Fonction de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium.

Rôle de la Prohibitine et de la sumoylation dans la pathogenèse de l’ostéoarthrose

L'ostéoarthrose (OA) est la forme la plus commune d’arthrite et son étiologie demeure encore méconnue. Les travaux du Dr Moreau et son équipe ont permis de mettre en évidence une quasi perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans les chondrocytes OA et la protéine PHB-1 a été identifiée comme étant membre d’un complexe répresseur pouvant lier le promoteur de Pitx1. Le but de la présente étude était de confirmer l’accumulation anormale de PHB-1 dans le noyau des chondrocytes OA, tel que suggéré par des données préliminaires, et d’identifier les mécanismes impliqués dans son import ou rétention au noyau. Pour ce faire, un volet mécanistique utilisant les lignées C28/I2 et U2OS fut combiné à l’étude clinique des chondrocytes articulaires de patients OA et de sujets sains. Les résultats de cette étude démontrent que chez 55 pourcent des patients OA, la Prohibitine s’accumule dans le noyau des chondrocytes articulaires et que cette accumulation corrèle avec une augmentation de la sumoylation totale dans le noyau des cellules OA. Le présent projet de recherche propose pour la première fois qu’une sumoylation accrue au sein des cellules OA pourrait être responsable de l’accumulation nucléaire de PHB-1, médiée par sa liaison aux protéines SUMO-1 via un domaine de liaison aux SUMOs (SBM) localisé aux résidus 76 à 79 de PHB-1. Les résultats de cette étude ont aussi permis de mettre en évidence que dans les chondrocytes OA, les protéines SUMO-1 et SUMO-2/3 s’accumulent dans des corps nucléaires de type PML, suggérant un recrutement de protéines interagissant avec les SUMOs au sein de ces structures dans les cellules OA. Nous sommes persuadés que cette étude générera des retombées importantes non seulement au niveau fondamental pour la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la biologie des chondrocytes articulaires, mais aussi au niveau du développement d’outils génétiques permettant le dépistage de l’arthrose à un stade précoce.

Régulation de la fonction ovarienne par la voie de signalisation des WNTs

Les WNTs sont des glycoprotéines sécrétées impliquées dans plusieurs processus tels que la spécification cellulaire, la prolifération, la différenciation, et beaucoup d’autres. Pour transmettre leur signal, les WNTs se lient aux récepteurs Frizzled (FZD) et au co-récepteur « Low-density-lipoprotein receptor Related Protein » (LRP) 6 ou 5, activant ainsi l’une des trois principales voies de signalisation: la voie de signalisation WNT/β-caténine (voie canonique), la voie « Planar Cell Polarity » (PCP) et la voie WNT/Ca2+ (voies non-canoniques). Des antagonistes de cette voie, les « Secreted Frizzled Related Protein » (SFRPs), peuvent aussi se lier aux WNTs pour empêcher leur liaison aux récepteurs FZDs. Bien que des rôles importants aient été associés à plusieurs composants de la voie des WNTs lors de la régulation de l’ovaire adulte, le fonctionnement exact de cette signalisation reste nébuleux. L’objectif global de cette thèse visait donc à mieux comprendre la voie de signalisation des WNTs au niveau de l’ovaire adulte de souris, par la caractérisation de deux autres composants de cette voie, FZD1 et SFRP4. La création et l’analyse de souris Fzd1 et Sfrp4 KO ont démontré que FZD1 est nécessaire pour la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus, dans le complexe ovocyte-cumulus (COC). Nous avons aussi constaté que SFRP4 avait un rôle à jouer lors de la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus mais cette fois, au niveau des cellules de la granulosa. Finalement, les résultats in vivo et in vitro de cette étude ont suggéré que la voie PCP, contrairement à la voie canonique, pourrait être modulée dans les cellules de la granulosa des souris Sfrp4 KO, possiblement grâce au signal induit par WNT4 et WNT5a. Ces données ont permis de créer un modèle hypothétique représentant la régulation de la signalisation ovarienne par les WNTs. Ce modèle servira de base pour l’élaboration de futurs projets de recherche visant à comprendre davantage la signalisation ovarienne et les possibles effets de sa dérégulation lors de processus pathologiques. Ces connaissances pourront ensuite être appliquées chez l’humain afin de traiter plusieurs maladies ou dérèglements ovariens.

Études pharmacocinétiques exploratoires de certains médicaments utilisés en analgésie post-opératoire

La douleur post-opératoire chez les patients constitue un défi thérapeutique important pour les cliniciens. Le traitement de la douleur post-opératoire n’est pas accessoire ni optionnel, puisqu’il permet de donner un congé de l’hôpital plus rapide aux patients et ainsi, il contribue à des économies importantes pour notre système de santé. Parmi les approches thérapeutiques utilisées pour la prise en charge de la douleur post-opératoire, cette thèse s’intéresse particulièrement aux blocs de nerfs périphériques par les anesthésiques locaux et à l’administration de la néostigmine par voie épidurale. Ces médicaments sont utilisés en clinique sans avoir préalablement établi, en se basant sur leur propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques spécifiques, leurs doses optimales. Ces doses devraient également tenir en considération les particularités anatomiques du site d’injection par rapport au site d’action. Cette thèse inclut des études exploratoires qui ont contribué à caractériser la pharmacocinétique de la ropivacaïne et de la bupivacaïne ainsi que la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de la néostigmine. La première étude portait sur seize patients subissant une chirurgie orthopédique avec un bloc combiné des nerfs fémoral et sciatique par la ropivacaïne (n=8) ou la bupivacaïne (n=8). C’était la première étude qui a inclu des temps d’échantillons pharmacocinétiques allant jusqu’à 32 h après le bloc et ces résultats ont démontré une variabilité interindividuelle considérable. La modélisation par approche de population a aidé à expliquer les sources de la variabilité et démontré que l’absorption systémique des anesthésiques locaux était très lente. De plus, les concentrations plasmatiques demeuraient mesurables, et dans certains cas présentaient un plateau, 32 h après le bloc. Dans les prochaines études, un échantillonnage allant jusqu’à 4 ou 5 jours sera nécessaire afin d’atteindre la fin de l’absorption. La deuxième étude a établi le développement d’un modèle animal en étudiant la pharmacocinétique de la ropivacaïne après administration intraveineuse ainsi que son degré de liaison aux protéines plasmatiques chez le lapin (n=6). Les résultats ont démontré que, chez le lapin la ropivacaïne est beaucoup moins liée aux protéines plasmatiques comparativement à l’humain. Ce résultat important sera utile pour planifier les prochaines études précliniques. La troisième étude a exploré, pour la première fois, la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de la néostigmine administrée par voie épidurale et a essayé de caractériser la courbe dose-réponse en utilisant trois doses différentes : 0.5, 1 et 1.5 mg. Bien que les concentrations de la néostigmine dans le liquide céphalo-rachidien fussent très variables une relation inverse entre la consommation de mépéridine et la dose de néostigmine a été démontrée. La dose de 1.5 mg a donné une meilleure réponse pharmacodynamique sur la douleur, mais elle a été considérée comme dangereuse puisqu’elle a résulté en deux cas d’hypertension. Nous avons conclu que des doses plus faibles que 1.5 mg devront être utilisées lors de l’utilisation de la néostigmine par voie épidurale. En conclusion, les études rapportées dans cette thèse ont exploré les propriétés pharmacocinétiques et/ou pharmacodynamiques de certains médicaments utilisés pour le traitement de la douleur post-opératoire. Ceci mènera au but ultime qui est la meilleure prise en charge de la douleur post-opératoire chez les patients.

Caractérisation de l’interaction entre la protéine Lin28 et le précurseur du microARN let-7g

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN.

Interaction entre la RNase HI et la RNase E dans le métabolisme des R-loops et la dégradation des ARNms chez Escherichia coli.

Chez la bactérie Escherichia coli, la topoisomérase I et la gyrase représentent deux topoisomérases majeures qui participent à la régulation du surenroulement de l’ADN. Celles-ci sont codées respectivement par les gènes topA et par gyrA et gyrB. Chez les mutants topA, l’excès de surenroulement négatif qui est généré en amont de la polymérase ARN lors de la phase d’élongation de la transcription de l’ADN, entraine la formation de R-loops. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui in vivo sont formés lorsque l’ARN nouvellement transcrit forme un hybride avec le brin d’ADN matrice, le brin d’ADN complémentaire demeurant sous forme simple brin. La RNase HI est une endoribonucléase codée par le gène rnhA. Elle dégrade l’ARN de R-loops, entre autres, pour empêcher l’initiation de la réplication à des sites autres que l’origine normale, oriC. Chez les mutants rnhA, on observe une réplication indépendante de l’origine oriC. Ce type de réplication appelé cSDR, pourrait donc expliquer, du moins en partie, l’inhibition de la croissance de doubles mutants topA rnhA. A l’aide de la mutagenèse au transposon Tn5, il a été possible d’isoler des suppresseurs extragéniques qui permettaient la croissance des doubles mutants topA rnhA. Plusieurs de ces suppresseurs ont le transposon inséré dans le gène codant pour la RNase E, l’endoribonucléase principale impliquée dans la dégradation des ARNms chez E. coli. La majorité des insertions se retrouvent dans la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée dans l’assemblage d’un complexe multiprotéique appelé l’ARN dégradosome. Les résultats obtenus démontrent que ces suppresseurs diminuent le cSDR ainsi que la réponse SOS induite constitutivement en l’absence de la RNase HI. Sachant que la RNase HI est une endoribonucléase tout comme la RNase E, une collaboration entre les deux enzymes suggère que la RNase E pourrait également jouer un rôle potentiel dans le contrôle de la formation des R-loops et bien évidemment de leur retrait au sein de la cellule. À l’opposé, il est possible que la RNase HI puisse avoir comme autre fonction la prise en charge de la maturation et de la dégradation des molécules d’ARNs.

The regulatory roles of APE1 and Prdx1 interaction

L’apurinic/apyrimidic endonuclease 1 (APE1) est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Elle sert également de coactivateur de transcription et est aussi impliquée dans le métabolisme de l’ARN et la régulation redox. APE1 peut cliver les sites AP ainsi que retirer des groupements, sur des extrémités 3’ créées suite à des bris simple brin, qui bloquent les autres enzymes de réparation, permettant de poursuivre la réparation de l’ADN, puisqu’elle possède plusieurs activités de réparation de l’ADN comme une activité phosphodiestérase 3’ et une activité exonucléase 3’→5’. Les cellules de mammifères ayant subi un knockdown d’APE1 présentent une grande sensibilité face à de nombreux agents génotoxiques. APE1 ne possède qu’une seule cystéine située au 65e acide aminé. Celle-ci est nécessaire pour maintenir l’état de réduction de nombreux activateurs de transcription tels que p53, NF-κB, AP-1, c-Jun at c-Fos. Ainsi, elle se retrouve impliquée dans la régulation de l’expression génique. APE1 passe également à travers au moins 4 types de modifications post-traductionnelles : l’acétylation, la désacétylation, la phosphorylation et l’ubiquitylation. La façon dont APE1 est recrutée pour accomplir ses différentes fonctions biologiques demeure un mystère, bien que cela puisse être relié à sa capacité d’interaction avec de multiples partenaires différents. Sous des conditions de croissance normales, il a été démontré qu’APE1 interagit avec de nombreux partenaires impliqués dans de multiples fonctions. Nous émettons l’hypothèse que l’état d’oxydation d’APE1 est ce qui contrôle les partenaires avec lesquels la protéine interagira, lui permettant d’accomplir des fonctions précises. Dans cette étude nous démontrons que le peroxyde d’hydrogène altère le réseau d’interactions d’APE1. Un nouveau partenaire d’interaction d’APE1, Prdx1, un membre de la famille des peroxirédoxines responsable de récupérer le peroxyde d’hydrogène, est caractérisé. Nous démontrons qu’un knockdown de Prdx1 n’affecte pas l’activité de réparation de l’ADN d’APE1, mais altère sa détection et sa distribution cellulaire à l’intérieur des cellules HepG2 conduisant à une induction accrue de l’interleukine 8 (IL-8). L’IL8 est une chimiokine impliquée dans le stress cellulaire en conditions physiologiques et en cas de stress oxydatif. Il a été démontré que l’induction de l’IL-8 est dépendante d’APE1 indiquant que Prdx1 pourrait réguler l’activité transcriptionnelle d’APE1. Il a été découvert que Prdx1 est impliquée dans la régulation redox suite à une réponse initiée par le peroxyde d’hydrogène. Ce dernier possède un rôle important comme molécule de signalisation dans de nombreux processus biologiques. Nous montrons que Prdx1 est nécessaire pour réduire APE1 dans le cytoplasme en réponse à la présence de H2O2. En présence de Prdx1, la fraction d’APE1 présent dans le cytoplasme est réduite suite à une exposition au peroxyde d’hydrogène, et Prdx1 est hyperoxydé suite à l’interaction entre les deux molécules. Cela suggère que le signal, que produit le peroxyde d’hydrogène, sur APE1 passe par Prdx1. Un knockdown d’APE1 diminue la conversion de la forme dimérique de Prdx1 vers la forme monomérique. Cette observation implique qu’APE1 pourrait être impliquée dans la régulation de l’activité catalytique de Prdx1 en accélérant son hyperoxydation.

Nanostructure des particules polymériques : aspects physiques, chimiques et biologiques

Les nanotechnologies appliquées aux sciences pharmaceutiques ont pour but d’améliorer l’administration de molécules actives par l’intermédiaire de transporteurs nanométriques. Parmi les différents types de véhicules proposés pour atteindre ce but, on retrouve les nanoparticules polymériques (NP) constituées de copolymères “en bloc”. Ces copolymères permettent à la fois l’encapsulation de molécules actives et confèrent à la particule certaines propriétés de surface (dont l’hydrophilicité) nécessaires à ses interactions avec les milieux biologiques. L’architecture retenue pour ces copolymères est une structure constituée le plus fréquemment de blocs hydrophiles de poly(éthylène glycol) (PEG) associés de façon linéaire à des blocs hydrophobes de type polyesters. Le PEG est le polymère de choix pour conférer une couronne hydrophile aux NPs et son l’efficacité est directement liée à son organisation et sa densité de surface. Néanmoins, malgré les succès limités en clinique de ces copolymères linéaires, peu de travaux se sont attardés à explorer les effets sur la structure des NPs d’architectures alternatives, tels que les copolymères en peigne ou en brosse. Durant ce travail, plusieurs stratégies ont été mises au point pour la synthèse de copolymères en peigne, possédant un squelette polymérique polyesters-co-éther et des chaines de PEG liées sur les groupes pendants disponibles (groupement hydroxyle ou alcyne). Dans la première partie de ce travail, des réactions d’estérification par acylation et de couplage sur des groupes pendants alcool ont permis le greffage de chaîne de PEG. Cette méthode génère des copolymères en peigne (PEG-g-PLA) possédant de 5 à 50% en poids de PEG, en faisant varier le nombre de chaînes branchées sur un squelette de poly(lactique) (PLA). Les propriétés structurales des NPs produites ont été étudiées par DLS, mesure de charge et MET. Une transition critique se situant autour de 15% de PEG (poids/poids) est observée avec un changement de morphologie, d’une particule solide à une particule molle (“nanoagrégat polymére”). La méthode de greffage ainsi que l’addition probable de chaine de PEG en bout de chaîne principale semblent également avoir un rôle dans les changements observés. L’organisation des chaînes de PEG-g-PLA à la surface a été étudiée par RMN et XPS, méthodes permettant de quantifier la densité de surface en chaînes de PEG. Ainsi deux propriétés clés que sont la résistance à l’agrégation en conditions saline ainsi que la résistance à la liaison aux protéines (étudiée par isothermes d’adsorption et microcalorimétrie) ont été reliées à la densité de surface de PEG et à l’architecture des polymères. Dans une seconde partie de ce travail, le greffage des chaînes de PEG a été réalisé de façon directe par cyclo-adition catalysée par le cuivre de mPEG-N3 sur les groupes pendants alcyne. Cette nouvelle stratégie a été pensée dans le but de comprendre la contribution possible des chaines de PEG greffées à l’extrémité de la chaine de PLA. Cette librairie de PEG-g-PLA, en plus d’être composée de PEG-g-PLA avec différentes densités de greffage, comporte des PEG-g-PLA avec des PEG de différent poids moléculaire (750, 2000 et 5000). Les chaines de PEG sont seulement greffées sur les groupes pendants. Les NPs ont été produites par différentes méthodes de nanoprécipitation, incluant la nanoprécipitation « flash » et une méthode en microfluidique. Plusieurs variables de formulation telles que la concentration du polymère et la vitesse de mélange ont été étudiées afin d’observer leur effet sur les caractéristiques structurales et de surface des NPs. Les tailles et les potentiels de charges sont peu affectés par le contenu en PEG (% poids/poids) et la longueur des chaînes de PEG. Les images de MET montrent des objets sphériques solides et l'on n’observe pas d’objets de type agrégat polymériques, malgré des contenus en PEG comparable à la première bibliothèque de polymère. Une explication possible est l’absence sur ces copolymères en peigne de chaine de PEG greffée en bout de la chaîne principale. Comme attendu, les tailles diminuent avec la concentration du polymère dans la phase organique et avec la diminution du temps de mélange des deux phases, pour les différentes méthodes de préparation. Finalement, la densité de surface des chaînes de PEG a été quantifiée par RMN du proton et XPS et ne dépendent pas de la méthode de préparation. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’architecture du polymère sur les propriétés d’encapsulation et de libération de la curcumine. La curcumine a été choisie comme modèle dans le but de développer une plateforme de livraison de molécules actives pour traiter les maladies du système nerveux central impliquant le stress oxydatif. Les NPs chargées en curcumine, montrent la même transition de taille et de morphologie lorsque le contenu en PEG dépasse 15% (poids/poids). Le taux de chargement en molécule active, l’efficacité de changement et les cinétiques de libérations ainsi que les coefficients de diffusion de la curcumine montrent une dépendance à l’architecture des polymères. Les NPs ne présentent pas de toxicité et n’induisent pas de stress oxydatif lorsque testés in vitro sur une lignée cellulaire neuronale. En revanche, les NPs chargées en curcumine préviennent le stress oxydatif induit dans ces cellules neuronales. La magnitude de cet effet est reliée à l’architecture du polymère et à l’organisation de la NP. En résumé, ce travail a permis de mettre en évidence quelques propriétés intéressantes des copolymères en peigne et la relation intime entre l’architecture des polymères et les propriétés physico-chimiques des NPs. De plus les résultats obtenus permettent de proposer de nouvelles approches pour le design des nanotransporteurs polymériques de molécules actives.

Facteurs environnementaux immédiats et santé des enfants dans les zones de l’Observatoire de population de Ouagadougou (Burkina Faso)

Comme la plupart des villes en Afrique subsaharienne, Ouagadougou, capitale du Burkina Faso, a connu au cours de ces dernières décennies une croissance démographique rapide. Cette situation pose de nombreux problèmes d’ordre sanitaire et environnemental. Pourtant, les liens entre la santé et l’environnement immédiat sont encore faiblement étudiés du fait de la qualité des données qui, lorsqu’elles existent, se révèlent peu appropriées. La présente thèse vise à analyser les liens entre l’environnement immédiat et certains symptômes de maladies, plus spécifiquement la fièvre et la diarrhée ; deux problèmes majeurs de santé liés à l’environnement chez les enfants de moins de 5 ans dans les villes d’Afrique subsaharienne. Cette étude se base sur des données de l’Observatoire de population de Ouagadougou (OPO) recueillies entre 2009 et 2010 dans l’objectif d’étudier les inégalités de santé en milieu urbain (notamment les données de l’enquête santé portant sur 950 enfants de moins de 5 ans recueillies en 2010). La thèse décrit d’abord la santé environnementale en milieu urbain en dépassant l’opposition classique quartiers lotis/quartiers non lotis (zones d’habitation formelles/zones d’habitation informelles). Elle s’intéresse ensuite à l’évaluation plus fine des liens entre l’environnement immédiat et la fièvre en tenant compte des facteurs démographiques et socio-économiques pertinents dans l’estimation. Enfin, la thèse approfondit les analyses sur la co-occurrence de la diarrhée et de la fièvre en mettant en évidence les effets conjoints des facteurs environnementaux et démographiques. À l’aide des analyses spatiales basées sur la distance euclidienne, des analyses factorielles et de classification, cette étude décrit le contexte sanitaire des quartiers formels et informels et analyse la pertinence de la dichotomie entre les quartiers lotis et les quartiers non lotis dans les zones suivies par l’OPO. L’étude effectue également des analyses multivariées en recourant respectivement aux modèles logit simple et ordonné pour estimer les effets propres de l’environnement immédiat sur la fièvre et la co-occurrence de la diarrhée et de la fièvre chez les enfants. Les résultats de l’étude montrent que les risques environnementaux sont variables d’un quartier à l’autre, et que les quartiers lotis bien qu’étant les plus pourvus en services urbains de base sont les plus exposés aux dangers environnementaux. Néanmoins, ce constat ne suffit pas pour rendre compte de la vulnérabilité des enfants dans les quartiers lotis que dans les quartiers non lotis, puisque l’accès à l’eau, l’assainissement, la nature du sol, et le niveau d’éducation de la mère sont des facteurs clés dans l’occurrence des symptômes liés à l’environnement immédiat. On note également une hétérogénéité concernant la santé environnementale, notamment dans les zones non loties. En considérant les effets de l’environnement immédiat sur la fièvre chez les enfants, les résultats montrent que ces effets baissent après la prise en compte des variables démographiques, socio-économiques et du quartier de résidence. Les facteurs de l’environnement tels que la gestion des ordures ménagères et celle des eaux usées discriminent significativement la fièvre. Les enfants à Nioko 2 (quartier non loti), par exemple, ont deux fois plus de risque d’avoir eu de la fièvre par rapport à Kilwin (quartier loti). Les effets conjoints des facteurs environnementaux et démographiques sont également mis en exergue dans la co-occurrence de la diarrhée et de la fièvre, même si ces effets diminuent régulièrement avec le nombre des symptômes chez les enfants. Le fait d’être dans un ménage insalubre ou d’avoir le sol extérieur en terre augmente la propension de co-occurrence de la diarrhée et de la fièvre. En revanche, cette co-occurrence chez les enfants diminue significativement avec l’âge. Les effets de l’environnement sur l’occurrence ou la co-occurrence des symptômes existent, quand bien même ces effets diminuent avec la prise en compte des facteurs démographiques et socio-économiques et du quartier de résidence. Les résultats de la thèse plaident pour un effort méthodologique, afin d’affiner la définition des variables de l’environnement en milieu urbain.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.

Pelerinage artistique : Italie /

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Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.

Caractérisation d'IGFBP-2 comme biomarqueur intégrateur de la santé cardiométabolique

La protéine de liaison aux facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGFBP)-2 est une protéine circulante fortement associée à la résistance à l’insuline qui module les effets métaboliques d’IGF-I et IGF-II en s’y associant directement, et qui exerce aussi des actions IGF-indépendantes via sa liaison à la matrice extracellulaire et aux intégrines. Chez l’homme, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à un profil lipidique délétère, ainsi qu’à une augmentation de la masse grasse et de la résistance à l’insuline. Les travaux décrits dans cette thèse montrent chez l’humain et la souris que les niveaux d’IGFBP-2 sont associés de manière indépendante aux composantes du risque cardiométabolique. Chez l’homme, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à la dyslipidémie athérogène. Une valeur seuil d’IGFBP-2 de 221.5 ng/mL a permis de discriminer entre les sujets métaboliquement sains et ceux répondant aux critères du syndrome métabolique. En plus de son association avec la résistance à l’insuline et les composantes du profil lipidique, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à une fonction cardiaque diminuée chez les patients atteints de sténose aortique, tel qu’évaluée par le volume d’éjection indexé, un indice de fonction global du ventricule gauche qui intègre la fonction pompe et le remodelage du tissu. Chez l’homme, des niveaux d’IGFBP-2 élevés sont associés à un tissu adipeux brun plus volumineux ainsi qu’à une activité métabolique plus importante de ce dernier. Ces observations, telles qu’évaluées par PET/CT, sont aussi validées chez les souris surexprimant la forme humaine d’IGFBP-2. Nos travaux démontrent que les niveaux d’IGFBP-2 sont fortement associés au métabolisme des lipoprotéines et des lipides, à la fonction cardiaque ainsi qu’à l’activité du tissu adipeux brun. L’influence des niveaux d’IGFBP-2 par différentes altérations métaboliques menant à l’augmentation du risque cardiométabolique pourrait faire de ce dernier un biomarqueur précoce et intégrateur. Les travaux exposés dans la présente thèse soulignent aussi un rôle mécanistique potentiel pour IGFBP-2 dans la protection contre certaines altérations du métabolisme.

Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.

Élucidation et identification des différents interacteurs impliqués dans le mécanisme de régulation du LDLR par la protéine PCSK9

Résumé : Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de mortalité mondiale, soit le tiers des décès annuels selon l’Organisation mondiale de la Santé. L’hypercholestérolémie, caractérisée par une élévation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines de faible densité (LDL), est l’un des facteurs de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires. La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) joue un rôle essentiel dans l’homéostasie du cholestérol sanguin par la régulation des niveaux protéiques du récepteur LDL (LDLR). PCSK9 est capable de se lier au LDLR et favorise l’internalisation et la dégradation du récepteur dans les lysosomes. L’inhibition de PCSK9 s’avère une cible thérapeutique validée pour le traitement de l’hypercholestérolémie et la prévention des maladies cardiovasculaires. Par contre, plusieurs mécanismes responsables de la régulation et la dégradation du complexe PCSK9-LDLR n’ont pas encore été complètement caractérisés comme la régulation par la protéine annexin A2 (AnxA2), un inhibiteur endogène de PCSK9. De plus, plusieurs évidences suggèrent la présence d’une ou plusieurs protéines, encore inconnues, impliquées dans le mécanisme d’action de PCSK9. Celles-ci pourraient réguler l’internalisation et le transport du complexe PCSK9-LDLR vers les lysosomes. Les objectifs de cette thèse sont de mieux définir le rôle et l’impact de l’AnxA2 sur la protéine PCSK9 en plus d’identifier de nouveaux partenaires d’interactions de PCSK9 pour mieux caractériser son mécanisme d’action sur la régulation des niveaux de LDLR. Nous avons démontré que l’inhibition de PCSK9 par l’AnxA2 extracellulaire s’effectue via sa liaison aux domaines M1+M2 de la région C-terminale de PCSK9 et nous avons mis en évidence les premières preuves d’un contrôle intracellulaire de l’AnxA2 sur la traduction de l’ARNm de PCSK9. Nos résultats révèlent une liaison de l’AnxA2 à l’ARN messager de PCSK9 qui cause une répression traductionnelle. Nous avons également identifié la protéine glypican-3 (GPC3) comme un nouveau partenaire d’interaction extracellulaire avec le PCSK9 et intracellulaire avec le complexe PCSK9-LDLR dans le réticulum endoplasmique des cellules HepG2 et Huh7. Nos études démontrent que GPC3 réduit l’activité extracellulaire de PCSK9 en agissant comme un compétiteur du LDLR pour la liaison avec PCSK9. Une meilleure compréhension des mécanismes de régulation et de dégradation du complexe PCKS9-LDLR permettra de mieux évaluer l’impact et l’efficacité des inhibiteurs de la protéine PCSK9.