 e ausência de GL (nota média 1,3). Sugere-se investigar a severidade da doença na planta entre os isolados e em condições naturais investigar a evolução da LC em comparação as demais enzimas na patogênese do fungo na cultura.

Uso de RFLP-PCR para a detecção de isolados de Venturia inaequalis resistentes ao cresoxim metílico do Sul do Brasil

O principal mecanismo que confere resistência do fungo Venturia inaequalis aos inibidores de oxidação (quinol QoIs) é a ocorrência de mutações no gene citocromo b CYTB (G143A). O objetivo do trabalho foi a implementação da metodologia RFLP-PCR para caracterizar a reação de isolados de V. inaequalis à presença de Qols. Foram utilizados sete isolados monospóricos de V. inaequalis, coletados em pomares comerciais de Santa Catarina e cedidos pela Estação Experimental da EPAGRI de São Joaquim, Santa Catarina. Os isolados foram classificados como sensíveis ou resistentes após crescimento em meio BDA contendo 10 µg.mL-1 de cresoxim metílico. Para determinação da presença da mutação G143A foram utilizados os marcadores específicos ViCytB-5F e ViCytB-6071R. O DNA dos isolados foi amplificado em reação de PCR e separado em gel de agarose 1,5%. Os fragmentos foram então digeridos com a enzima de restrição Fnu4HI identificadora da mutação e os produtos da digestão foram analisados por eletroforese num gel de agarose 1,0%. Os genótipos revelados estavam associados ao fenótipo estabelecido pelo crescimento dos isolados em presença do fungicida, mostrando que 6 isolados já apresentavam o alelo de resistência. O uso de técnicas de RFLP-PCR permitiram uma avaliação rápida e confiável na detecção da resistência de V. inaequalisao cresoxim metílico.

Caracterização de Fusarium solani f. sp. piperis, produção de fitotoxina e incidência da fusariose no norte de Minas Gerais

RESUMO A podridão das raízes causada por Fusarium solani f. sp. piperis é uma das principais doenças da pimenteira-do-reino no norte de Minas Gerais. Os objetivos deste trabalho foram quantificar a incidência da doença nas principais áreas produtoras do norte do estado de Minas Gerais, identificar o agente causal da fusariose, testar a patogenicidade dos isolados e avaliar a ação de filtrados de F. solani f. sp. piperis sobre folhas destacadas de pimenteira-do-reino e sobre Trichoderma asperellum. Avaliou-se a incidência da fusariose em 1.000 ou 500 plantas de forma arbitrária, em percurso em zigue-zague. A reação de pimenta-do-reino ‘Cingapura’ foi avaliada em relação a dois filtrados fúngicos (FPC1 e FPB2), e o isolado FPB2 foi empregado para avaliar a reação das cultivares Cingapura e Guajarina. Outro experimento foi realizado para estudar a influência das diluições do filtrado FPB2 em folhas da cultivar Cingapura. Para avaliar o efeito de toxinas dos filtrados sobre o Índice de Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM) de T. asperellum foi implantado um ensaio com diferentes concentrações e dois filtrados. A incidência da doença nas áreas amostradas foi de 31,5 e 100% nos municípios de Bocaiúva e Montes Claros, respectivamente. De acordo com os resultados do teste de compatibilidade sexual foi possível identificar os isolados como F. solani f. sp. piperis. Nove isolados foram patogênicos quando inoculados em mudas de pimenta-do-reino com quatro meses de desenvolvimento. O filtrado FPB2 produziu maior severidade de infecção (média de 93,6% de área foliar necrosada), comparado ao isolado FPC1 (5,8%). A cultivar Cingapura foi mais sensível à ação do filtrado. A diluição do filtrado FPB2 proporcionou redução na porcentagem de área foliar lesionada. Observou-se, ainda, que o aumento das concentrações do filtrado do isolado FPC1 proporcionou o aumento do IVCM de T. asperellum, enquanto o filtrado de FPB2 gerou uma reação contrária, reduzindo o IVCM desse fungo antagonista.

Extração e caracterização de hemiceluloses de Pinus radiata e sua viabilidade para a produção de bioetanol

As galactoglucomananas são as principais frações de hemiceluloses presentes nas madeiras moles e contêm, principalmente, as hexoses galactose, glicose e manose. O isolamento eficiente e seletivo dessas hemiceluloses é um obstáculo crítico a superar para sua utilização. Os objetivos deste trabalho foram extrair e caracterizar soluções aquosas ácidas e neutras de hemiceluloses de cavacos de madeira de Pinus radiata, bem como avaliar sua viabilidade para a produção de bioetanol. As hemiceluloses em P. radiata representam 26 g/100 g de madeira (base seca), e as hexoses são responsáveis por aproximadamente 64% dessa quantidade. De acordo com as diferentes condições de extração, cerca de 50% da fração hemicelulósica foi solubilizada e recuperada depois de uma precipitação com etanol. As frações recuperadas de hemiceluloses estavam na forma de oligômeros com peso molecular médio (Mw) variando entre 4x10³ e 4x10(5) g/mol. Os oligômeros hemicelulósicos foram hidrolisados com ácido sulfúrico diluído e os hidrolisados concentrados até aproximadamente 70 g/L hexosas e fermentados pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados de fermentação indicaram que os açúcares obtidos dos extratos ácidos e neutros foram fermentados com rendimentos máximos de etanol de 63% e 54% (22 g/L e 19 g/L), respectivamente. A conversão de hemiceluloses da madeira em etanol é viável, porém seu baixo rendimento faz que o processo não seja economicamente atrativo, razão por que melhorias no processo ou usos alternativos das hemiceluloses devem ser avaliados.