The role of Toll-like Receptor (TLR) 9 in the development of a T-helper (Th)1/Th2 response in the murine model of infection with " Leishmania major "

1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RÉSUMÉ Le rôle de la réponse immunitaire innée a longtemps été négligé quant à l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une réponse immune adaptative efficace dirigée contre un pathogène. Si l'importance des récepteurs Toll-like (TLR) du système inné dans la reconnaissance des virus et bactéries a été démontrée, son rôle dans la défense contre les pathogènes eucaryotes reste encore très élusif. Récemment, il a été montré que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la réponse immunitaire innée et adaptative après une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modèle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse Th2 induite par IL-4. La différentiation Th1/Th2 est un événement qui prend place de manière définitive lors de la première semaine après infection. Les événements précoces promouvant le développement d'une réponse Th1 ou Th2 n'étant pas connus, l'objectif de ce travail a été de démontrer un rôle des TLRs dans l'initiation d'une réponse immune innée et adaptative suite à l'infection par L. major. Nous avons démontré que MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est nécessaire pour que les souris résistantes C57BL/6 développent une réponse Th1 protectrice. L'importance du rôle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant été démontrée, nous avons privilégié l'analyse de la réponse immunitaire suite à une infection in vivo de souris déficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond génétique résistant. Les résultats obtenus montrent que la présence de ces récepteurs n'est pas indispensable pour le contrôle de l'infection et la polarisation d'une réponse Th1 caractéristique de la résistance à L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dépendante. L'expression de l'ARNm des différents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et résistantes pendant la première semaine d'infection a été déterminée par PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 était régulé positivement suite à l'infection par L. major chez les souris résistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était détectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rôle des récepteurs TLR7 et TLR9 a donc été évalué par l'infection par L. major des souris déficientes en TLR7 et TLR9 sur fond génétique C57BL/6. Nos résultats ont clairement démontré que les souris déficientes en TLR7 montrent une réponse immunitaire identique à celle des souris résistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au développement d'une Th1 ainsi qu'au contrôle de la parasitémie. Paz contre, les souris déficientes en TLR9 sur un fond génétique résistant ont montré une grande variabilité dans la réponse à l'infection. En effet, la moitié des souris deviennent sensibles à l'infection, ceci étant associé à une diminution dans la production d'IFN-γ et à une augmentation de la production d'IL-4. Ces résultats suggèrent que TLR9 est impliqué dans le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Cependant les résultats avec les souris déficientes en TLR9 montrant une grande hétérogénéité et une balance Th1/Th2 instable, nous avons émis l'hypothèse que les cellules T régulatrices pouvaient être impliquées dans ce phénomène. Nous avons effectivement constaté qu'après déplétion des cellules CD4+CD25+, les souris déficientes en TLR9 développent des lésions aussi grandes que les souris BALB/c après infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le même que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrêment bas. Les mécanismes régulateurs impliqués dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en évidence l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire répandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutanée et de 1 à 1,5 million de nouveaux cas par année. Plus de 12 millions de personnes sont affectées par la maladie et 350 millions de personnes sont une population à risque. Un modèle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a été établi qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observés dans le cas de la leishmaniose cutanée chez l'homme. L'analyse de la réponse immunitaire dans les souris infectées par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse de type Th2. La réponse immune adaptative dans le modèle d'infection avec L. major à été largement étudiée. Cependant, les événements précoces déterminants pour le développement d'une réponse Th1 ou Th2 restent encore très flous. Récemment, plusieurs publications ont montré que les récepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer à l'initiation de la réponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la réponse immune suite à une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement résistantes à l'infection avec L. major deviennent sensibles et développent des lésions importantes. Ces souris ne sont plus capables de développer une réponse Thl, normalement caractéristique de leur phénotype résistant. Nous avons ensuite tenté de comprendre quels TLRs, plus précisément, pouvait être impliqué dans ce processus. Malgré quelques évidences démontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rôle important dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative à Leishmania, nous avons montré que, in vivo après infection avec L. major, la déficience d'un de ces récepteurs n'était pas suffisante à faire basculer la réponse immunitaire. Les souris C57BL/6 déficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrôler l'évolution de la maladie. De plus, ces souris, malgré l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite réponse Thl. Etant donné que TLR2 et TLR4 n'étaient pas essentiels pour la résistance à la maladie, nous avons analysé les TLRs, parmi les 12 décrits qui pouvaient être indispensables au développement d'une réponse de type Th1 associée à la résistance à l'infection par Leishmania. Nos expériences ont montré que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 était modulée suite à l'infection par L. major chez la souris résistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire au parasite, nous avons étudié l'évolution de l'infection dans les souris déficientes en TLR7 et TLR9. Nos résultats ont clairement démontré que TLR7 n'était pas indispensable à la résistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des conséquences radicales sur le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Ce travail révèle ainsi l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. Il est a noté que nos résultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activité adjuvante importante dans la préparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le développement de vaccins thérapeutiques efficaces.

Identification, using a siRNA screen approach, and molecular characterization of a new Fas pathway modulator: STK11/

Abstract : Apoptosis is an evolutionarily conserved cellular suicide mechanism that can be triggered by activation of various pathways, such as the Fas-Pathway. Upon stimulation by its specific ligand (FasL), present at the surface of Cytotoxic Τ lymphocytes, the death receptor Fas initiates a signaling cascade culminating in the activation of cellular caspases, leading thus to cell death of the target cell (e.g. transformed cell). Dysregulation of apoptosis in general, and of Fas pathway in particular, was shown to contribute to pathogenesis of cancers and many human diseases. Even though, during the last decades the molecular mechanisms of apoptosis have been widely studied, it is important to better understand the mechanisms leading to apoptosis, to improve our understanding of pathological processes, and generate more subtle apoptosis-modulating therapies to fight cancer and other diseases. In order to identify new components of the Fas signaling pathway, a screen based on the mechanism of RNA interference was undertaken. After a first and a second manual whole-kinome screen, we identified several strong positive hits that showed a protection against Fas ligand-induced apoptosis with distinct siRNAs, notably STK11, an interesting tumor suppressor mutated in several sporadic and inherited cancers. The STK11 functional characterization reveals that this kinase represents an apically acting general pro-apoptotic modulator of the extrinsic pathway (FasL, TRAIL, TNF-induced apoptosis), but not of the intrinsic apoptotic pathway. The STK11 action on the Fas pathway was shown to be dependent on its kinase activity, but independent of AMPK, a well-characterized STK11 downstream substrate. Furthermore, STK11 was shown to interact with caspase-8, a major mediator of the extrinsic pathway, and modulate its activity through an unclear mechanism that may involve an STK11-dependant caspase-8 phosphorylation. This modification may allow a proper caspase-8 polyubiquitination and activation in p62 sequestosmes aggregates, but may also increase the activation of caspase-8 at the DISC level. In addition, we observed that STK11 modulate not only the apoptotic pathway induced by Fas engagement, but also FasL-induced JNK and NF- KB, sustaining an upstream role of this kinase in the pathway. In conclusion, our report reveals that STK11 is an important pro-apoptotic modulator of the Fas pathway in particular, and extrinsic pathway in general. Our finding could explain, at least partially, why inactivating mutations of the kinase leads to cancer, by allowing resistance to apoptosis and accordingly evasion of immune surveillance. Résumé : L'apoptose est un mécanisme de suicide cellulaire, conservé dans diverses espèces, et qui au niveau moléculaire est déclenché par différentes voies de signalisation, comme par exemple lors de l'activation du récepteur Fas. La liaison du ligand FasL au récepteur de la mort Fas, induit une cascade de signalisation qui conduit à l'activation des caspases. Les lymphocytes Τ cytotoxiques peuvent utiliser la voie Fas pour induire la mort et se débarrasser de cellules dangereuses pour le reste de l'organisme, tel que les cellules transformées. La dysrégulation de l'apoptose en général, et de la voie Fas en particulier, peut contribuer à diverses maladies telles que le cancer. Même si ces dernières décennies, les mécanismes moléculaires conduisant à l'apoptose ont été extensivement étudiés, il reste néanmoins important de mieux comprendre le phénomène d'apoptose, pour améliorer notre compréhension des processus pathologiques, mais surtout dans le but de développer de nouvelles thérapies ciblant l'apoptose contre le cancer et d'autres pathologies. Pour identifier de nouveau constituants de la voie Fas, un criblage génétique basé sur l'interférence à l'ARN a été entrepris. Après un premier et un deuxième criblage d'une librairie du kinome, nous avons identifié différentes protéines qui pourraient jouer un rôle positif dans la voie Fas, et en particulier la protéine suppresseur de tumeur STK11, qui est fréquemment mutée dans divers cancers sporadiques et héréditaires. La caractérisation fonctionnelle de STK11 a révélé que cette kinase était un modulateur apical de la voie extrinsèque de l'apoptose en général (Fas, TNF, TRAIL), mais pas de la voie intrinsèque. L'action de STK11 sur la voie Fas est dépendante de sa fonction kinase, mais indépendante de l'AMPK, un substrat bien caractérisé de STK11. De plus, STK11 interagît avec la caspase-8, un constituant majeur de la voie Fas, et module son activité, par un mécanisme encore peu clair qui pourrait impliquer une phosphorylation de la caspase-8 par STK11. Cette modification pourrait permettre une activation optimale de la caspase-8 en jouant un rôle dans le processus de polyubiquitination de la caspase-8, phénomène qui semble être important pour l'activation de la caspase-8 dans des agrégats protéiques avec p62, mais qui pourrait aussi augmenter son activation au niveau du DISC. Finalement, nous avons observé que STK11 modulait non seulement la voie apoptotique déclenchée par l'activation de Fas, mais aussi les voies non-apoptotiques de Fas, comme JNK et NF-KB. En conclusion notre étude, révèle que STK11 est un important modulateur pro- apoptotique de la voie Fas, et de la voie extrinsèque en général. Cette découverte pourrait expliquer, du moins partiellement, pourquoi les mutations inactivatrices de STK11 conduisent au cancer, par une augmentation de la résistance à l'apoptose et donc par l'évasion de la surveillance immunitaire.

Study of the proteolytic activity of the paracaspase MALT1 in T cell activation

Summary : Several signalling cascades are initiated through the triggering of the T cell receptor (TCR) by an antigenic peptide expressed at the surface of an antigen presenting cell. These pathways lead to morphological changes controlling T cell adhesiveness and migration to the site of infection, and to the activation of transcription factors that regulate key genes for the proper development of the immune response. Amongst them, the nuclear factor xB (NF-κB) is the subject of intense research since more than twenty years because deregulated NF-κB signalling in lymphocytes can lead to immunodeficiency, autoimmunity or lymphomas. Therefore, the understanding of the molecular mechanisms regulating NF-κB activation is important for the development of new therapeutics aimed at treating various diseases. In T lymphocytes, a complex composed of CARMAI, BCL10 and MALT1 relays signals from TCR proximal events to NF-κB activation. Gene translocations of the BCL10 or MALTI genes or oncogenic mutations affecting CARNA 1 result in constitutive NF-κB activation and are related to the development of certain forms of lymphomas. MALT1 contains acaspase-like domain, but it is unknown whether this domain is proteolytically active. In this study, we found that MALT1 has arginine-directed proteolytic activity. We showed that the proteolytic activity of MALT 1 is key to TCR-induced NF-κB activation and production of interleukin 2. We identified BCL 10 as a MALT 1 substrate, and we showed that its cleavage regulates T cell adhesion to the extracellular matrix protein fibronectin. Furthermore, we identified caspase 10 as another substrate of MALT1. caspase 10 is a close homologue of caspase 8 and is known to be involved in the induction of apoptosis upon Fast or TRAIL stimulation. We showed that caspase 10 is important for TCR-induced NF-κB activation and interleukin 2 production, identifying for the first time a non apoptotic function for caspase 10. These data provide evidence for previously uncharacterized roles of MALT 1 and BCL 10 in the regulation of T cell adhesion and of caspase 10 in the activation of lymphocytes, and allow a better understanding of the molecular mechanisms of T lymphocyte activation. Since the proteolytic activity of MALT1 is essential to T cell activation, it suggests that the targeting of this activity may be relevant for the development of immunomodulatory or anticancer drugs. Résumé : De nombreuses voies de signalisation sont initiées via la stimulation des récepteurs des cellules T (TCR) par un peptide antigénique exprimé à la surface d'une cellule présentatrice d'antigènes. Ces cascades de signalisation produisent des changements morphologiques qui contrôlent l'adhésion des cellules T et leur migration vers le site d'infection. Elles contrôlent également l'activation de facteurs de transcription qui régulent la transcription de gènes importants pour la réponse immunitaire. Parmi ces derniers, le facteur nucléaire KB (NF-κB) joue un rôle essentiel, puisqu'une régulation aberrante de son activité dans les lymphocytes peut causer des immunodéficiences, des maladies autoimmunes ou des lymphomes. C'est pour cela que la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l'activation de NF-κB est donc importante pour le développement de nouvelles thérapies. Un complexe contenant les protéines CAIZMAI, BCL10 et MALT1 transmet, dans les lymphocytes T, le signal du TCR vers l'activation de NF-κB. Des translocations des gènes qui codent pour BCL10 et MALTI et des mutations affectant la fonction de CARNAI ont été liées au développement de certaines formes de lymphomes. MALTI contient un domaine qui ressemble au domaine catalytique présent dans les caspases, mais il n'est pas connu si ce domaine a une activité protéolytique. Dans cette étude, nous avons découvert que MALTI est une protéase qui a une spécificité pour les acides aminés basiques comme l'arginine. Nous montrons que l'activité protéolytique de MALTI est importante pour l'activation de NF-κB et la production d'interleukine 2 après stimulation du TCR. Nous avons observé que BCL10 est clivé par MALTI pendant l'activation des lymphocytes T, et que ce clivage est impliqué dans la régulation de l'adhésion des lymphocytes T à la fibronectin, une protéine de la matrice extracellulaire. De plus, nous avons identifié que la caspase 10, qui a une grande homologie avec la caspase 8 et qui jusqu'à maintenant est connue pour son rôle dans l'induction de la mort cellulaire en réponse à une stimulation par Fast ou par TRAIL, est également un substrat de MALT 1. En montrant que la caspase 10 est nécessaire à l' activation de NF-icB et à la production de l'interleukine 2 après stimulation du TCR, nous décrivons pour la première fois une fonction non apoptotique de la caspase 10. Ces résultats décrivent de nouveaux rôles pour MALT1 et BCL10 dans le contrôle de l'adhésion des lymphocytes T et de la caspase 10 pour l'activation des lymphocytes T. Puisque l'activité protéolytique de MALT1 est essentielle pour l'activation des lymphocytes T, nous suggérons que cibler cette activité protéolytique de MALT 1 pourrait amener de nouvelles possibilités de traitement de maladies où une activation aberrante des lymphocytes est impliquée.

Why human islets die? analysis of death signaling pathways during isolation and following cytokine treatments

RESUME Le diabète de type 1 se définit comme un désordre métabolique d'origine auto-immune qui aboutit à la destruction progressive et sélective de la cellule ß-pancréatique sécrétrice d'insuline. Cette maladie représente 10 % des cas de diabète enregistrés dans la population mondiale, et touche les jeunes de moins de 20 ans. Le traitement médical par insulinothérapie corrige le manque d'hormone mais ne prévient pas les nombreuses complications telles que les atteintes cardiaques, neurologiques, rénales, rétiniennes, et les amputations que la maladie provoque. Le remplacement de la cellule ß par transplantation d'îlots de Langerhans est une alternative prometteuse au traitement médical du diabète de type 1. Cependant la greffe d'îlots est encore un traitement expérimental et ne permet pas un contrôle efficace de la glycémie au long terme chez les patients transplantés, et les raisons de cet échec restent mal comprises. L'obstacle immédiat qui se pose est la purification d'un nombre suffisant d'îlots viables et la perte massive de ces îlots dans les premières heures suite à la greffe. Cette tendance presque systématique de la perte fonctionnelle du greffon immédiatement après la transplantation est connue sous le terme de « primary graft non-function » (PNF). En effet, la procédure d'isolement des îlots provoque la destruction des composantes cellulaires et non cellulaires du tissu pancréatique qui jouent un rôle déterminant dans le processus de survie de l'îlot. De plus, la transplantation elle-même expose les cellules à différents stress, notamment le stress par les cytokines inflammatoires qui encourage la mort cellulaire par apoptose et provoque par la suite le rejet de la greffe. L'ensemble de ces mécanismes aboutit a une perte de la masse d'îlot estimée a plus de 60%. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à définir les voies majeures de stress qui régissent cette perte massive d'îlot par apoptose lors du processus d'isolement et suite à l'exposition immédiate aux cytokines. L'ensemble des résultats obtenus indique que plusieurs voies de signalisation intracellulaire sont recrutées qui s'activent de manière maximale très tôt lors des premières phases de l'isolement. La mise en culture des îlots deux jours permet aux voies activées de revenir aux taux de base. De ce fait nous proposons une stratégie dite de protection qui doit être 1) initiée aussitôt que possible lors de l'isolement des îlots pancréatiques, 2) devrait probablement bloquer l'activation de ces différentes voies de stress mis en évidence lors de notre étude et 3) devrait inclure la mise en culture des îlots purifiés deux jours après l'isolement et avant la transplantation. RESUME LARGE PUBLIC Le diabète est une maladie qui entraîne un taux anormalement élevé de sucre (glucose) dans le sang du à une insuffisance du pancréas endocrine à produire de l'insuline, une hormone qui régule la glycémie (taux de glucose dans le sang). On distingue deux types majeurs de diabètes; le diabète de type 1 ou juvénile ou encore appelé diabète maigre qui se manifeste souvent pendant l'enfance et qui se traduit par une déficience absolue en insuline. Le diabète de type 2 ou diabète gras est le plus fréquent, et touche les sujets de plus de 40 ans qui souffrent d'obésité et qui se traduit par une dysfonction de la cellule ß avec une incapacité à réguler la glycémie malgré la production d'insuline. Dans le diabète de type 1, la destruction de la cellule ß est programmée (apoptose) et est majoritairement provoquée par des médiateurs inflammatoires appelés cytokines qui sont produites localement par des cellules inflammatoires du système immunitaire qui envahissent la cellule ß-pancréatiques. Les cytokines activent différentes voies de signalisation parmi lesquelles on distingue celles des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPKs) composées de trois familles de MAPKs: ERK1/2, p38, et JNK, et la voie NF-κB. Le traitement médical par injections quotidiennes d'insuline permet de contrôler la glycémie mais ne prévient pas les nombreuses complications secondaires liées à cette maladie. La greffe d'îlots de Langerhans est une alternative possible au traitement médical, considérée avantageuse comparée a la greffe du pancréas entier. En effet l'embolisation d'îlots dans le foie par injection intraportale constitue une intervention simple sans complications majeures. Néanmoins la technique de préparation d'îlots altère la fonction endocrine et cause la perte massive d'îlots pancréatiques. De plus, la transplantation elle-même expose la cellule ß à différents stress, notamment le stress par les cytokines inflammatoires qui provoque le rejet de greffon cellulaire. Dans la perspective d'augmenter les rendements des îlots purifiés, nous nous sommes intéressés à définir les voies majeures de stress qui régissent cette perte massive d'îlot lors du processus d'isolement et suite à l'exposition immédiate aux cytokines après transplantation. L'ensemble de ces résultats indique que le stress induit lors de l'isolement des îlots et celui des cytokines recrute différentes voies de signalisation intracellulaire (JNK, p38 et NF-κB) qui s'additionnent entre-elles pour altérer la fonction et la viabilité de l'îlot. De ce fait une stratégie doit être mise en place pour bloquer toute action synergique entre ces différentes voies activées pour améliorer la viabilité et la fonction de la cellule ß lors du greffon cellulaire. SUMMARY Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease characterized by the progressive and selective destruction of the pancreatic ß-cells that secrete insulin, leading to absolute insulin deficiency. T1DM accounts for about 10% of all diabetes cases, affecting persons younger than 20 years of age. Medical treatment using daily exogenous insulin injection corrects hormone deficiency but does not prevent devastating complications such as heart attack, neuropathy, kidney failure, blindness, and amputation caused by the disease. Pancreatic islet transplantation (PIT) is one strategy that holds promise to cure patients with T1DM, but purified pancreatic islet grafts have failed to maintain long-term glucose homeostasis in human recipients, the reasons for this failure being still poorly understood. There is however a more immediate problem with islet grafting that is dependent upon poor islet recovery from donors and early islet loss following the first hours of grafting. This tendency of islet grafts to fail to function within a short period after transplantation is termed primary graft non-function (PNF). Indeed, the islet isolation procedure itself destroys cellular and non-cellular components of the pancreas that may play a role in supporting islet survival. Further, islet transplantation exposes cells to a variety of stressful stimuli, notably pro-inflammatory cytokines that encourage ß-cell death by apoptosis and lead to early graft failure. Altogether these mechanisms lead to an estimated loss of 60% of the total islet mass. Here, we have mapped the major intracellular stress signaling pathways that may mediate human islet loss by apoptosis during isolation and following cytokine attack. We found that several stress pathways are maximally activated from the earliest stages of the isolation procedure. Culturing islet for two days allow for the activated pathways to return to basal levels. We propose that protective strategies should 1) be initiated as early as possible during isolation of the islets, 2) should probably target the activated stress pathways that we uncovered during our studies and 3) should include culturing islets for two days post-isolation and prior transplantation.

New insights into the role of microRNAs in pancreatic ß-cell maturation and plasticity

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une élévation du taux de sucre dans le sang aussi appelé « glycémie » reflétant un état pathologique. L'élévation de la glycémie au long cours a des répercussions délétères sur nombreux de nos tissus et organes d'où l'apparition de complications sévères chez les sujets diabétiques pouvant atteindre les yeux, les reins, le système nerveux, le système cardiovasculaire et les membres inférieurs. La carence en une hormone essentielle à notre organisme, l'insuline, est au coeur du développement de la maladie. L'insuline induit la captation du glucose circulant dans le sang en excès suite à une prise alimentaire riche en glucides et favorise son utilisation et éventuellement son stockage dans les tissus tels que le foie, le tissu adipeux et les muscles. Ainsi, l'insuline est vitale pour réguler et maintenir stable notre niveau de glycémie. Les cellules bêta du pancréas sont les seules entités de notre corps capables de produire de l'insuline et une perte de fonctionnalité associée à leur destruction ont été mises en cause dans le processus pathologique du diabète de type 2. Cependant la pleine fonctionnalité et la maturation des cellules bêta n'apparaissent qu'après la naissance lorsque le pancréas en développement a atteint sa masse adulte définitive. Enfin, une fois la masse des cellules bêta définitive établie, leur nombre et volume restent relativement constants au cours de la vie adulte chez un sujet sain. Néanmoins, au cours de périodes critiques les besoins en insuline sont augmentés tel qu'observé chez les femmes enceintes et les personnes obèses qui ont une perte de sensibilité à l'insuline qui se traduit par la nécessité de sécréter plus d'insuline afin de maintenir une glycémie normale. Dans l'hypothèse où la compensation n'a pas lieu ou n'est pas aboutie, le diabète se développe. Le processus de maturation postnatale ainsi que les événements compensatoires sont donc des étapes essentielles et de nombreuses questions sont encore non résolues concernant l'identification des mécanismes les régulant. Parmi les acteurs potentiels figurent de petites molécules d'ARN découvertes récemment appelées microARNs et qui ont été rapidement suggérées très prometteuses dans l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre du diabète et d'autres pathologies. Les microARNs vont réguler l'expression de notre génome sans en modifier la séquence, phénomène également appelé épigénétique, ce qui résulte en des différences de comportement et de fonction cellulaires. Les microARNs sont donc susceptibles de jouer un rôle clé dans l'ensemble des processus biologiques et notre environnement associé à nos prédispositions génétiques peuvent grandement modifier leur niveau et donc leur action, qui à son tour se répercutera sur notre état physiologique. En effet nous avons identifié des changements de microARNs dans les cellules d'îlots pancréatiques de modèles animaux (rats et souris) associés à un état de résistance à l'insuline (grossesse et obésité). Par le biais d'expériences in vitro sur des cellules bêta extraites de rats et conservées en culture, nous avons pu analyser de plus près l'implication des microARNs dans la capacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline mais aussi à se multiplier et à survivre au sein d'un environnement toxique. Ainsi, nous avons identifié des microARNs qui participent positivement à la compensation des cellules bêta, sous la direction d'hormones telles les estrogènes ou d'une hormone libérée par l'intestin au cours de la digestion (l'inerétine GLP1) et qui est largement utilisée comme agent thérapeutique dans la médication contre le diabète. Dans un second temps nous avons utilisé une stratégie similaire afin de déterminer le rôle de microARNs préalablement détectés comme étant changés au cours du développement postnatal des cellules bêta chez le rat. Cette étude a également mené à l'identification de microARNs participant à la maturation et à l'expansion de la masse des cellules bêta sous l'influence de la composition du régime alimentaire et des besoins en insuline adéquats qui en dépendent. Ces études apportent la vision de nouveaux mécanismes moléculaires impliquant les microARNs et démontrant leur importance pour le bon fonctionnement des cellules bêta et leur capacité d'adaptation à l'environnement. -- Les cellules bêta sont une composante des îlots pancréatiques de Langerhans et sont des cellules hautement différenciées qui ont l'unique capacité de sécréter de l'insuline sous l'influence des nutriments suite à une prise alimentaire. L'insuline facilite l'incorporation de glucose dans ses tissus cibles tels le foie, le tissu adipeux et les muscles. Bien que les besoins en insuline soient relativement constants au cours de la vie d'un individu sain, certaines conditions associées à un état de résistance à l'insuline, telles la grossesse ou l'obésité, requièrent une libération d'insuline majorée. En cas de résistance à l'insuline, une dysfonction des cellules bêta plus ou moins associée à leur mort cellulaire, conduisent à une sécrétion d'insuline insuffisante et au développement d'une hyperglycémie chronique, caractéristique du diabète de type 2. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires sous- jacents à la compensation des cellules bêta ou encore menant à leur dysfonction restent peu connus. Découverts récemment, les petits ARNs non-codant appelés microARNs (miARNs), suscitent un intérêt grandissant de par leur potentiel thérapeutique pour la prise en charge et le traitement du diabète. Les miARNs sont de puissants régulateurs de l'expression génique qui lient directement le 3'UTR de leurs ARN messagers cibles afin d'inhiber leur traduction ou d'induire leur dégradation, ce qui leur permet de contrôler des fonctions biologiques multiples. Ainsi, nous avons pris pour hypothèse que les miARNs pourraient jouer un rôle essentiel en maintenant la fonction des cellules bêta et des processus compensatoires afin de prévenir le développement du diabète. Lors d'une première étude, une analyse transcriptomique a permis l'identification de miARNs différemment exprimés au sein d'îlots pancréatiques de rattes gestantes. Parmi eux, le miR-338-3p a démontré la capacité de promouvoir la prolifération et la survie des cellules bêta exposées à des acides gras saturés et des cytokines pro-inflammatoires, sans altérer leur propriété sécrétrice d'insuline. Nous avons également identifié deux hormones reconnues pour leurs propriétés bénéfiques pour la physiologie de la cellule bêta, l'estradiol et l'incrétine GLP1, qui régulent les niveaux du miR-338-3p. Ce miARN intègre parfaitement les voies de signalisation de ces deux hormones dépendantes de l'AMP cyclique, afin de contrôler l'expression de nombreux gènes conduisant à son action biologique. Dans un projet ultérieur, notre objectif était de déterminer la contribution de miARNs dans l'acquisition de l'identité fonctionnelle des cellules bêta en période postnatale. En effet, directement après la naissance les cellules bêta sont reconnues pour être encore immatures et incapables de sécréter de l'insuline spécifiquement en réponse à l'élévation de la glycémie. Au contraire, la réponse insulinique induite par les acides aminés ainsi que la biosynthèse d'insuline sont déjà fonctionnelles. Nos recherches ont permis de montrer que les changements de miARNs corrélés avec l'apparition du phénotype sécrétoire en réponse au glucose, sont régis par la composition nutritionnelle du régime alimentaire et des besoins en insuline qui en découlent. En parallèle, le taux de prolifération des cellules bêta est considérablement réduit. Les miARNs que nous avons étudiés coordonnent des changements d'expression de gènes clés impliqués dans l'acquisition de propriétés vitales de la cellule bêta et dans la maintenancé de son identité propre. Enfin, ces études ont permis de clairement démontrer l'importance des miARNs dans la régulation de la fonction des cellules bêta pancréatiques. -- Beta-cells are highly differentiated cells localized in the pancreatic islets and are characterized by the unique property of secreting insulin in response to nutrient stimulation after meal intake. Insulin is then in charge of facilitating glucose uptake by insulin target tissues such as liver, adipose tissue and muscles. Despite insulin needs stay more or less constant throughout life of healthy individuals, there are circumstances such as during pregnancy or obesity which are associated to insulin resistance, where insulin needs are increased. In this context, defects in beta-cell function, sometimes associated with beta-cell loss, may result in the release of inappropriate amounts of insulin leading to chronic hyperglycemia, properly defined as type 2 diabetes mellitus. So far, the mechanisms underlying beta- cell compensation as well as beta-cell failure remain to be established. The recently discovered small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) are emerging as interesting therapeutic targets and are bringing new hope for the treatment of diabetes. miRNAs display a massive potential in regulating gene expression by directly binding to the 3'UTR of messenger RNAs and by inhibiting their translation and/or stability, enabling them to modify a wide range of biological functions. In view of this, we hypothesized that miRNAs may play an essential role in preserving the functional beta-cell mass and permitting to fight against beta-cell exhaustion and decompensation that can lead to diabetes development. In a first study, global profiling in pancreatic islets of pregnant rats, a model of insulin resistance, led to the identification of a set of differentially expressed miRNAs. Among them, miR-338- 3p was found to promote beta-cell proliferation and survival upon exposure of islet cells to pro- apoptotic stimuli such as saturated fatty acids or pro-inflammatory cytokines, without impairment in their capacity to release insulin. We also discovered that miR-338-3p changes are driven by two hormones, the estradiol and the incretin GLP1, both well known for their beneficial impact on beta- cell physiology. Consistently, we found that miR-338-3p integrates the cAMP-dependent signaling pathways regulated by these two hormones in order to control the expression of numerous genes and execute its biological functions. In a second project, we aimed at determining whether miRNAs contribute to the acquisition of beta-cell identity. Indeed, we confirmed that right after birth beta-cells are still immature and are unable to secrete insulin specifically in response to elevated concentrations of glucose. In contrast, amino acid-stimulated insulin release as well as insulin biosynthesis are already fully functional. In parallel, newborn beta-cells are proliferating intensively within the expanding pancreas. Interestingly, we demonstrated that the miRNA changes and the subsequent acquisition of glucose responsiveness is influenced by the diet composition and the resulting insulin needs. At the same time, beta-cell proliferation declines. The miRNAs that we have identified orchestrate expression changes of essential genes involved in the acquisition of specific beta-cell properties and in the maintenance of a mature beta-cell identity. Altogether, these studies clearly demonstrate that miRNAs play important roles in the regulation of beta-cell function.

Role of Notch signaling in epidermis and appendages

Résumé Dans la peau, il a été montré que Notch1 induit l'arrêt de la prolifération et la différentiation des keratinocytes. L'inactivation de Notch1 cause une hyperplasie de l'épiderme et la formation de carcinomes basaux cellulaires. Notre groupe a principalement identifié deux voies de signalisations, la voie Shh et la voie Wnt, qui sont dérégulées en conséquence de l'inactivation de Notch1 dans la peau. Nous avons démontré l'habilité de Notch1 à réprimer la voie Wnt induite par ß-catenin dans les keratinocytes primaires ainsi que dans d'autres types de cellules épithéliales humaines. De plus, nous avons pu déterminer que Notch1 régule cette voie, probablement en favorisant la phosphorylation de ß-catenin par le complexe axin/APC/GSK-3ß. La protéine faisant partie de la voie Wnt, ou la protéine affectant la voie Wnt, qui est régulée par Notch1 est sujette à de plus amples investigations. Un autre but de cette étude a été l'identification de potentiels gènes cibles de Notch1 autres que ceux faisant partie des voies de signalisation Shh et Wnt précédemment évoquées. Ce projet fut abordé par l'analyse de puces à ADN (ISREC et Affymetrix) qui ont été utilisées pour des expériences de gain et de perte de fonction de Notch1 dans des keratinocytes prúmaires. En plus de l'hyperplasie épidermale, les souris Notch1 déficiente ont une perte importante de poils. Nous avons montré que Notch1 est nécessaire pour le développement et l'homéostasie des follicules pileux. En effet, l'inactivation du gène Notch1 mediée par l'activation des kératines 5 ou 14 dans l'épiderme, cause des défauts du cycle ainsi que de la structure des poils. De plus, d'autres appendices de la peau, comme les glandes sudoripares et de Meibomius, ont une structure anormale et sont non fonctionnelles dans les souris Notch1 déficiente. Finalement, nous avons observé que la déficience de Notch1 dans l'épithélium cornéen mène à la formation d'une plaque épidermale opaque sur la cornée. Basé sur l'hypothèse que le défaut des glandes de Meibomius des souris Notch1 déficientes cause des lésions de la surface oculaire, nous avons montré que Notch1 est essentiel pour la cicatrisation de la cornée. Lorsque Notch1 est absent, les cellules souches de l'épithélium cornéen ne sont plus capables de se différentier en cellules cornéennes, mais réparent la blessure en se différentiant en épiderme. Ce résultat indique que Notch1 est essentiel pour la différentiation de cellules souches de la cornée qui sont spécifiquement impliquées dans la réparation de la cornée. De plus, nous avons montré que l'expression de CRBP1 dans l'épithélium cornéen est diminuée en l'absence de Notch1, ceci étant possiblement à l'origine de la formation de la plaque épidermale. Abstract: In the skin, Notch1 has been shown to trigger cell growth arrest and differentiation of keratinocytes. Notch1 inactivation results in epidermal hyperplasia and subsequent formation of basal cell carcinoma-like (BCC-like) tumors. So far our group has identified two main pathways, the Shh and the Wnt pathway, that are deregulated as a consequence of Notch1 inactivation in the skin. We showed the ability of Notch1 to represses ß-catenin-mediated Wnt signaling in primary keratinocytes as well as in other types of human epithelial cells. In addition we were able to determine that Notch1 regulates this pathway possibly by enhancing ß-catenin phosphorylation by the axin/APC/GSK-3ß complex. The exact target protein of the Wnt pathway or target protein that affects the Wnt pathway, and that is regulated by Notch1, is subject of current investigation. Another aim of this study was the identification of possible Notch1 target genes in addition to those of the Shh and Wnt signaling pathways. This was addressed by gene chip analysis using ISREC as well as Affymetrix microarrays for gain and loss of function of Notch1 in mouse primary keratinocytes. In addition to epidermal hyperplasia, Notch1 deficient mice show an important hair loss. We showed that Notch1 is required for postnatal development and homeostasis of hair follicles. Indeed, keratin5 or keratinl4-driven Cre recombinase-mediated inactivation of the Notch1 gene in the epidermis causes perturbations of the hair cycle and structural defects of the hair follicle. Moreover, other skin appendages, like the sweat and Meibomian glands show abnormal morphology and are not functional in the Notch 1 deficient mice. Finally, we observed that Notch1 deficiency in the corneal epithelium leads to the formation of an epidermal corneal plaque. Based on the hypothesis that the Meiboinian gland defect in the Notch1 deficient mice results in lesions of the eye surface, we showed that Notch1 is essential for wound-healing of the cornea. In absence of Notch1 the stem cells of the corneal epithelium are no longer able to differentiate in the corneal fate but instead repair the wound by differentiating into skin-like epidermis. This result indicated that Notch1 is essential for the differentiation of corneal stem cells specifically implicated in corneal wound-healing. Moreover, we showed that CRBP1 expression in the corneal epithelium was lost in the absence of Notch1, possibly being at the origin of plaque formation.

The tumor suppressive role of WIF1 in glioblastoma

Expression based prediction of gene alterations identified WNT inhibitory factor I (WIF1) as a new candidate tumor suppressor gene involved in glioblastoma. WIF1 encodes a secreted WNT antagonist and it is strongly down-regulated in most glioblastoma as compared to normal brain both by genomic deletion and WIF1 promoter hypermethylation. WIF1 expression in glioblastoma cell lines inhibited cell proliferation in vitro and in vivo and strongly reduced migration capability. Interestingly, WIF1 expression induced a senescence-like phenotype characterized by the appearance of enlarged, flattened and multinucleated cells positive for the presence of senescence associated ß-galactosidase, a late marker of senescence. It is of note that WIF1 induced senescence, in glioma cell lines, is independent of either p53 or pRB, two pathways that have been widely associated with this process. The analysis of the signaling pathways downstream of WIF1 brought some interesting results. WIF1 expression inhibited the canonical pathway but alteration of this pathway alone couldn't explain all the WIFl-induced effects. Some WIF1-related changes were attributed to inhibition of the non-canonical pathway, as we could prove by downregulation of WNT5a, the main ligand of the non-canonical WNT pathway. For example, a drastic reduction of phosphorylation of both ERK and p38 was detected when either overexpressing WIF1 or downregulating WNT5a. Due to the complexity of the non-canonical pathway is difficult to define the precise mechanism of signal transduction. We have excluded the involvement of the WNT5a-JNK-APl pathway and preliminary results suggest the implication of the WNT-calcium signaling, but further evidence is needed. Moreover, from the analysis of the gene expression profile of WIF1 expressing cells we could select a very interesting candidate: MALATI, a non-coding RNA widely associated with migratory capability in many different types of tumors. We found MALATI to be overexpressed in glioblastoma specimens compared to normal brain and to be associated with total tumor volume. The downregulation of MALATI by RNAi (RNA interference] drastically impairs migration, thus it is a very interesting potential target in the context of invasive tumors such as glioblastoma. Résumé WIFl a été sélectionné en tant que putatif suppresseur de tumeurs dans le cadre des glioblastomes par une analyse qui a était conduit à partir des données d'expression de gènes provenant d'environ 80 glioblastomes. WIF1 code pour une protéine destinée à la sécrétion qui antagonise la voie de WNT et son expression est fortement sous-exprimé dans la plupart des glioblastome par rapport à tissu cérébral normal. Cette sous-expression est due à deux mécanismes différents: à la délétion de la partie génomique codant pour WIF1 et à l'hyper méthylation de son promoteur. La surexpression de WIF1 réduit la capacité de prolifération des cellules de glioblastome in vitro ainsi que in vivo et elle réduit aussi leur capacité migratoire. Il est intéressant de remarquer que l'espression de WIF1 induit un phénotype sénescent caractérisé par l'apparition de cellules aplaties, multi nucléées et positives pour l'activité de l'enzyme ß-galactosidase associée à la sénescence, un marqueur tardif de la sénescence. Il est à noter que le phénotype sénescent qui est induit par WIF1 est indépendant de p53 et pRB, deux voies qui ont été largement associées à ce processus. L'analyse des les voies de signalisation en aval de WIFl a apporté des résultats intéressants. L'expression de WIF1 inhibe la voie canonique de WNT, mais l'altération de cette voie seule ne pouvait pas expliquer tous les effets induits par WIF1. Nous avons pu prouver que certains changements sont liés à l'inhibition de la voie non-canonique qui est activée par WNT5cc. Par exemple, une réduction drastique de la phosphorylation de ERK et p38 à la fois a été détectée lorsque WIFl a été surexprimé ou WNT5a sous- exprimé. En raison de la complexité de la voie non-canonique, il est difficile de définir le mécanisme précis de la transduction du signal. Nous avons exclu l'implication de la voie JNK-WNT5a-APl et les résultats préliminaires suggèrent l'implication de la voie de signalisation appelée WNT-calcium. En plus, l'analyse du profil d'expression génique de cellules sur-exprimant WIF1 nous a permis d'identifier un candidat très intéressant: MALATI, un ARN non- codants largement associés à la capacité migratoire dans nombreux types de tumeurs. Nous avons trouvé que MALATI est surexprimé dans les échantillons de glioblastome par rapport à tissu cérébral normal et il est associé au volume total de la tumeur. La sous-expression de MALATI altère considérablement la migration des cellules tumorales. Donc, MALATI, est une cible potentielle très intéressante dans le cadre d'une tumeur invasive telle que le glioblastome.

Role of AP-1 family members in lymphomagenesis

Constitutive activation of the nuclear factor-KB (NF-KB) transcriptional pathway is the main characteristic of the activated B-cell-like (ABC) subtype of diffuse large B- cell lymphoma (DLBCL). This has been attributed to oncogenic mutations in the CARMA1, CD79A/B, MyD88 or RNF31 signaling proteins, which control NF-kB activation at different levels. Since several of these mutations lead to a state that mimics chronically antigen receptor-stimulated B-cells, and since the antigen receptor also triggers other transcription pathways, these might be important in ABC DLBCL malignancy too. In this study we analyzed whether abnormal expression and activity of members of the AP-1 transcription factor family could contribute to the pathogenesis of ABC DLBCL. Here, we identified activation of Jun as well as ATF members of the dimeric AP-1 transcription factor family, as a hallmark of ABC but not of germinal center B- cell-like (GCB) DLBCL cell lines. ABC DLBCL cell lines harbored an upregulated expression of c-Jun, JunB, JunD and ATF3 proteins. We could show that the upregulation of c-Jun, JunB and ATF3 was dependent on constitutive BCR and MyD88 signaling. Since AP-1 transcription factors need to dimerize to be active, Jun binding partners were investigated and we could demonstrate the presence of several ATF/Jun heterodimers (including c-Jun/ATF2, c-Jun/ATF3, c-Jun/ATF7, JunB/ATF2, JunB/ATF3, JunB/ATF7, JunD/ATF2, JunD/ATF3 and JunD/ATF7 heterodimers). The disruption of ATF/Jun heterodimers by A-Fos, a dominant negative form of Jun members, was toxic to ABC but not to GCB DLBCL cell lines. Finally, ATF3 immunohistochemistry on DLBCL patient samples revealed that samples classified as non-GCB had more intense and preferentially nuclear staining of ATF3, which could be of diagnostic relevance since the histological classification of the ABC and GCB DLBCL subtypes is difficult in clinical practice. In conclusion, we could show that ABC DLBCL are not only addicted to NF-KB signaling, but also to signaling by some members of the AP-1 transcription factor family. Thus, the AP-1 pathway might be a promising therapeutic target for the treatment of ABC DLBCL. Additionally, monitoring ATF3 levels could improve the diagnosis of ABC DLBCL by IHC. -- L'activation constitutive du facteur de transcription NF-KB est l'une des caractéristiques principales des lymphomes B du type ABC-DLBCL. Cette addiction est dépendante de mutations oncogéniques de CARMA1, CD79A/B, MyD88 et RNF31 qui contrôlent NF-KB à différents niveaux. Etant donné que la plupart de ces mutations mène à un état d'activation chronique du récepteur des cellules B (BCR) et que le BCR active d'autres voies de signalisation, d'autres facteurs de transcription pourraient être impliqués dans la lymphomagénèse des ABC-DLBCL. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si les membres de la famille du facteur de transcription AP-1 contribuaient à la pathogénèse de ce type de lymphome. Dans des lignées cellulaires de lymphomes du type ABC-DLBCL en comparaison avec le type GCB-DLBCL, nous avons pu identifier une activation anormale de plusieurs membres de la famille Jun et ATF, deux sous-familles du facteur de transcription AP-1. Les lignées cellulaires dérivées de lymphomes du type ABC-DLBCL surexpriment les facteurs de transcription c-Jun, JunB, JunD et ATF3. Leur surexpression dépend de l'activation constitutive de la voie du BCR et de MyD88. Etant donné qu'AP-1 requiert la formation de dimères pour être actif, nous nous sommes intéressés aux partenaires d'interactions de c-Jun, JunB et JunD et avons pu montrer la formation de plusieurs hétérodimères Jun/ATF (incluant les hétérodimères c-Jun/ATF2, c-Jun/ATF3, c-Jun/ATF7, JunB/ATF2, JunB/ATF3, JunB/ATF7, JunD/ATF2, JunD/ATF3 et JunD/ATF7). Lorsque l'on empêche la formation de ces hétérodimères avec A-Fos, un dominant négatif des membres Jun, la survie des lignées cellulaires du type ABC-DLBCL est diminuée, tandis que les lignées cellulaires GCB-DLBCL ne sont pas affectées. Pour finir, des immunohistochimies (IHC) pour ATF3 sur des échantillons de patients classifiés comme GCB et non-GCB ont pu montrer une coloration d'ATF3 nucléaire et beaucoup plus intense que les échantillons du type GCB. Ainsi, ATF3 pourrait être potentiellement utile en clinique pour différencier le sous type non-GCB des GCB. En conclusion, nous avons pu montrer que les lymphomes du type ABC- DLBCL ne présentent pas uniquement une addiction à NF-KB, mais également de certains membres de la famille de facteur de transcription AP-1. Par conséquent, AP- 1 pourrait être une cible thérapeutique prometteuse pour le développement de futures stratégies. En outre, la détermination des niveaux d'ATF3 par IHC pourraient améliorer le diagnostic des patients du type ABC DLBCL.

Regulation of frizzled receptor activity at the plasma membrane : an interplay of the receptor, the trimeric G protein Go, and RGS protein and a scaffolding protein Kermit

G-protein-signaling pathways convey extracellular signals inside the cells and regulate distinct physiological responses. This type of signaling pathways consists of three major components: G-protein-coupled receptors (GPCRs), heterotrimeric G proteins (G-proteins) and downstream effectors. Upon ligand binding, GPCRs activate heterotrimeric G proteins to initiate the signaling cascade. Dysfunction of GPCR signaling correlates with numerous diseases such as diabetes, nervous and immune system deficiency, and cancer. As the signaling switcher, G-proteins (Gs, Gq/11, G12/13, and Gi/o) have been an appealing topic of research for decades. A heterotrimeric G-protein is composed of three subunits, the guanine nucleotide associated a-subunit, ß and y subunits. In general, the duration of signaling is determined by the lifetime of activated (GTP bound) Ga subunits. Identification of novel communication partners of Ga subunits appears to be an attractive way to understand the machinery of GPCR signaling. In our lab, we mainly focus on Gao, which is abundantly expressed in the nervous system. Here we present two novel interacting partners of Drosophila Gao: Dhit and Kermit, identified through yeast two-hybrid screening and genetic screening respectively. Dhit is characterized by a small size with a conserved RGS domain and an N-terminal cysteine rich motif. The RGS domain possesses the GAP (GTPase activating protein) activity towards G proteins. However, we found that Dhit exerts not only the GAP activity but also the GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) activity towards Gao. The unexpected GDI activity is preserved in GAIP/RGS19 - a mammalian homologue of Dhit. Further experiments confirmed the GDI activity of Dhit and GAIP/RGS19 in Drosophila and mammalian cell models. Therefore, we propose that Dhit and its mammalian homologues modulate GPCR signaling by a double suppression of Ga subunits - suppression of their nucleotide exchange with GTP and acceleration of their hydrolysis of GTP. Kermit/GEPC was first identified as a binding partner of GAIP/RGS19 in a yeast two- hybrid screen. Instead of interacting with the Drosophila homologue of GAIP/RGS19 (Dhit), Kermit binds to Gao in vivo and in vitro. The functional consequence of Kermit/Gao interaction is the regulation of localization of Vang (one of the planar cell polarity core components) at the apical membrane. Overall, my work elaborated the action of Gao with its two interaction partners in Gao- mediated signaling pathway. Conceivably, the understanding of GPCR signaling including Gao and its regulators or effectors will ultimately shed light on future pharmaceutical research. - Les voies de signalisation médiées par les protéines G transmettent des signaux extracellulaires à l'intérieur des cellules pour réguler des réponses physiologiques distinctes. Cette voie de signalisation consiste en trois composants majeurs : les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs), les protéines G hétérotrimériques (G-proteins) et les effecteurs en aval. Suite à la liaison du ligand, les GPCRs activent les protéines G hétérotrimériques qui initient la cascade de signalisation. Des dysfonctions dans la signalisation médiée par les GPCRs sont corrélées avec de nombreuses maladies comme le diabète, des déficiences immunes et nerveuses, ainsi que le cancer. Puisque la voie de signalisation s'active et se désactive, les protéines G (Gs, Gq/11, G12/13 et Gi/o) ont été un sujet de recherche attrayant pendant des décennies. Une protéine G hétérotrimérique est composée de trois sous-unités, la sous-unité a associée au nucléotide guanine, ainsi que les sous-unités ß et y. En général, la durée du signal est déterminée par le temps de demi-vie des sous-unités Ga activées (Ga liées au GTP). Identifier de nouveaux partenaires de communication des sous-unités Ga se révèle être un moyen attractif de comprendre la machinerie de la signalisation par les GPCRs. Dans notre laboratoire nous nous sommes concentrés principalement sur Gao qui est exprimée de manière abondante dans le système nerveux. Nous présentons ici deux nouveaux partenaires qui interagissent avec Gao chez la drosophile: Dhit et Kermit, qui ont été identifiés respectivement par la méthode du yeast two-hybrid et par criblage génétique. Dhit est caractérisé par une petite taille, avec un domaine RGS conservé et un motif N- terminal riche en cystéines. Le domaine RGS contient une activité GAP (GTPase activating protein) pour les protéines G. Toutefois, nous avons découvert que Dhit exerce non seulement une activité GAP mais aussi une activité GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) à l'égard de Gao. Cette activité GDI inattendue est préservée dans RGS19 - un homologue de Dhit chez les mammifères. Des expériences supplémentaires ont confirmé l'activité GDI de Dhit et de RGS19 chez Drosophila melanogaster et les modèles cellulaires mammifères. Par conséquent, nous proposons que Dhit et ses homologues mammifères modulent la signalisation GPCR par une double suppression des sous-unités Ga - suppression de leur nucléotide d'échange avec le GTP et une accélération dans leur hydrolyse du GTP. Kermit/GIPC a été premièrement identifié comme un partenaire de liaison de RGS19 dans le criblage par yeast two-hybrid. Au lieu d'interagir avec l'homologue chez la drosophile de RGS19 (Dhit), Kermit se lie à Gao in vivo et in vitro. La conséquence fonctionnelle de l'interaction Kermit/Gao est la régulation de la localisation de Vang, un des composants essentiel de la polarité planaire cellulaire, à la membrane apicale. Globalement, mon travail a démontré l'action de Gao avec ses deux partenaires d'interaction dans la voie de signalisation médiée par Gao. La compréhension de la signalisation par les GPCRs incluant Gao et ses régulateurs ou effecteurs aboutira à mettre en lumière de futurs axes dans la recherche pharmacologique.

Blunting the response to endotoxin in healthy sujects : effects of various dose of intravenous fish oil

Enjeux et contexte La recherche de cette dernière décennie sur les acides gras n-3 PUFA contenus dans l'huile de poisson a montré que ceux-ci, et particulièrement l'ΕΡΑ et le DHA, avaient des propriétés anti¬inflammatoires et anti arythmiques puissantes, potentiellement utiles chez les septiques et « cardiaques ». Les mécanismes sous-jacents sont nombreux, incluant l'incorporation des acides gras dans les membranes de phopholipides, la réduction de la production de médiateurs pro-inflammatoires (prostaglandines, leukotrienes, thromboxane), l'augmentation de la production de résolvines et protectines dérivées du DHA, et la régulation de voies de signalisation cellulaire. Cependant, les doses de n-3 PUFA utilisées dans les études cliniques et chez le sujet sain avant le travail de Yann-Karim Pittet étaient nettement supérieures aux doses nutritionnelles de l'ordre de 5-8 g/j par voie orale ou 1 g/kg par voie intraveineuse. De plus, la voie entérale avait la réputation de nécessiter plusieurs jours à semaines de traitement avant d'aboutir à une incorporation d'acides gras membranaire suffisante pour avoir un impact clinique; quant au temps minimal requis pour obtenir cet effet par voie IV, il était inconnu. Depuis, le développement d'émulsions lipidiques intraveineuses destinées à la nutrition parentérale a permis d'imaginer l'administration de prétraitements IV rapides. Pour les étudier, notre laboratoire a développé un modèle d'endotoxine (LPS d'E.Coli) qui mime les réponses physiologique, endocrinienne et biologique du sepsis chez le sujet sain, utilisant des doses de 2 ng/kg IV. Les réponses sont totalement réversibles en 8 heures. Dans le but de réduire à la fois la dose de lipides et le temps de perfusion, ce travail a étudié l'influence de 3 doses dégressives de n-3 PUFA sur les réponses à l'endotoxine, et sur l'incorporation membranaire de ces acides gras. Méthodes Etude prospective chez 3 groupes consécutifs de sujets sains soumis à un challenge d'endotoxine. Intervention : perfusions d'huile de poisson (0.5 et 0.2 g/kg de n-3 PUFA, Omegaven® 10%) ou placebo, administrées en 3 heures ou en 1 heure, soit le jour avant ou le jour-même du test d'endotoxine. Mesures : variables physiologiques (T°, fc, tension artérielle, calorimétrie indirecte) Laboratoire - prises de sang à T0, 60, 120 et 360 min après l'injection de LPS: TNF-α, hs-CRP, hormones de stress, composition en acides gras des membranes plaquettaires. Statistiques Les résultats ont été rapportés en moyennes et écarts types. Des aires sous la courbe (AUC) ont été calculées avec la méthode des parallélépipèdes pour toutes les variables déterminées de manière répétée. L'effet du temps a été exploré par des two-way ANOVA pour mesures répétées. Les comparaisons post-hoc ont été réalisées avec des tests de Dunnett's ou de Scheffe. Les modifications de composition membranaires ainsi que les AUC ont été analysées par des tests non-paramétriques (Kruskal-Wallis). Résultats Après LPS, la température, les concentrations d'ACTH et TNF-α ont augmenté dans les 3 groupes. Ces réponse ont été significativement atténuées (p<0.0001) par l'huile de poisson comparé à ce que nous avions observé dans le groupe contrôle de Pluess et al (ICM 2007). Les concentrations les plus faibles d'ACTH, de TNF-α, et les AUC les plus basses des températures, ont été observées après une dose unique de 0.2 g/kg de n-3 PUFA administrée 1 heure avant le LPS. Par contre, l'incorporation membranaire d'EPA est dose-dépendante. Conclusions Sachant que la réponse à l'endotoxine est reproductible, cette étude montre que 3 doses différentes d'huile de poisson atténuent de manière différente cette réponse. La perfusion de 0.2 g/kg administrée juste avant l'endotoxine s'est avérée la plus efficace à atténuer la réponse fébrile, les cytokines et les hormones de stress, suggérant une capture de l'endotoxine par l'émulsion lipidique qui se surajoute aux effets systémiques et membranaires.

Sensing pheromones : a role for the CNGA4 and TRPC2 proteins

Chez les mammifères, les phéromones sont des molécules clés dans la régulation des comportements sociaux au sein d'une espèce. Chez la souris, la détection de ces molécules se fait dans l'organe voméronasal (VNO] et implique le canal TRPC2 afin de dépolariser les neurones. Des différences de comportement entre des souris Trpc2-/- et des souris sans VNO suggèrent l'implication d'une autre protéine effectrice dans la voie de signalisation des phéromones. L'hypothèse étant que cette protéine formerait un canal hétéromérique avec TRPC2. CNGA4 est une protéine sans fonction connue dans le VNO des rongeurs. Elle appartient à la famille des protéines CNG qui joue un rôle important dans différentes voies de signalisation comme la vision ou l'olfaction. Etant donné sa présence dans le VNO, son rôle inconnu dans cet organe et son rôle important dans de nombreuses voies de signalisation, nous avons décidé d'étudier CNGA4 afin de connaître sa localisation, ses propriétés ou encore sa structure. Nous avons découvert que CNGA4 est exprimée dans les axons, les neurones immatures ainsi que sur les microvillosités des neurones de VNO. A l'aide de souris portant une version non fonctionnelle de CNGA4, nous avons pu montrer que cette protéine joue un rôle majeur dans la voie de signalisation des phéromones. Ainsi, les neurones du VNO portant une version non fonctionnelle de CNGA4 répondent moins fréquemment aux phéromones et par conséquent les phéromones activent également moins de neurones dans le bulbe olfactif accessoire, premier relais du VNO avec le cortex. Cette détection défaillante se traduit par une absence d'agressivité des souris mutantes ainsi que par une incapacité de ces souris à discriminer le sexe de leur conspécifique. Etant donné les propriétés similaires de CNGA4 et de TRPC2, nous avons supposé que les deux protéines pourraient interagir. Cette hypothèse a été confortée par l'observation que CNGA4 n'est plus exprimée dans les microvillosités du VNO des souris Trpc2-/-. A l'aide d'expériences d'expression hétérologue, nous avons pu observer que les deux protéines interagissent et forment un canal activé par un analogue du diacylglycérol suggérant que ce canal est fonctionnel. Ces résultats indiquent que CNGA4 formerait un canal hétéromérique avec TRPC2 et aurait dans ce canal une fonction modulatrice. Des expériences complémentaires sont nécessaires afin de connaître le rôle de chacune de ces protéines dans la voie de signalisation des phéromones. Sensing pheromones: a role for the CNGA4 and TRPC2 proteins Mammalian pheromones are key chemical signals in the regulation of intraspecies social behaviors. Detection of these pheromones, which takes place in sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO), implies the activation of the transient receptor potential canonical channel 2 (TRPC2) as the final effector. Interestingly, discrepancies between Trpc2 /- mice and mice lacking a VNO suggest the implication of another protein in the pheromone signaling pathway. This protein could either form a heteromeric channel with TRPC2 or a separate homomeric ion channel. The cyclic nucleotide-gated channel subunit CNGA4 is also expressed in the rodent VNO but its role and properties in this organ remain unknown. CNGA4 belongs to the CNG channel family which is playing an important role in different sensory pathways such as in light and odorant detection. We thus decided to study the role of the CNGA4 protein in the mouse VNO. We found CNGA4 to be expressed in axons, dendrites and in the sensory microvilli. Using mice bearing a non-functional form of CNGA4 we further demonstrated the importance of the CNGA4 protein for the pheromone signaling pathway as neurons from mutant mice were responding less frequently to chemosensory cues. As a result, mutant mice displayed a non-aggressive behavior and an impaired sexual discrimination ability. Based on the CNGA4 localization and its role in the pheromone signaling pathway we hypothesized a possible interaction between CNGA4 and TRPC2 forming a heteromeric channel. First evidences for this interaction came from the absence of CNGA4 expression in the sensory microvilli of Trpc2-/- mice. Second, using transfected HEK cells as an expression system we could observe that CNGA4 and TRPC2 interact and translocate to the plasma membrane. Perfusion of a DAG analogue on co-transfected HEK cells resulted in a strong calcium entry suggesting that the two proteins form a functional channel. These results might suggest a modulatory role for CNGA4 in a heteromeric TRPC2+CNGA4 ion channel. Further experiments will give more insights on the combined role of these transduction ion channels in pheromone detection.

Metastatic leishmaniasis. A chronic inflammatory response to Leishmania's viral endosymbiont.

Leishmania parasites have been plaguing humankind for centuries as a range of skin diseases named the cutaneous leishmaniases (CL). Carried in a hematophagous sand fly, Leishmania usually infests the skin surrounding the bite site, causing a destructive immune response that may persist for months or even years. The various symptomatic outcomes of CL range from a benevolent self- healing reddened bump to extensive open ulcerations, resistant to treatment and resulting in life- changing disfiguration. Many of these more aggressive outcomes are geographically isolated within the habitats of certain Neotropical Leishmania species; where about 15% of cases experience metastatic complications. However, despite this correlation, genetic analysis has revealed no major differences between species causing the various disease forms. We have recently identified a cytoplasmic dsRNA virus within metastatic L. guyanensis parasites that acts as a potent innate immunogen capable of worsening lesionai inflammation and prolonging parasite survival. The dsRNA genome of Leishmania RNA virus (LRV) binds and stimulates Toll-Like-Receptor-3 (TLR3), inducing this destructive inflammation, which we speculate as a factor contributing to the development of metastatic disease. This thesis establishes the first experimental model of LRV-mediated leishmanial metastasis and investigates the role of non-TLR3 viral recognition pathways in LRV-mediated pathology. Viral dsRNA can be detected by various non-TLR3 pattern recognition receptors (PRR); two such PRR groups are the RLRs (Retinoic acid-inducible gene 1 like receptors) and the NLRs (nucleotide- binding domain, leucine-rich repeat containing receptors). The RLRs are designed to detect viral dsRNA in the cytoplasm, while the NLRs react to molecular "danger" signals of cell damage, often oligomerizing into molecular scaffolds called "inflammasomes" that activate a potent inflammatory cascade. Interestingly, we found that neither RLR signalling nor the inflammasome pathway had an effect on LRV-mediated pathology. In contrast, we found a dramatic inflammasome independent effect for the NLR family member, NLRP10, where a knockout mouse model showed little evidence of disease. This phenotype was mimicked in an NLR knockout with which NLRP10 is known to interact: NLRC2. As this pathway induces the chronic inflammatory cell lineage TH17, we investigated the role of its key chronic inflammatory cytokine, IL-17A, in human patients infected by L. guyanensis. Indeed, patients infected with LRV+ parasites had a significantly increased level of IL-17A in lesionai biopsies. Interestingly, LRV presence was also associated with a significant decrease in the correlate of protection, IFN-y. This association was repeated in our murine model, where after we were able to establish the first experimental model of LRV-dependent leishmanial metastasis, which was mediated by IL-17A in the absence of IFN-y. Finally, we tested a new inhibitor of IL-17A secretion, SR1001, and reveal its potential as a Prophylactic immunomodulator and potent parasitotoxic drug. Taken together, these findings provide a basis for anti-IL-17A as a feasible therapeutic intervention to prevent and treat the metastatic complications of cutaneous leishmaniasis. -- Les parasites Leishmania infectent l'homme depuis des siècles causant des affections cutanées, appelées leishmanioses cutanées (LC). Le parasite est transmis par la mouche des sables et réside dans le derme à l'endroit de la piqûre. Au niveau de la peau, le parasite provoque une réponse immunitaire destructrice qui peut persister pendant des mois voire des années. Les symptômes de LC vont d'une simple enflure qui guérit spontanément jusqu' à de vastes ulcérations ouvertes, résistantes aux traitements. Des manifestations plus agressives sont déterminées par les habitats géographiques de certaines espèces de Leishmania. Dans ces cas, environ 15% des patients développent des lésions métastatiques. Aucun «facteur métastatique» n'a encore été trouvé à ce jour dans ces espèces. Récemment, nous avons pu identifier un virus résidant dans certains parasites métastatiques présents en Guyane française (appelé Leishmania-virus, ou LV) et qui confère un avantage de survie à son hôte parasitaire. Ce virus active fortement la réponse inflammatoire, aggravant l'inflammation et prolongeant l'infection parasitaire. Afin de diagnostiquer, prévenir et traiter ces lésions, nous nous sommes intéressés à identifier les composants de la voie de signalisation anti-virale, responsables de la persistance de cette inflammation. Cette étude décrit le premier modèle expérimental de métastases de la leishmaniose induites par LV, et identifie plusieurs composants de la voie inflammatoire anti-virale qui facilite la pathologie métastatique. Contrairement à l'homme, les souris de laboratoire infectées par des Leishmania métastatiques (contenant LV, LV+) ne développent pas de lésions métastatiques et guérissent après quelques semaines d'infection. Après avoir analysé un groupe de patients atteints de leishmaniose en Guyane française, nous avons constaté que les personnes infectées avec les parasites métastatiques LV+ avaient des niveaux significativement plus faibles d'un composant immunitaire protecteur important, appelé l'interféron (IFN)-y. En utilisant des souris génétiquement modifiées, incapables de produire de l'IFN-y, nous avons observé de telles métastases. Après inoculation dans le coussinet plantaire de souris IFN-y7" avec des parasites LV+ ou LV-, nous avons démontré que seules les souris infectées avec des leishmanies ayant LV développent de multiples lésions secondaires sur la queue. Comme nous l'avons observé chez l'homme, ces souris sécrètent une quantité significativement élevée d'un composant inflammatoire destructeur, l'interleukine (IL)-17. IL-17 a été incriminée pour son rôle dans de nombreuses maladies inflammatoires chroniques. On a ainsi trouvé un rôle destructif similaire pour l'IL-17 dans la leishmaniose métastatique. Nous avons confirmé ce rôle en abrogeant IL-17 dans des souris IFN-y7- ce qui ralentit l'apparition des métastases. Nous pouvons donc conclure que les métastases de la leishmaniose sont induites par l'IL-17 en absence d'IFN-v. En analysant plus en détails les voies de signalisation anti-virale induites par LV, nous avons pu exclure d'autres voies d'activation de la réponse inflammatoire. Nous avons ainsi démontré que la signalisation par LV est indépendante de la signalisation inflammatoire de type « inflammasome ». En revanche, nous avons pu y lier plusieurs autres molécules, telles que NLRP10 et NLRC2, connues pour leur synergie avec les réponses inflammatoires. Cette nouvelle voie pourrait être la cible pour des médicaments inhibant l'inflammation. En effet, un nouveau médicament qui bloque la production d'IL-17 chez la souris s'est montré prometteur dans notre modèle : il a réduit le gonflement des lésions ainsi que la charge parasitaire, indiquant que la voie anti-virale /inflammatoire est une approche thérapeutique possible pour prévenir et traiter cette infection négligée.

Regulation of sodium transport in the cortical collecting duct : physiological role of GILZ in vitro and in vivo : characterisation of Na+ transport in the mCCDcl1 cell line

SUMMARY Regulation of sodium excretion by the kidney is a key mechanism in the long term regulation of blood pressure, and when altered it constitutes a risk factor for the appearance of arterial hypertension. Aldosterone, which secretion depends upon salt intake in the diet, is a steroid hormone that regulates sodium reabsorption in the distal part of the nephron (functional unit of the kidney) by modulating gene transcription. It has been shown that it can act synergistically with the peptidic hormone insulin through the interaction of their signalisation pathways. Our work consisted of two distinct parts: 1) the in vitro and in vivo characterisation of Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper (GILZ) (an aldosterone-induced gene) mechanism of action; 2) the in vitro characterisation of insulin mechanism of action and its interaction with aldosterone. GILZ mRNA, coded by the TSC22D3 gene, is strongly induced by aldosterone in the cell line of principal cells of the cortical collecting duct (CCD) mpkCCDc14, suggesting that GILZ is a mediator of aldosterone response. Co-expression of GILZ and the amiloride-sensitive epithelial sodium channel ENaC in vitro in the Xenopus oocyte expression system showed that GILZ has no direct effect on the ENaC-mediated Na+ current in basal conditions. To define the role of GILZ in the kidney and in other organs (colon, heart, skin, etc.), a conditional knock-out mouse is being produced and will allow the in vivo study of its role. Previous data showed that insulin induced a transepithelial sodium transport at supraphysiological concentrations. Insulin and the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) are able to bind to each other receptor with an affinity 50 to 100 times lower than to their cognate receptor. Our starting hypothesis was that the insulin effect observed at these supraphysiological concentrations is actually mediated by the IGF receptor type 1 (IGF-1R). In a new cell line that presents all the characteristics of the principal cells of the CCD (mCCDc11) we have shown that both insulin and IGF-1 induce a physiologically significant increase of Na+ transport through the activation of IGF-1R. Aldosterone and insulin/IGF-1 have an additive effect on Na+ transport, through the activation of the PI3-kinase (PI3-K) pathway and the phosphorylation of the serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (Sgk1) by the IGF-1R, and the induction of Sgk1 expression by aldosterone. Thus, Sgk1 integrates IGF-1/insulin and aldosterone effects. We suggest that IGF-1 is physiologically relevant in the modulation of sodium balance, while insulin can only regulate Na+ transport at supraphysiological conditions. Both hormones would bind to the IGF-1R and induce Na+ transport by activating the PI3-K PDK1/2 - Sgk1 pathway. We have shown for the first time that Sgk1 is expressed and phosphorylated in principal cells of the CCD in basal conditions, although the mechanism that maintains Sgk1 phosphorylation is not known. This new role for IGF-1 suggests that it could be a salt susceptibility gene. In effect, IGF-1 stimulates Na+ and water transport in the kidney in vivo. Moreover, 35 % of the acromegalic patients (overproduction of growth hormone and IGF-1) are hypertensives (higher proportion than in normal population), and genetic analysis suggest a link between the IGF-1 gene locus and blood pressure. RÉSUMÉ La régulation de l'excrétion rénale de sodium (Na+) joue un rôle principal dans le contrôle à long terme de la pression sanguine, et ses altérations constituent un facteur de risque de l'apparition d'une hypertension artérielle. L'aldosterone, dont la sécrétion dépend de l'apport en sel dans la diète, est une hormone stéroïdienne qui régule la réabsorption de Na+ dans la partie distale du nephron (unité fonctionnelle du rein) en contrôlant la transcription de gènes. Elle peut agir de façon synergistique avec l'hormone peptidique insuline, probablement via l'interaction de leurs voies de signalisation cellulaire. Le but de notre travail comportait deux volets: 1) caractériser in vitro et in vivo le mécanisme d'action du Glucocorticoid Induced Leucine Zipper (GILZ) (un gène induit par l'aldosterone); 2) caractériser in vitro le mécanisme d'action de l'insuline et son interaction avec l'aldosterone. L'ARNm de GILZ, codé par le gène TSC22D3, est induit par l'aldosterone dans la lignée cellulaire de cellules principales du tubule collecteur cortical (CCD) mpkCCDc14, suggérant que GILZ est un médiateur potentiel de la réponse à l'aldosterone. La co-expression in vitro de GILZ et du canal à Na+ sensible à l'amiloride ENaC dans le système d'expression de l'oocyte de Xénope a montré que GILZ n'a pas d'effet sur les courants sodiques véhiculées par ENaC en conditions basales. Une souris knock-out conditionnelle de GILZ est en train d'être produite et permettra l'étude in vivo de son rôle dans le rein et d'autres organes. Des expériences préliminaires ont montré que l'insuline induit un transport transépithelial de Na+ à des concentrations supraphysiologiques. L'insuline et l'insulin-like growth factor 1 (IGF-1) peuvent se lier à leurs récepteurs réciproques avec une affinité 50 à 100 fois moindre qu'à leur propre récepteur. Nous avons donc proposé que l'effet de l'insuline soit médié par le récepteur à l'IGF type 1 (IGF-1R). Dans une nouvelle lignée cellulaire qui présente toutes les caractéristiques des cellules principales du CCD (mCCDc11) nous avons montré que les deux hormones induisent une augmentation physiologiquement significative du transport du Na+ par l'activation des IGF-1 R. Aldosterone et insuline/IGF-1 ont un effet additif sur le transport de Na+, via l'activation de la voie de la PI3-kinase et la phosphorylation de la serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (Sgk1) par l'IGF-1R, dont l'expression est induite par l'aldosterone. Sgk1 intègre les effets de l'insuline et l'aldosterone. Nous proposons que l'IGF-1 joue un rôle dans la modulation physiologique de la balance sodique, tandis que l'insuline régule le transport de Na+ à des concentrations supraphysiologiques. Les deux hormones agissent en se liant à l'IGF-1R et induisent le transport de Na+ en activant la cascade de signalisation PI3-K - PDK1/2 - Sgk1. Nous avons montré pour la première fois que Sgk1 est exprimée et phosphorylée dans des conditions basales dans les cellules principales du CCD, mais le mécanisme qui maintient sa phosphorylation n'est pas connu. Ce nouveau rôle pour l'IGF-1 suggère qu'il pourrait être un gène impliqué de susceptibilité au sel. Aussi, l'IGF-1 stimule le transport rénal de Na+ in vivo. De plus, 35 % des patients atteints d'acromégalie (surproduction d'hormone de croissance et d'IGF-1) sont hypertensifs (prévalence plus élevée que la population normale), et des analyses génétiques suggèrent un lien entre le locus du gène de l'IGF-1 et la pression sanguine. RÉSUMÉ GRAND PUBLIC Nos ancêtres se sont génétiquement adaptés pendant des centaines de millénaires à un environnement pauvre en sel (chlorure de sodium) dans la savane équatoriale, où ils consommaient moins de 0,1 gramme de sel par jour. On a commencé à ajouter du sel aux aliments avec l'apparition de l'agriculture (il y a 5000 à 10000 années), et aujourd'hui une diète omnivore, qui inclut des plats préparés, contient plusieurs fois la quantité de sodium nécessaire pour notre fonction physiologique normale (environ 10 grammes par jour). Le corps garde sa concentration constante dans le sang en s'adaptant à une consommation très variable de sel. Pour ceci, il module son excrétion soit directement, soit en sécrétant des hormones régulatrices. Le rein joue un rôle principal dans cette régulation puisque l'excrétion urinaire de sel change selon la diète et peut aller d'une quantité dérisoire à plus de 36 grammes par jour. L'attention qu'on prête au sel est liée à sa relation avec l'hypertension essentielle. Ainsi, le contrôle rénal de l'excrétion de sodium et d'eau est le principal mécanisme dans la régulation de la pression sanguine, et une ingestion excessive de sel pourrait être l'un des facteurs-clé déclenchant l'apparition d'un phénotype hypertensif. L'hormone aldosterone diminue l'excrétion de sodium par le rein en modulant l'expression de gènes qui pourraient être impliqués dans la sensibilité au sel. Dans une lignée cellulaire de rein l'expression du gène TSC22D3, qui se traduit en la protéine Glucocorticoid Induced Leucine Zipper (GILZ), est fortement induite par l'aldosterone. Ceci suggère que GILZ est un médiateur potentiel de l'effet de l'aldosterone, et pourrait être impliqué dans la sensibilité au sel. Pour analyser la fonction de GILZ dans le rein plusieurs approches ont été utilisées. Par exemple, une souris dans laquelle GILZ est spécifiquement inactivé dans le rein est en train d'être produite et permettra l'étude du rôle de GILZ dans l'organisme. De plus, on a montré que GILZ, en conditions basales, n'a pas d'effet direct sur la protéine transportant le sodium à travers la membrane des cellules, le canal sodique épithélial ENaC. On a aussi essayé de trouver des protéines qui interagissent directement avec GILZ utilisant une technique appelée du « double-hybride dans la levure », mais aucun candidat n'a émergé. Des études ont montré que, à de hautes concentrations, l'insuline peut aussi diminuer l'excrétion de sodium. A ces concentrations, elle peut activer son récepteur spécifique, mais aussi le récepteur d'une autre hormone, l'Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1). En plus, l'infusion d'IGF-1 augmente la rétention rénale de sodium et d'eau, et des mutations du gène codant pour l'IGF-1 sont liées aux différents niveaux de pression sanguine. On a utilisé une nouvelle lignée cellulaire de rein développée dans notre laboratoire, appelée mCCDc11, pour analyser l'importance relative des deux hormones dans l'induction du transport de sodium. On a montré que les deux hormones induisent une augmentation significative du transport de sodium par l'activation de récepteurs à l'IGF-1 et non du récepteur à l'insuline. On a montré qu'à l'intérieur de la cellule leur activation induit une augmentation du transport sodique par le biais du canal ENaC en modifiant la quantité de phosphates fixés sur la protéine Serumand Glucocorticoid-induced Kinase 1 (Sgk1). On a finalement montré que l'IGF-1 et l'aldosterone ont un effet additif sur le transport de sodium en agissant toutes les deux sur Sgk1, qui intègre leurs effets dans le contrôle du transport de sodium dans le rein.

Characterization of GLUT8 and GLUT9, two novel glucose transporter isoforms

Summary Prevalence of type 2 diabetes is increasing worldwide at alarming rates, probably secondarily to that of obesity. As type 2 diabetes is characterized by blood hyperglycemia, controlling glucose entry into tissues from the bloodstream is key to maintain glycemia within acceptable ranges. In this context, several glucose transporter isoforms have been cloned recently and some of them have appeared to play important regulatory roles. Better characterizing two of them (GLUT8 and GLUT9) was the purpose of my work. The first part of my work was focused on GLUT8, which is mainly expressed in the brain and is able to transport glucose with high affinity. GLUT8 is retained intracellularly at basal state depending on an N-terminal dileucine motif, thus implying that cell surface expression may be induced by extracellular triggers. In this regard, I was interested in better defining GLUT8 subcellular localization at basal state and in finding signals promoting its translocation, using an adenoviral vector expressing a myc epitope-tagged version of the transporter, thus allowing expression and detection of cell-surface GLUT8 in primary hippocampal neurons and PC 12 cells. This tool enabled me to found out that GLUT8 resides in a unique compartment different from lysosomes, endoplasmic reticulum, endosomes and the Golgi. In addition, absence of GLUT8 translocation following pharmacological activation of several signalling pathways suggests that GLUT8 does not ever translocate to the cell surface, but would rather fulfill its role in its unique intracellular compartment. The second part of my work was focused on GLUT9, which -contrarily to GLUT8 - is unable to transport glucose, but retains the ability to bind glucose-derived cross-linker molecules, thereby suggesting that it may be a glucose sensor rather than a true glucose transporter. The aim of the project was thus to define if GLUT9 triggers intracellular signals when activated. Therefore, adenoviral vectors expressing GLUTS were used to infect both ßpancreatic and liver-derived cell lines, as GLUTS is endogenously expressed in the liver. Comparison of gene expression between cells infected with the GLUTS-expressing adenovirus and cells infected with a GFP-expressing control adenovirus ended up in the identification of the transcription factor HNF4α as being upregulated in aGLUT9-dependent manner. Résumé La prévalence du diabète de type 2 augmente de façon alarmante dans le monde entier, probablement secondairement à celle de l'obésité. Le diabète de type 2 étant caractérisé par une glycémie sanguine élevée, l'entrée du glucose dans les tissus depuis la circulation sanguine constitue un point de contrôle important pour maintenir la glycémie à des valeurs acceptables. Dans ce contexte, plusieurs isoformes de transporteurs au glucose ont été clonées récemment et certaines d'entre elles sont apparues comme jouant d'importants rôles régulateurs. Mieux caractériser deux d'entre elles (GLUT8 et GLUT9) était le but de mon travail. La première partie de mon travail a été centrée sur GLUT8, qui est exprimé principalement dans le cerveau et qui peut transporter le glucose avec une haute affinité. GLUT8 est retenu intracellulairement à l'état basal de façon dépendante d'un motif dileucine N-terminal, ce qui implique que son expression à la surface cellulaire pourrait être induite par des stimuli extracellulaires. Dans cette optique, je me suis intéressé à mieux définir la localisation subcellulaire de GLUT8 à l'état basal et à trouver des signaux activant sa translocation, en utilisant comme outil un vecteur adénoviral exprimant une version marquée (tag myc) du transporteur, me permettant ainsi d'exprimer et de détecter GLUT8 à la surface cellulaire dans des neurones hippocampiques primaires et des cellules PC12. Cet outil m'a permis de montrer que GLUT8 réside dans un compartiment unique différent des lysosomes, du réticulum endoplasmique, des endosomes, ainsi que du Golgi. De plus, l'absence de translocation de GLUT8 à la suite de l'activation pharmacologique de plusieurs voies de signalisation suggère que GLUT8 ne transloque jamais à la membrane plasmique, mais jouerait plutôt un rôle au sein même de son compartiment intracellulaire unique. La seconde partie de mon travail a été centrée sur GLUT9, lequel -contrairement à GLUT8 -est incapable de transporter le glucose, mais conserve la capacité de se lier à des molécules dérivées du glucose, suggérant que ce pourrait être un senseur de glucose plutôt qu'un vrai transporteur. Le but du projet a donc été de définir si GLUT9 active des signaux intracellulaires quand il est lui-même activé. Pour ce faire, des vecteurs adénoviraux exprimant GLUT9 ont été utilisés pour infecter des lignées cellulaires dérivées de cellules ßpancréatiques et d'hépatocytes, GLUT9 étant exprimé de façon endogène dans le foie. La comparaison de l'expression des gènes entre des cellules infectées avec l'adénovirus exprimant GLUT9 et un adénovirus contrôle exprimant la GFP a permis d'identifier le facteur de transcription HNF4α comme étant régulé de façon GLUT9-dépendante. Résumé tout public Il existe deux types bien distincts de diabète. Le diabète de type 1 constitue environ 10 des cas de diabète et se déclare généralement à l'enfance. Il est caractérisé par une incapacité du pancréas à sécréter une hormone, l'insuline, qui régule la concentration sanguine du glucose (glycémie). Il en résulte une hyperglycémie sévère qui, si le patient n'est pas traité à l'insuline, conduit à de graves dommages à divers organes, ce qui peut mener à la cécité, à la perte des membres inférieurs, ainsi qu'à l'insuffisance rénale. Le diabète de type 2 se déclare plus tard dans la vie. Il n'est pas causé par une déficience en insuline, mais plutôt par une incapacité de l'insuline à agir sur ses tissus cibles. Le nombre de cas de diabète de type 2 augmente de façon dramatique, probablement à la suite de l'augmentation des cas d'obésité, le surpoids chronique étant le principal facteur de risque de diabète. Chez l'individu sain, le glucose sanguin est transporté dans différents organes (foie, muscles, tissu adipeux,...) où il est utilisé comme source d'énergie. Chez le patient diabétique, le captage de glucose est altéré, expliquant ainsi l'hyperglycémie. Il est ainsi crucial d'étudier les mécanismes permettant ce captage. Ainsi, des protéines permettant l'entrée de glucose dans la cellule depuis le milieu extracellulaire ont été découvertes depuis une vingtaine d'années. La plupart d'entre elles appartiennent à une sous-famille de protéines nommée GLUT (pour "GLUcose Transporters") dont cinq membres ont été caractérisés et nommés selon l'ordre de leur découverte (GLUT1-5). Néanmoins, la suppression de ces protéines chez la souris par des techniques moléculaires n'affecte pas totalement le captage de glucose, suggérant ainsi que des transporteurs de glucose encore inconnus pourraient exister. De telles protéines ont été isolées ces dernières années et nommées selon l'ordre de leur découverte (GLUT6-14). Durant mon travail de thèse, je me suis intéressé à deux d'entre elles, GLUT8 et GLUT9, qui ont été découvertes précédemment dans le laboratoire. GLUT8 est exprimé principalement dans le cerveau. La protéine n'est pas exprimée à la surface de la cellule, mais est retenue à l'intérieur. Des mécanismes complexes doivent donc exister pour déplacer le transporteur à la surface cellulaire, afin qu'il puisse permettre l'entrée du glucose dans la cellule. Mon travail a consisté d'une part à définir où se trouve le transporteur à l'intérieur de la cellule, et d'autre part à comprendre les mécanismes capables de déplacer GLUT8 vers la surface cellulaire, en utilisant des neurones exprimant une version marquée du transporteur, permettant ainsi sa détection par des méthodes biochimiques. Cela m'a permis de montrer que GLUT8 est localisé dans une partie de la cellule encore non décrite à ce jour et qu'il n'est jamais déplacé à la surface cellulaire, ce qui suggère que le transporteur doit jouer un rôle à l'intérieur de la cellule et non à sa surface. GLUT9 est exprimé dans le foie et dans les reins. Il ressemble beaucoup à GLUT8, mais ne transporte pas le glucose, ce qui suggère que ce pourrait être un récepteur au glucose plutôt qu'un transporteur à proprement parler. Le but de mon travail a été de tester cette hypothèse, en comparant des cellules du foie exprimant GLUT9 avec d'autres n'exprimant pas la protéine. Par des méthodes d'analyses moléculaires, j'ai pu montrer que la présence de GLUT9 dans les cellules du foie augmente l'expression de HNF4α, une protéine connue pour réguler la sécrétion d'insuline dans le pancréas ainsi que la production de glucose dans le foie. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre par quels mécanismes GLUT9 influence l'expression de HNF4α dans le foie, ainsi que de définir l'importance de GLUT9 dans la régulation de la glycémie chez l'animal entier.

The role of MIC-1/GDF15 cytokine in glioblastoma

AbstractDespite advances in diagnosis and treatment made over the past two decades, high-gradeprimary brain tumors remain incurable neoplasms. Glioblastoma (GBM) represents the mostmalignant stage of astrocytic brain tumors. Identification of diagnostic and prognostic markers ineasily accessible biological material, such as plasma or cerebro-spinal fluid (CSF), would greatlyfacilitate the management of GBM patients. Elucidation of the molecular mechanisms that underlie thefunction of the factors implicated in GBM development would pave the way towards their potentialutility in cancer-targeting therapy.MIC-1/GDF15 (Macrophage Inhibitory Cytokine-1/ Growth Differentiation Factor 15), asecreted protein of the TGF-β superfamily, emerged as a candidate marker exhibiting increasingmRNA expression during astrocytoma malignant progression. However, injection of MIC-1/GDF15over-expressing GBM cell lines into nude mice has been previously shown to completely abolish theinherent tumorigenicity.In this study, determination of MIC-1/GDF15 protein levels in the CSF of a cohort of 94patients with intracranial tumors including astrocytomas (grades II, III and IV), meningioma, andmetastasis revealed significantly increased concentrations in GBM patients as compared to controlcohort of patients treated for non-neoplastic diseases. However, MIC-1/GDF15 levels were notelevated in the matching plasma samples from these patients. Most interestingly, GBM patients withthe increased concentrations of MIC-1/GDF15 in the CSF had worse outcome.In GBM tissue, it was found that the expression of MIC-1/GDF15 gene is low. Promotermethylation of the gene may partially explain the overall low expression levels. Investigation of thecellular origin of MIC-1/GDF15 expression in GBM tissue led to the MIC-1/GDF15 protein detectionin a subpopulation of the tumor infiltrating macrophages. These findings substantiated the workinghypothesis of MIC-1/GDF15 as harboring tumor-suppressive properties in GBM. Analysis of thesignaling pathway mediated by MIC-1/GDF15 in GBM highlighted the potential role of TGF-β signaltransduction. However, the lack of the functional response to the presence of MIC-1/GDF15 in-vitrosuggested operation of a paracrine loop for suppression of tumor formation which is evident solely invivo.In conclusion, MIC-1/GDF15 protein measured in the CSF may have diagnostic andprognostic values in patients with intracranial tumors. Molecular studies collectively proposeimplication of the tumor-host interactions in mediating the MIC-1/GDF15 tumor-suppressing activityduring GBM development.RésuméMalgré les progrès durant ces deux dernières décennies dans le diagnostique et le traitementdes tumeurs du cerveau primaires, ces néoplasmes restent incurables. Le glioblastome représente laforme la plus maligne des tumeurs astrocytiques du cerveau (astrocytomes). Pour le diagnostic et lepronostic, l'identification de marqueurs présents dans des substances facilement accessibles comme leplasma où le liquide céphalorachidien (LCR) faciliterait beaucoup la prise en charge des patients. Lacompréhension des mécanismes moléculaires de facteurs impliqués dans le développement du GBMpourrait ouvrir la voie vers l'utilisation de ces mécanismes dans des thérapies ciblées.MIC-1/GDF15 (Macrophage Inhibitory Cytokine-1/ Growth Differentiation Factor 15), uneprotéine secrétée qui appartient à la superfamille TGF-β, s'est révélé être un marqueur candidat, dontl'expression d'ARN messager augmente pendant la progression des astrocytomes malins. Cependant,une précedente étude montre que l'injection des lignées cellulaires de GBM fortement productrices deMIC-1/GDF15 dans des souris immunodéprimées abolit la tumorigénicité.Dans cette étude, les mesures dans une cohorte de 94 patients atteints de tumeursintracrâniennes comprenant des astrocytomes (grades II, III et IV), méningiomes et métastases,présentent des augmentations significatives des niveaux protéiques de MIC-1/GDF15 dans le LCRdes patients atteints de GBM par rapport aux patients traités pour des maladies non cancéreuses.Cependant, les niveaux de MIC-1/GDF15 n'étaient pas spécialement élevés dans le plasma. De plus,les patients atteints d'un GBM avec des niveaux élevés de MIC-1/GDF15 dans le LCR ont survécumoins longtemps. Dans les tissus de glioblastome, on observe que le gène MIC-1/GDF15 est peuexprimé. La méthylation du promoteur explique partiellement le faible niveau d'expression du gène.La recherche l'origine cellulaire de l'expression de MIC-1/GDF15, a permis de découvrir la présencede protéines MIC-1/GDF15 dans une sous-population de macrophages qui infiltrent les tumeurs. Cetteobservation supporte l'hypothèse que MIC-1/GDF15 présentait des propriétés de suppression destumeurs de type GBM. Des études sur les voies de signalisation régulées par MIC-1/GDF15 dans lesGBMs ont souligné l'importance de la voie de transduction du signal TGF-β. Cependant, l'absence deréponse fonctionnelle à MIC-1/GDF15 in vitro suggère fortement l'activité d'une boucle paracrinepour la répression de la formation de tumeur, qui n'est observé que in vivo.En conclusion, la protéine MIC-1/GDF15 mesurée dans le LCR pourrait avoir une valeur pourle diagnostic et le pronostic chez les patients atteints de GBM. Les études moléculaires suggèrent unepossible implication de l'interaction hôte-tumeur dans l'activité anti-tumorale de MIC-1/GDF15 sur leGBM.