Efeitos dos ácidos húmicos provenientes de aterro sanitário em plantas

O processo de tratamento biológico dos lixiviados de aterros sanitários resulta na geração de grandes quantidades de lodo, caracterizados por conterem altas taxas de matéria orgânica. Por meio do fracionamento químico da matéria orgânica são obtidos os ácidos húmicos (AH), fração de comprovada eficiência sobre o crescimento vegetal, promovendo melhorias no desenvolvimento das plantas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar quimicamente os AH extraídos do lodo de lixiviado de aterro sanitário e avaliar os efeitos da aplicação de diferentes doses dos AH por meio de análises biológicas em plantas, visando minimizar os potenciais riscos da utilização do lodo in natura. Por meio de caracterizações químicas, o ácido húmico apresentou elevados teores de carbono e nitrogênio, podendo constituir uma importante fonte de nutrientes para as plantas. Além disso, foram observadas alterações nas taxas de absorção, na bioconcentração e na translocação de alguns nutrientes. Com relação à análise das enzimas antioxidantes, foi possível observar aumento na atividade de algumas enzimas com a aplicação de diferentes doses de AH. Além disto, foram constatadas alterações citogenéticas por meio da análise de células meristemáticas e F1 de Allium cepa. Influências sobre o crescimento da planta também são reportadas, por meio de aumentos expressivos na área radicular e na altura de Zea mays. Em geral, os dados de crescimento revelaram um maior investimento da planta na parte aérea, provavelmente associado com a melhor eficiência do sistema radicular. Além disso, também foram reportadas alterações na espessura da epiderme. Neste contexto, apesar dos benefícios nutricionais e da comprovada atuação dos AH sobre o metabolismo vegetal, os seus efeitos biológicos sobre enzimas do estresse oxidativo e a sua capacidade citotóxica precisam ser melhor investigados. Devido à complexidade do resíduo, a utilização de análises químicas, genéticas, enzimáticas, fisiológicas e anatômicas foi uma importante ferramenta para a avaliação da possível aplicação dos ácidos húmicos em plantas.

Avaliação da proteção conferida pela via de sinalização do Nrf2 num modelo experimental de sobrecarga de ferro in vivo

O ferro é encontrado em praticamente todos os seres vivos, sendo um cofator para proteínas que desempenham funções essenciais à vida. Nos mamíferos, a maioria do ferro está incorporada na hemoglobina ou armazenado no fígado, ligado à ferritina. É absorvido pelos enterócitos, sendo a principal forma de controlo dos seus níveis. A sobrecarga de ferro pode levar a hemocromatose, podendo ser tóxica para vários órgãos. O fator de transcrição Nrf2 é importante na ativação de genes citoprotetores em situações de stress oxidativo/eletrofílico, colocando-se a hipótese de que poderá estar envolvido na resposta à progressão de doença devido à sobrecarga de ferro. Com o objetivo de determinar se a via do Nrf2 representa uma proteção contra a toxicidade do ferro a nível hepático, foram realizadas duas experiências nas quais murganhos C57BL/6 (B6) e Nrf2-/- machos foram alimentados com dieta standard ou com dieta enriquecida em ferro carbonilo (FeC) (0,5% ou 2,0%). Os resultados demonstram sobrecarga de ferro nos animais que receberam dieta enriquecida, sendo que os que receberam FeC 2,0% apresentaram níveis mais elevados de ferro hepático e sérico, bem como da saturação da transferrina. Os murganhos Nrf2-/- são mais suscetíveis a esta acumulação, mostrando evidências patológicas mais graves, nomeadamente necrose hepatocítica e infiltração de células inflamatórias. A deleção do Nrf2 associado a uma dieta suplementada com FeC 2,0% parece não ser suficiente para o desenvolvimento de fibrose hepática. O estudo da expressão de genes e proteínas do metabolismo do ferro mostrou que os animais B6 e Nrf2-/- são igualmente capazes de responder à sobrecarga de ferro, sugerindo que a sua diferente suscetibilidade à toxicidade do ferro não se deverá a uma regulação ineficiente da homeostasia do Fe. A dieta com FeC 2,0% aumentou a expressão de dois genes alvo do Nrf2, Nqo1 e Gsta1, o que não se verificou com os genes e proteínas GCLC e GCLM. A expressão de genes pró-inflamatórios não mostrou evidências de inflamação nestes animais. Foi demonstrado que os animais Nrf2-/- são mais suscetíveis à toxicidade do ferro, concluindo-se que a via do Nrf2 é ativada em resposta a uma dieta contendo quantidades excessivas de FeC e que confere proteção contra a acumulação de ferro em murganhos B6.

Polimorfismo I/D do gene da enzima conversora da angiotensina

Em Portugal, no ano de 2009, existiam 983 mil indivíduos com Diabetes mellitus (DM), dos quais 90% DM tipo 2 (DM2). Um dos principais factores de risco para o desenvolvimento da DM2 é a obesidade. A DM2 está, desta forma, associada a um estilo de vida sedentário, quer pela diminuição do metabolismo da glicose, quer pela sua associação à obesidade devido ao aumento dos níveis de glicose como consequência da sobrealimentação. Outros factores como a lipotoxicidade e o stress oxidativo também têm sido considerados como responsáveis pela disfunção das células-beta pancreáticas. O gene da enzima conversora da angiotensina (ECA) é altamente polimórfico, sendo associado como factor predisponente para diferentes patologias como a DM. O polimorfismo melhor descrito até à actualidade é o de Inserção/Delecção (I/D), consistindo na inserção de um fragmento Alu de 287bp no intrão 16 do gene DCP1. A actividade pró-inflamatória e pró-oxidativa desta enzima sobre o pâncreas, bem como a sua actuação nos processos de fibrose, podem em parte auxiliar na compreensão do processo que origina esta patologia. O polimorfismo I/D torna-se assim um óptimo candidato para a detecção de indivíduos susceptíveis.Este estudo tem como objectivo analisar a distribuição do polimorfismo I/D, bem como a sua possível relação com a incidência de DM e com os níveis de glicose.

Depleção do DNA mitocondrial (mtDNA) em leucócitos de doentes com doença Machado-Joseph : um estudo piloto

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, 5 de Outubro de 2015, Universidade dos Açores.

Exposição ocupacional a mercúrio: associação com a atividade da paraoxonase humana e vitaminas A e E

Mestrado em Segurança e Higiene no Trabalho

Síntese de uma biblioteca de derivados de indole com potencial actividade antioxidante e inibição selectiva da COX‐2

Os compostos indólicos constituem uma extensa e larga família de compostos presentes em bactérias, plantas e animais, sendo alvo de especial interesse nas áreas tanto da química biológica como na da química medicinal. O triptofano, aminoácido essencial para o Homem, constitui um importante exemplo de derivados de indole. Outros exemplos, derivados desta importante estrutura, são o ácido indole‐3‐acético (hormona presente nas plantas) e a melatonina (hormona segregada pela glândula pineal). Uma importante característica dos compostos derivados do indole é que estes podem ser úteis como fármacos usados no tratamento da inflamação (por exemplo,indometacina, acemetacina, etodolac), assim como no tratamento de doenças associadas ao stress oxidativo, como o cancro e doenças neurodegenerativas. Com o intuito de estudar a relação estrutura‐actividade sintetizou‐se uma biblioteca de derivados de indole e, posteriormente, avaliou‐se a actividade antioxidante dos compostos preparados usando como espécie reactiva de oxigénio o radical peroxilo. Todos os compostos testados, à excepção de um, revelaram actividade. Os resultados obtidos contribuirão para o design racional de futuras gerações de bibliotecas. Foram, ainda, desenvolvidos estudos sintéticos para a preparação de um potencial inibidor selectivo da COX‐2.

Modulação do estado redox em bactérias por quinoxalinas

As quinoxalinas são compostos heterocíclicos que têm, entre outras, capacidades antimicrobianas, inclusivamente contra bactérias resistentes aos antimicrobianos convencionais. Os mecanismos pelos quais estes compostos exercem a sua atividade ainda não está completamente esclarecido. O objetivo do presente estudo é avaliar o efeito redox em sinergismo/antagonismo com as quinoxalinas em modelos de bactérias com e sem resistências a antimicrobianos. No que se refere aos compostos foram utilizados a quinoxalina 1,4-dióxido (QNX), 2-metil-3-benzilquinoxalina-1,4-dióxido (2M3BQNX), 2-metilquinoxalina-1,4-dióxido (2MQNX) e a 2-amino-3-cianoquinoxalina-1,4-dióxido (2A3CQNX). Quanto aos modelos procariotas, foram utilizados a Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300, Escherichia coli TEM 201 e Escherichia coli TEM 180. Nos compostos químicos em que se verificou a Concentração Mínima Inibitória (CMI), realizou-se o estudo do comportamento do crescimento bacteriano. Relativamente ao estado redox, foi avaliado para cada estirpe sensível, através do rácio GSH/GSSG, nas doses inibitórias e não inibitórias de cada composto. Os resultados apresentam que todos os compostos testados, à exceção do 2M3BQNX, têm atividade antimicrobiana na maioria das estirpes, excetuando a E. faecalis e a S. saprophyticus. Os rácios GSH/GSSG apontam para o efeito oxidante em K. pneumoniae e S. enterica e antioxidante na E. aerogenes. A conclusão do estudo sugere que os compostos apresentam elevada capacidade antibacteriana e influência no equilíbrio redox das bactérias, podendo contribuir para o esclarecimento do mecanismo de ação dos derivados das quinoxalinas 1-4 dióxido, nas bactérias.

Síndrome de apneia hipopneia obstrutiva do sono e óxido nítrico : que relação ?

RESUMO: A síndrome de apneia hipopneia obstrutiva do sono (SAHOS), pela sua prevalência e consequências clínicas, nomeadamente as de natureza cardiovascular, é actualmente considerada um problema de saúde pública. A patogénese da doença cardiovascular na SAHOS não está ainda completamente estabelecida, mas parece ser multifactorial, envolvendo diversos mecanismos que incluem a hiperactividade do sistema nervoso simpático, a disfunção endotelial, a activação selectiva de vias inflamatórias, o stress oxidativo vascular e a disfunção metabólica. A terapêutica com CPAP diminui grandemente o risco de eventos cardiovasculares fatais e não fatais. O CPAP está inequivocamente indicado para o tratamento da SAHOS grave, no entanto, não é consensual a sua utilização nos doentes com SAHOS ligeira/moderada sem hipersonolência diurna associada. Tendo em conta este facto, é fundamental que as indicações terapêuticas do CPAP nestes doentes tenham uma relação custo-eficácia favorável. Assim, dado o posicionamento do estado da arte relativamente ao estudo da disfunção endotelial e da activação do sistema nervoso simpático estar centrada maioritariamente nos doentes com SAHOS grave, desenvolvemos este estudo com o objectivo de comparar os níveis plasmáticos de nitratos, os níveis de catecolaminas urinárias e os valores de pressão arterial nos doentes com SAHOS ligeira/moderada e grave e avaliar a resposta destes parâmetros ao tratamento com CPAP durante um mês. Realizámos um estudo prospectivo, incidindo sobre uma população de 67 doentes do sexo masculino com o diagnóstico de SAHOS (36 com SAHOS ligeira/moderada e 31com SAHOS grave). O protocolo consistia em 3 visitas: antes da terapêutica com CPAP (visita 1), uma semana após CPAP (visita 2) e um mês após CPAP (visita 3). Nas visitas 1 e 3, eram submetidos a três colheitas de sangue às 11 pm, 4 am e 7 am para doseamento dos nitratos plasmáticos e na visita 2 apenas às 7 am. Nas visitas 1 e 3 era também efectuada uma colheita de urina de 24 horas para o doseamento das catecolaminas urinárias e eram submetidos a uma monitorização ambulatória da pressão arterial de 24 horas (MAPA). Foi ainda estudado um grupo controlo de 30 indivíduos do sexo masculino não fumadores sem patologia conhecida e sem evidência de SAHOS. Antes da terapêutica com CPAP, verificou-se uma diminuição significativa dos níveis de nitratos ao longo da noite quer nos doentes com SAHOS ligeira/moderada, quer nos doentes com SAHOS grave. No entanto, esta redução diferia nos 2 grupos de doentes, sendo significativamente superior nos doentes com SAHOS grave (27,6±20,1% vs 16,5±18,5%; p<0,05). Após um mês de tratamento com CPAP, verificou-se um aumento significativo dos valores de nitratos plasmáticos apenas nos doentes com SAHOS grave, mantendo-se os níveis de nitratos elevados ao longo da noite, já não existindo o decréscimo desses valores ao longo da mesma. Os valores de noradrenalina basais eram significativamente superiores nos doentes com SAHOS grave comparativamente com os doentes com SAHOS ligeira/moderada (73,9±30,1μg/24h vs 48,5±19,91μg/24h; p<0,05). Após um mês de terapêutica com CPAP, apenas se verificou uma redução significativa nos valores da noradrenalina nos doentes com SAHOS grave (73,9±30,1μg/24h para 55,4±21,8 μg/24h; p<0,05). Os doentes com SAHOS grave apresentaram valores de pressão arterial mais elevados do que os doentes com SAHOS ligeira/moderada, nomeadamente no que diz respeito aos valores de pressão arterial média, sistólica média de 24 horas, diurna e nocturna e diastólica média de 24 horas, diurna e nocturna. Após um mês de terapêutica com CPAP, verificou-se uma redução significativa dos valores tensionais apenas nos doentescom SAHOS grave, para a pressão média (-2,32+5,0; p=0,005), para a sistólica média de 24 horas (-4,0+7,9mmHg; p=0,009), para a pressão sistólica diurna (-4,3+8,8mmHg; p=0,01), para a pressão sistólica nocturna (-5,1+9,0mmHg; p=0,005), para a pressão diastólica média de 24 horas (-2,7+5,8mmHg; p=0,016), para a pressão diastólica diurna (-3,2+6,3mmHg; p=0,009) e para a pressão diastólica nocturna (-2,5+7,0mmHg; p=0,04). Os níveis tensionais dos doentes com SAHOS grave após CPAP atingiram valores semelhantes aos dos doentes com SAHOS ligeira/moderada, relativamente a todos os parâmetros avaliados no MAPA. Este estudo demonstrou que antes do tratamento com CPAP, existe uma redução dos níveis de nitratos ao longo da noite não só nos doentes com SAHOS grave mas também nos doentes com SAHOS ligeira/moderada. No entanto, a terapêutica com CPAP leva a um aumento significativo dos valores de nitratos plasmáticos apenas nos doentes com SAHOS grave, mantendo-se os níveis de nitratos elevados ao longo da noite, já não existindo o decréscimo desses valores ao longo da mesma. O tratamento com CPAP durante um mês, apenas reduz os níveis de noradrenalina urinária e os valores de pressão arterial nos doentes com SAHOS grave.------------ ABSTRACT: In severe obstructive sleep apnea (OSA) reduced circulating nitrate, increased levels of urinary norepinephrine (U-NE) and changes in systemic blood pressure (BP) have been described and are reverted by Continuous Positive Airway Pressure (CPAP). However, the consequences of mild/moderate OSA on these parameters and the CPAP effect upon them are not well known. We aimed to: 1) compare the levels of plasma nitrate (NOx) and U-NE of mild/moderate and severe male OSA patients 2) compare BP in these patient groups; and 3) determine whether CPAP improves sympathetic dysfunction, nitrate deficiency and BP in these patients. This prospective study was carried out in 67 consecutive OSA patients (36 mild/moderate and 31 severe patients) and NOx (11 pm, 4 am, 7 am), 24-h U-NE and ambulatory blood pressure monitoring were obtained before and after 4 weeks of CPAP. Baseline: NOx levels showed a significant decrease (p<0.001) during the night in both groups of patients. The U-NE and BP were significantly higher in the severe group. Post CPAP: After one month of CPAP, there was a significant increase of NOx, a reduction of U-NE and BP only in severe patients. This study shows that in contrast to severe OSA patients, those with mild/moderate OSA, which have lower values of BP and U-NE at baseline, do not benefit from a 4 weeks CPAP treatment as measured by plasma nitrate, 24-h U-NE levels and BP.

Avaliação do papel da glutationa e do vacúolo como mecanismos de defesa contra a toxicidade induzida pelo chumbo na levedura Saccharomyces cerevisiae

A presença de metais pesados no meio ambiente deve-se, principalmente, a actividades antropogénicas. Ao contrário do Cu e do Zn, que em baixas concentrações são essenciais para o normal funcionamento celular, não se conhece para o chumbo nenhuma função biológica. O chumbo apresenta efeitos tóxicos, e considerado possível agente carcinogéneo, sendo classificado como poluente prioritário pela Agencia de Protecção Ambiental dos EUA (US-EPA). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel da glutationa e do vacúolo, como mecanismos de defesa, contra os efeitos tóxicos induzidos pelo chumbo, usando como modelo a levedura Saccharomyces cerevisiae. A levedura S. cerevisiae quando exposta a varias concentrações de chumbo, durante 3h, perde a viabilidade e acumula espécies reativas de oxigénio (ROS). O estudo comparativo da perda de viabilidade e acumulação de ROS em células de uma estirpe selvagem (WT) e de estirpes mutantes, incapazes de produzir glutationa devido a uma deficiência no gene GSH1 (gsh1) ou GSH2 (gsh2) mostrou que as estirpes gsh1 ou(gsh2 não apresentavam um aumento da sensibilidade ao efeito toxico do chumbo. No entanto, o tratamento de células da estirpe WT com iodoacetamida (um agente alquilante que induz a depleção de glutationa) aumentou a sensibilidade das células a presença de chumbo. Pelo contrário, o enriquecimento em GSH, através da incubação de células WT com glucose e uma mistura de aminoácidos que constituem a GSH (acido L-glutâmico, L-cisteína e glicina), reduziu o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. A importância do vacúolo, como mecanismo de defesa, foi avaliada através da utilização de um mutante sem qualquer estrutura vacuolar (vps16) ou de mutantes deficientes na subunidade catalítica A (vma1) ou B (vma2) ou no proteolítico - subunidade C (vma3) da V-ATPase. As células da estirpe ƒ´vps16 apresentaram uma elevada suscetibilidade a presença de chumbo. As células das estirpes deficientes na subunidade A, B ou c da V-ATPase, apresentaram uma maior perda de viabilidade, quando expostas a chumbo, do que as células da estirpe WT, mas menor do que a da estirpe vps16 Em conclusão, os resultados obtidos, no seu conjunto, sugerem que a glutationa esta envolvida na defesa contra a toxicidade provocada por chumbo; todavia, a glutationa, por si só, parece não ser suficiente para suster o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. O vacúolo parece constituir um importante mecanismo de defesa contra a toxicidade provocada por chumbo. A V-ATPase parece estar envolvida na compartimentação de chumbo no vacúolo.

Variante Bética da Glucose-6-Fosfato-Desidrogenase: a Propósito de um Caso Clínico

O défice de Glucose-6-fosfato Desidrogenase (G6PD) é, provavelmente, a mutação clinicamente significativa mais frequente a nível mundial, sendo Portugal um país de baixa prevalência (cerca de 0,51%). A G6PD é o enzima que catalisa o primeiro passo na via das pentoses fosfato transformando a glicose- 6- fosfato em 6- fosfogluconato com redução do NADP a NADPH. Apesar de ser expressa em todos os tecidos, a sua deficiência apenas se faz sentir nos eritrocitos, levando a hemólise dos mesmos em situações de stress oxidativo. Já foram descritas mais de 400 variantes da G6PD. Os autores apresentam um caso de uma mulher portadora da variante Bética da G6PD, sendo a doença manifestada por favismo.

Síntese selectiva de moléculas com potencial interesse biológico. Desenvolvimento de metodologias sustentáveis

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química Sustentável pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Monóxido de carbono como agente protector num modelo de hipóxia-isquémia e reperfusão através da activação da autofagia

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Mecanismos de inflamação brônquica resultantes da exposição a factores ambientais

RESUMO Tratando-se a asma de uma doença respiratória, desde há várias décadas que tem sido abordada a hipótese de que factores ambientais, nomeadamente os relacionados com a qualidade do ar inalado, possam contribuir para o seu agravamento. Para além dos aeroalergenos, outros factores ambientais como a poluição atmosférica estarão associados às doenças respiratórias. O ar respirado contém uma variedade de poluentes atmosféricos, provenientes quer de fontes naturais quer de origem antropogénica, nomeadamente de actividades industriais, domésticas ou das emissões de veículos. Estes poluentes, tradicionalmente considerados como um problema de foro ambiental, têm sido cada vez mais encarados como um problema de saúde pública. Também a qualidade do ar interior, tem sido associada a queixas respiratórias, não só em termos ocupacionais mas também em exposições domésticas. Dentro dos principais poluentes, encontramos a matéria particulada (como as PM10), o O3, NO2, e os compostos orgânicos voláteis (COVs). Se é verdade que os três primeiros têm como principais fontes de exposição a combustão fóssil associada aos veículos automóveis, já os COVs (como o benzeno, tolueno, xileno, etilbenzeno e formaldeído) são poluentes mais característicos do ar interior. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à agressão dos poluentes do ar não se encontram convenientemente esclarecidos. Pensa-se que após a sua inalação, induzam um grau crescente de stress oxidativo que será responsável pelo desenvolvimento da inflamação das vias aéreas. A progressão do stress oxidativo e da inflamação, associarse- ão posteriormente a lesão local (pulmonar) e sistémica. Neste trabalho pretendeu-se avaliar os efeitos da exposição individual a diversos poluentes, do ar exterior e interior, sobre as vias aéreas, recorrendo a parâmetros funcionais, inflamatórios e do estudo do stress oxidativo. Neste sentido, desenvolveu-se um estudo de painel na cidade de Viseu, em que foram acompanhadas durante 18 meses, 51 crianças com história de sibilância, identificadas pelo questionário do estudo ISAAC. As crianças foram avaliadas em quatro Visitas (quatro medidas repetidas), através de diversos exames, que incluíram execução de espirometria com broncodilatação, medição ambulatória do PEF, medição de FENO e estudo do pH no condensado brônquico do ar exalado. O estudo dos 8-isoprostanos no condensado brônquico foi efectuado somente em duas Visitas, e o do doseamento de malonaldeído urinário somente na última Visita. Para além da avaliação do grau de infestação de ácaros do pó do colchão, para cada criança foi calculado o valor de exposição individual a PM10, O3, NO2, benzeno, tolueno, xileno, etilbenzeno e formaldeído, através de uma complexa metodologia que envolveu técnicas de modelação associadas a medições directas do ar interior (na casa e escola da criança) e do ar exterior. Para a análise de dados foram utilizadas equações de estimação generalizadas com uma matriz de correlação de trabalho uniforme, com excepção do estudo das associações entre poluentes, 8-isoprostanos e malonaldeído. Verificou-se na análise multivariável a existência de uma associação entre o agravamento dos parâmetros espirométricos e a exposição aumentada a PM10, NO2, benzeno, tolueno e etilbenzeno. Foram também encontradas associações entre diminuição do pH do EBC e exposição crescente a PM10, NO2, benzeno e etilbenzeno e associações entre valores aumentados de FENO e exposição a etilbenzeno e tolueno. O benzeno, o tolueno e o etilbenzeno foram associados com maior recurso a broncodilatador nos 6 meses anteriores à Visita e o tolueno com deslocações ao serviço de urgência. Os resultados dos modelos de regressão que incluíram o efeito do poluente ajustado para o grau de infestação de ácaros do pó foram, de uma forma geral, idênticos ao da análise multivariável anterior, com excepção das associações para com o FENO. Nos modelos de exposição com dois poluentes, com o FEV1 como variável resposta, somente o benzeno persistiu com significado estatístico. No modelo com dois poluentes tendo o pH do EBC como variável resposta, somente persistiram as PM10. Os 8-isoprostanos correlacionaram-se com alguns COVs, designadamente etilbenzeno, xileno, tolueno e benzeno. Os valores de malonaldeído urinário não se correlacionaram com os valores de poluentes. Verificou-se no entanto que de uma forma geral, e em particular mais uma vez para os COVs, as crianças mais expostas a poluentes, apresentaram valores superiores de malonaldeído na urina. Verificou-se que os poluentes do ar em geral, e os COVs em particular, se associaram com uma deterioração das vias aéreas. A exposição crescente a poluentes associou-se não só com obstrução brônquica, mas também com FENO aumentado e maior acidez das vias aéreas. A exposição crescente a COVs correlacionou-se com um maior stress oxidativo das vias aéreas (medido pelos 8-isoprostanos). As crianças com exposição superior a COVs apresentaram maiores valores de malonaldeído urinário. Este trabalho sugere uma associação entre exposição a poluentes, inflamação das vias aéreas e stress oxidativo. Vem reforçar o interesse dos poluentes do ar, nomeadamente os associados a ambientes interiores, frequentemente esquecidos e que poderão ser explicativos do agravamento duma criança com sibilância.-----------ABSTRACT: Asthma is a chronic respiratory disease that could be influenced by environmental factors, as allergens and air pollutants. The air breathed contains a diversity of air pollutants, both from natural or anthropogenic sources. Atmospheric pollution, traditionally considered an environmental problem, is nowadays looked as an important public health problem. Indoor air pollutants are also related with respiratory diseases, not only in terms of occupational exposures but also in domestic activities. Particulate matter (such as PM10), O3, NO2 and volatile organic compounds (VOCs) are the main air pollutants. The main source for PM10, O3, NO2 exposure is traffic exhaust while for VOCs (such as benzene, toluene, xylene, ethylbenzene and phormaldehyde) the main sources for exposure are located in indoor environments. The pathophysiologic mechanisms underlying the aggression of air pollutants are not properly understood. It is thought that after inhalation, air pollutants could induce oxidative stress, which would be responsible for airways inflammation. The progression of oxidative stress and airways inflammation, would contribute for the local and systemic effects of the air pollutants. The present study aimed to evaluate the effects of individual exposure to various pollutants over the airways, through lung function tests, inflammatory and oxidative stress biomarkers. In this sense, we developed a panel study in the city of Viseu, that included 51 children with a history of wheezing. Those children that were identified by the ISAAC questionnaire, were followed for 18 months. Children were assessed four times (four repeated measures) through the following tests: spirometry with bronchodilation test, PEF study, FENO evaluation and exhaled breath condensate pH measurement. 8-isoprostane in the exhaled breath condensate were also measured but only in two visits. Urinary malonaldehyde measurement was performed only in the last visit. Besides the assessment of the house dust mite infestation, we calculated for each child the value of individual exposure to a wide range of pollutants: PM10, O3, NO2, benzene, toluene, xylene, ethyl benzene and formaldehyde. This strategy used a complex methodology that included air pollution modelling techniques and direct measurements indoors (homes and schools) and outdoors. Generalized estimating equations with an exchangeable working correlation matrix were used for the analysis of the data. Exceptions were for the study of associations between air pollutants, malonaldehyde and 8-isoprostanes. In the multivariate analysis we found an association between worsening of spirometric outcomes and increased exposure to PM10, NO2, benzene, toluene and ethylbenzene. In the multivariate analysis we found also negative associations between EBC pH and exposure to PM10, NO2, benzene, ethylbenzene and positive associations between FENO and exposure to ethylbenzene and toluene. Benzene, toluene and ethylbenzene were associated with increased use of bronchodilator in the 6 months prior to the visit and toluene with emergency department visits. Results of the regression models that included also the effect of the pollutant adjusted for the degree of infestation to house dust mites, were identical to the previous models. Exceptions were for FENO associations. In the two-pollutant models, with the FEV1 as dependent variable, only benzene persisted with statistical significance. In the two pollutant model with pH of EBC as dependent variable, only PM10 persisted. 8-isoprostanes were well correlated with some VOCs, namely with ethylbenzene, xylene, toluene and benzene. Urinary malonaldehyde did not present any correlation with air pollutants exposure. However, those children more exposed to air pollutants (namely to VOCs), presented higher values of malonaldehyde. It was found that air pollutants in general, and namely VOCs, were associated with deterioration of the airways. The increased exposure to air pollutants was associated not only with airways obstruction, but also with increased FENO and higher acidity of the airways. The increased exposure to VOCs was correlated with increased airways oxidative stress (measured by 8-isoprostane). Children with higher levels of exposure to VOCs had higher values of urinary malonaldehyde. This study suggests a relation between air pollution, airways inflammation and oxidative stress. It suggests also that attention should be dedicated to air quality as air pollutants could cause airways deterioration.

Pyruvate kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficies and their association with malaria - population genetics and proteomic studies

A malária é reconhecida como uma das principais forças selectivas a actuar na história recente no genoma humano. Inúmeros polimorfismos genéticos têm sido descritos como protectores contra a gravidade da malária, como o alelo HbS (designado de traço falciforme) e o alelo G6PD A- (associado à deficiência de G6PD). Mais recentemente, também a deficiência de PK foi associada com a protecção contra a malária. Evidências desta associação foram obtidas em estudos com modelos de roedor e estudos in vitro utilizando GV humanos deficientes em PK. Até à data, não foram obtidos dados em populações humanas que revelem esta associação: ainda não foi identificada uma variante de PK com uma prevalência elevada em regiões endémicas de malária e não foram identificadas marcas de selecção na região do gene que codifica para a PK (gene PKLR). Além disso, os mecanismos subjacentes à protecção contra a malária por deficiências enzimáticas dos GV não estão bem esclarecidos. Assim, os objectivos do presente estudo foram: investigar os polimorfismos genéticos humanos com associação com a malária em Cabo Verde; pesquisar marcas de selecção da malária na região do gene PKLR em populações Africanas; determinar a frequência da deficiência em PK e identificar uma eventual variante da enzima que possa estar sob selecção positiva em regiões endémicas de malária; avaliar o efeito das duas deficiências enzimáticas (PK e G6PD) na invasão e maturação do parasita em culturas in vitro de Plasmodium usando GV normais e deficientes; e analisar o perfil proteómico de GV infectados e não infectados, normais e com deficiência (em PK e G6PD), bem como de parasitas isolados de GV tanto deficientes como normais. Em Cabo Verde (área epidémica), não foram identificadas marcas de selecção pela malária, através da análise dos vários polimorfismos. No entanto, quando a análise foi realizada em dois países endémicos (Angola e Moçambique), foram detectadas várias marcas de selecção: a genotipagem de microssatélites (STRs) e polimorfismos de base única (SNPs) localizados na vizinhança do gene PKLR revelou uma diferenciação consideravelmente maior entre as populações Africana e Europeia (Portuguesa), do que a diferenciação determinada aquando da utilização de marcadores genéticos neutros. Além disso, uma região genómica de maior amplitude apresentou um Desequilíbrio de Ligação (LD) significativo no grupo de malária não grave (e não no grupo de malária grave), sugerindo que a malária poderá estar a exercer pressão selectiva sobre a região do genoma humano que envolve o gene PKLR. No estudo que incidiu na determinação da prevalência da deficiência de PK no continente Africano (realizado em Moçambique), esta revelou-se elevada - 4,1% - sendo o valor mais elevado descrito até ao momento a nível mundial para esta enzimopatia. Na pesquisa de mutações que pudessem estar na causa deste fenótipo (baixa actividade de PK), foi identificada uma mutação não sinónima 829G>A (277Glu>Lys), significativamente associada à baixa actividade enzimática. Esta mutação foi também identificada em Angola, São Tomé e Príncipe e Guiné Equatorial, onde a frequência de portadores heterozigóticos foi entre 2,6 e 6,7% (valores que se encontram entre os mais elevados descritos globalmente para mutações associadas à deficiência em PK). Não foi possível concluir acerca da associação entre a deficiência de PK e o grau de severidade da malária e da associação entre o alelo 829A e a mesma, devido ao baixo número de amostras. Os resultados dos ensaios de invasão/maturação do parasita sugeriram que, nos GV com deficiência de PK ou G6PD, a invasão (onde está envolvida a membrana do GV hospedeiro e o complexo apical do parasita) é mais relevante para a eventual protecção contra a malária do que a maturação. Os resultados da análise proteómica revelaram respostas diferentes por parte do parasita nas duas condições de crescimento (GV com deficiência de PK e GV com deficiência de G6PD). Esta resposta parece ser proporcional à gravidade da deficiência enzimática. Nos parasitas que cresceram em GV deficientes em G6PD (provenientes de um indivíduo assintomático), a principal alteração observada (relativamente às condições normais) foi o aumento do número de proteínas de choque térmico e chaperones, mostrando que os parasitas responderam às condições de stress oxidativo, aumentando a expressão de moléculas de protecção. Nos parasitas que cresceram em condições de deficit de PK (GV de indivíduo com crises hemolíticas regulares, dependente de transfusões sanguíneas), houve alteração da expressão de um maior número de proteínas (relativamente ao observado em condições normais), em que a maioria apresentou uma repressão da expressão. Os processos biológicos mais representados nesta resposta do parasita foram a digestão da hemoglobina e a troca de proteínas entre hospedeiro e parasita/remodelação da superfície do GV. Além disso, uma elevada percentagem destas proteínas com expressão alterada está relacionada com as fendas de Maurer, que desempenham um papel importante na patologia da infecção malárica. É colocada a hipótese de que a protecção contra a malária em GV deficientes em PK está relacionada com o processo de remodelação da membrana dos GV pelo parasita, o que pode condicionar a invasão por novos parasitas e a própria virulência da malária. Os resultados da análise do proteoma dos GV contribuirão para confirmar esta hipótese.

Exposição profissional ao chumbo : análise da indução de efeitos genotóxicos

RESUMO - A exposição contínua a substâncias químicas tem consequências para a saúde humana, algumas das quais não estão ainda totalmente estabelecidas. A toxicologia ocupacional é uma área interdisciplinar que envolve conhecimentos de higiene e de medicina ocupacional, de epidemiologia e de toxicologia e que tem por principal objectivo prevenir a ocorrência de efeitos adversos decorrentes do ambiente ocupacional sendo um dos seus principais papéis fornecer o máximo de dados que possam contribuir para o conhecimento dos potenciais efeitos na saúde. O chumbo é um tóxico de características cumulativas que provoca na saúde efeitos principalmente sistémicos, ou seja, o efeito tóxico manifesta-se em locais afastados do contacto inicial que resultam essencialmente de exposições crónicas, resultantes de períodos de exposição mais ou menos longos ao metal (entre meses e anos). Pode interagir com diferentes órgãos e tecidos, ligando-se a moléculas e constituintes celulares. Uma vez que não possui qualquer função fisiológica, a presença do chumbo no organismo humano resulta numa série de efeitos prejudiciais que afectam diversos órgãos e sistemas. A toxicidade do chumbo manifesta-se em diversos órgãos e tecidos, nomeadamente no sistema hematopoiético, no sistema nervoso, no rim, no aparelho reprodutor, no sistema cardiovascular, no sistema endócrino e no sistema imunitário. Da interferência do chumbo com o funcionamento de alguns sistemas biológicos resultam um conjunto de alterações fundamentais ao nível dos processos de transporte através das membranas, da integridade estrutural e funcional das enzimas e de várias vias metabólicas, em especial da fosforilação oxidativa e da síntese do heme sendo os primeiros efeitos bioquímicos do chumbo detectados a partir de valores de plumbémia inferiores a 10 μg/dL. As medidas de higiene e segurança actualmente em vigor nos países desenvolvidos asseguram que os casos de intoxicação grave são cada vez menos frequentes. No entanto, o risco de exposição a nível ocupacional existe em todas as actividades que envolvem materiais que o contenham como as explorações mineiras, as fundições primária e secundária, a produção de baterias de chumbo ácido, a produção de vidro com pigmentos de chumbo, as soldaduras de reparação automóvel e a instrução de tiro. Desde 2006 o chumbo é considerado pela International Agency for Research on Cancer (IARC) uma substância carcinogénica do grupo 2A (provável carcinogénio para o ser humano). Considera-se, assim, que o chumbo tem, inequivocamente, capacidade de induzir cancro em animais experimentais mas que, embora haja fortes indícios de que os mecanismos que medeiam a carcinogénese desses compostos ocorrem no ser humano, os dados disponíveis ainda não podem assegurar essa relação. Com este estudo pretendeu-se contribuir para o conhecimento da toxicidade do chumbo através do estudo da exposição ao chumbo e da influência da susceptibilidade individual (em industrias sem co-exposição significativa a outros agentes conhecidos ou suspeitos de serem carcinogénicos). Pretendeu-se estudar o caso através de uma abordagem múltipla que permitisse relacionar diferentes tipos de marcadores biológicos uma vez que a monitorização biológica integra todas as possíveis vias de entrada no organismo (para além da via respiratória), eventuais exposições fora do contexto estritamente profissional assim como uma série de factores intrínsecos individuais (relacionados com modos de via, de natureza fisiológica e comportamentais). Sendo a co-exposição a outros compostos com propriedades genotóxicas e carcinogénicas uma questão difícil de tornear quando se quer avaliar o potencial genotóxico do chumbo em populações expostas, ocupacional ou ambientalmente este estudo tem a vantagem de ter sido efectuado em populações sem co-exposição conhecida a outras substâncias deste tipo, permitindo concluir sobre os efeitos resultantes apenas da exposição a chumbo na população humana, contribuindo para explicar algumas das aparentes inconsistências e contradições entre diferentes estudos sobre este tema. Os indicadores de exposição usados foram: indicadores de dose interna (doseamento de chumbo e de PPZ no sangue), indicadores de efeitos adversos no heme e genotóxicos (actividade da ALAD, teste do cometa e mutação em TCR) e indicadores de susceptibilidade (polimorfismos genéticos de ALAD e VDR) através de uma abordagem estatística de comparação directa de sub-grupos previamente definidos na população e da aplicação de um modelo de regressão múltipla. Este estudo revelou que os níveis de plumbémia na população portuguesa baixaram significativamente nos últimos 10 anos, tanto na população ocupacionalmente exposta como na população em geral e que a presença do genótipo B-B (do gene VDR) é preditiva das variações de plumbémia, quando comparada com o genótipo mais frequente na população, B-b; ao contrário, o genótipo b-b não aparenta ter influência em nenhum dos marcadores estudados. No que diz respeito a efeitos genotóxicos concluiu-se que estes não se manifestaram na população estudada, levando a concluir que nos níveis de exposição estudados, o chumbo não tem capacidade de induzir este tipo de efeitos per si levando ao reforço da hipótese, já levantada por outros autores, de que o mecanismo de genotoxicidade do chumbo seja essencialmente de promoção de processos de genotoxicidade desencadeados por outros agentes. A realização de estudos de efeitos genotóxicos e de stress oxidativo desenhados de forma a comparar grupos de trabalhadores expostos apenas a chumbo com grupos de trabalhadores com o mesmo nível de exposição a chumbo, mas com co-exposição a outros agentes reconhecidamente carcinogénicos poderá ajudar a aumentar o conhecimento deste efeito do chumbo na saúde humana.