Toxicogenomics of natural and anthropogenic effectors in eleutheroembryos

The introduction of chemicals into the environment by human activities may represent a serious risk to environmental and human health. Environmental risk assessment requires the use of efficient and sensitive tools to determine the impact of contaminants on the ecosystems. The use of zebrafish for the toxicity assessment of pharmaceuticals, drugs, and pollutants, is becoming well accepted due to zebrafish unique advantages for the screening of compounds for hazard identification. The aim of the present work is to apply toxicogenomic approaches to identify novel biomarkers and uncovered potential modes of action of classic and emergent contaminants able to disrupt endocrine systems, such as the Retinoic Acid Receptor, Retinoid X Receptor and the Aryl Hydrocarbon Receptor. This study relies on different nuclear and cytosolic protein receptors and other conditional (ligand- or stress- activated) transcriptional factors that are intimately involved in the regulation of defensome genes and in mechanisms of chemical toxicity. The transcriptomic effects of organic compounds, endogenous compounds, and nanoparticles were analysed during the early stages of zebrafish development. Studying the gene expression profiles of exposed and unexposed organisms to pollutants using microarrays allowed the identification of specific gene markers and to establish a "genetic code" for the tested compounds. Changes in gene expression were observed at toxicant concentrations that did not cause morphological effects. Even at low toxicant concentrations, the observed changes in transcript levels were robust for some target genes. Microarray responses of selected genes were further complemented by the real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) methodology. The combination of bio-informatic, toxicological analyses of differential gene expression profiles, and biochemical and phenotypic responses across the treatments allowed the identification of uncovered potential mechanisms of action. In addition, this work provides an integrated set of tools that can be used to aid management-decision making by improving the predictive capability to measure environmental stress of contaminants in freshwater ecosystems. This study also illustrates the potential of zebrafish embryos for the systematic, large-scale analysis of chemical effects on developing vertebrates.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Study of XHEP33 during the heart embryonic development of Xenopus laevis

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Insights into molecular and cellular events involved in normal and pathological vertebral development and fusion using zebrafish as model organism

The vertebral column and its units, the vertebrae, are fundamental features, characteristic of all vertebrates. Developmental segregation of the vertebral bodies as articulated units is an intrinsic requirement to guarantee the proper function of the spine. Whenever these units become fused either during development or postsegmentation, movement is affected in a more or less severe manner, depending on the number of vertebrae affected. Nevertheless, fusion may occur as part of regular development and as a physiological requirement, like in the tetrapod sacrum or in fish posterior vertebrae forming the urostyle. In order to meet the main objective of this PhD project, which aimed to better understand the molecular and cellular events underlying vertebral fusion under physiological and pathological conditions, a detailed characterization of the vertebral fusion occurring in zebrafish caudal fin region was conducted. This showed that fusion in the caudal fin region comprised 5 vertebral bodies, from which, only fusion between [PU1++U1] and ural2 [U2+] was still traceable during development. This involved bone deposition around the notochord sheath while fusion within the remaining vertebral bodies occur at the level of the notochord sheath, as during the early establishment of the vertebral bodies. A comparison approach between the caudal fin vertebrae and the remaining vertebral column showed conserved features such as the presence of mineralization related proteins as Osteocalcin were identified throughout the vertebral column, independently on the mineralization patterns. This unexpected presence of Osteocalcin in notochord sheath, here identified as Oc1, suggested that this gene, opposing to Oc2, generally associated with bone formation and mature osteoblast activity, is potentially associated with early mineralization events including chordacentrum formation. Nevertheless, major differences between caudal fin region and anterior vertebral bodies considering arch histology and mineralization patterns, led us to use RA as an inductive factor for vertebral fusion, allowing a direct comparison of equivalent structures under normal and fusion events. This fusion phenotype was associated with notochord sheath ectopic mineralization instead of ectopic perichordal bone formation related with increased osteoblast activity, as suggested in previous reports. Additionally, alterations in ECM content, cell adhesion and blood coagulation were discussed as potentially related with the fusion phenotype. Finally, Matrix gla protein, upregulated upon RA treatment and shown to be associated with chordacentrum mineralization sites in regular development, was further described considering its potential function in vertebral formation and pathological fusion. Therefore with this work we propose zebrafish caudal fin vertebral fusion as a potential model to study both congenital and postsegmentation fusion and we present candidate factors and genes that may be further explored in order to clarify whether we can prevent vertebral fusion.

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Molecular characterization of Gla-rich protein (GRP) gene expression and function

Gla-rich protein (GRP) is a vitamin K-dependent protein related to bone and cartilage recently described. This protein is characterized by a large number of Gla (γ-carboxyglutamic acid) residues being the protein with the highest Gla content of any known protein. It was found in a widely variety of tissues but highest levels was found in skeletal and cartilaginous tissues. This small secreted protein was also expressed and accumulated in soft tissues and it was clearly associated with calcification pathologies in the same tissues. Although the biological importance of GRP remains to be elucidated, it was suggested a physiological role in cartilage development and calcification process during vertebrate skeleton formation. Using zebrafish, an accepted model to study skeletal development, we have described two grp paralog genes, grp1 and grp2, which exhibited distinct patterns of expression, suggesting different regulatory pathways for each gene. Gene synteny analysis showed that grp2 gene is more closely related to tetrapod grp, although grp1 gene was proposed to be the vertebrate ortholog by sequence comparison. In addition, we identified a functional promoter of grp2 gene and using a functional approach we confirmed the involvement of transcription factors from Sox family (Sox9b and Sox10) in the regulation of grp2 expression. In an effort to provide more information about the function of grp isoforms, we generated two zebrafish transgenic lines capable to overexpress conditionally grp genes and possible roles in the skeleton development were studied. To better understand GRP function a mammalian system was used and the analysis of knockout mice showed that GRP is involved in chondrocyte maturation and the absence of GRP is associated to proteoglycans loss in calcified articular cartilage. In addition, we detected differences in chondrogenesis markers in articular chondrocyte primary culture. Overall, our data suggest a main role for GRP on chondrocyte differentiation.

Molecular structure and functional analysis of runx3 in zebrafish

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, 2014

Estudo do papel de CITED2 na diferenciação das células estaminais embrionárias

Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Effect of temperature on embryonic development, larval viability and biomarkers in the first stages of life of Octopus Vulgaris (Cuvier, 1797)

Dissertação de Mestrado, Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

From embryonic stem cells to sensory hair cells : a programming approach

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

The function of drosophila integrin adhesion complexes in pupal hemocyte migration in vivo

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.

Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.