Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em feijoeiro: sobrevivência em restos de cultura e ocorrência em sementes produzidas no estado do Paraná

Pós-graduação em Agronomia (Proteção de Plantas) - FCA

Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo, no filoplano e na rizosfera de plantas daninhas

Pós-graduação em Agronomia (Proteção de Plantas) - FCA

Otimização de marcadores desenvolvidos para PCR convencional para uso em qPCR visando a diagnose de Xanthomonas campestris pv viticola em videira.

No Brasil, Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), causadora do cancro bacteriano em videira, é uma praga quarentenária A2, com ocorrência no Semiárido Nordestino. A bactéria pode ser disseminada de plantas assintomáticas pela distribuição de material propagativo e ocorrências restritas da doença em outras regiões foram identificadas. Para diagnose confiável por PCR convencional, o DNA deve ser extraído de culturas de bactérias isoladas de tecido com sintomas suspeitos. Com a técnica, é possível detectar até 0,25 pg de DNA bacteriano total. Atualmente, métodos que empregam tecidos assintomáticos não estão disponíveis. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo sensível à detecção de Xcv por qPCR, empregando iniciadores disponíveis da técnica convencional.

Métodos para detecção de Clavibacter michiganense subsp. michiganense e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria em sementes de tomate.

Visando detectar Clavibacter michiganense subsp. michiganense (Cm) e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) em sementes de tomate, duas técnicas foram comparadas: meio semi-seletivo e planta indicadora. Os seguintes parâmetros foram avaliados: soluções extratoras de Cm e Xcv de sementes inteiras e moídas, especificidade e sensibilidade. Os resultados mostraram que os meios semi-seletivos MB1M (MB1 + telurito de potássio, ácido borico e benomil) e TAM (peptona, brometo de potássio, cloreto de cálcio, agar + Tween 80, cefalexina e clorotalonil), foram mais eficientes para detecção de Cm e Xcv, a partir de sementes moídas em tampão fosfato do que os meios disponíveis e, apresentaram maior especificidade e sensibilidade, detectando 10(2) - 10(3) ufc/ml de Cme Xcv em comparacao a 10(3) - 10(4) ufc/ml da inoculação em plântulas de tomateiro (cvs. Angela Gigante e Santa Cruz).

Clonagem e expressão do gene engXCA de Xanthomonas campestri pv. campestris em Saccharmyces cerevisiae e estudos das endoglucanases nativa e recombinante

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Cell-cell signal-dependent dynamic interactions between HD-GYP and GGDEF domain proteins mediate virulence in Xanthomonas campestris

RpfG is a paradigm for a class of widespread bacterial two-component regulators with a CheY-like receiver domain attached to a histidine-aspartic acid-glycine-tyrosine-proline (HD-GYP) cyclic di-GMP phosphodiesterase domain. In the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), a two-component system comprising RpfG and the complex sensor kinase RpfC is implicated in sensing and responding to the diffusible signaling factor (DSF), which is essential for cell-cell signaling. RpfF is involved in synthesizing DSF, and mutations of rpfF, rpfG, or rpfC lead to a coordinate reduction in the synthesis of virulence factors such as extracellular enzymes, biofilm structure, and motility. Using yeast two-hybrid analysis and fluorescence resonance energy transfer experiments in Xcc, we show that the physical interaction of RpfG with two proteins with diguanylate cyclase (GGDEF) domains controls a subset of RpfG-regulated virulence functions. RpfG interactions were abolished by alanine substitutions of the three residues of the conserved GYP motif in the HD-GYP domain. Changing the GYP motif or deletion of the two GGDEF-domain proteins reduced Xcc motility but not the synthesis of extracellular enzymes or biofilm formation. RpfG-GGDEF interactions are dynamic and depend on DSF signaling, being reduced in the rpfF mutant but restored by DSF addition. The results are consistent with a model in which DSF signal transduction controlling motility depends on a highly regulated, dynamic interaction of proteins that influence the localized expression of cyclic di-GMP.

Molecular signals required for type III secretion and translocation of the Xanthomonas campestris AvrBs2 protein to pepper plants

Strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) carrying avrBs2 are specifically recognized by Bs2 pepper plants, resulting in localized cell death and plant resistance. Agrobacterium-mediated transient expression of the Xcv avrBs2 gene in plant cells results in Bs2-dependent cell death, indicating that the AvrBs2 protein alone is sufficient for the activation of disease resistance-mediated cell death in planta. We now provide evidence that AvrBs2 is secreted from Xcv and that secretion is type III (hrp) dependent. N- and C-terminal deletion analysis of AvrBs2 has identified the effector domain of AvrBs2 recognized by Bs2 pepper plants. By using a truncated Pseudomonas syringae AvrRpt2 effector reporter devoid of type III signal sequences, we have localized the minimal region of AvrBs2 required for type III secretion in Xcv. Furthermore, we have identified the region of AvrBs2 required for both type III secretion and translocation to host plants. The mapping of AvrBs2 sequences sufficient for type III delivery also revealed the presence of a potential mRNA secretion signal.

Produção e sensibilidade de isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri a bacteriocinas

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Analysis of three Xanthomonas axonopodis pv. citri effector proteins in pathogenicity and their interactions with host plant proteins

Xanthomonas axonopodis pv. citri, the bacterium responsible for citrus canker, uses effector proteins secreted by a type III protein secretion system to colonize its hosts. Among the putative effector proteins identified for this bacterium, we focused on the analysis of the roles of AvrXacE1, AvrXacE2 and Xac3090 in pathogenicity and their interactions with host plant proteins. Bacterial deletion mutants in avrXacE1, avrXacE2 and xac3090 were constructed and evaluated in pathogenicity assays. The avrXacE1 and avrXacE2 mutants presented lesions with larger necrotic areas relative to the wild-type strain when infiltrated in citrus leaves. Yeast two-hybrid studies were used to identify several plant proteins likely to interact with AvrXacE1, AvrXacE2 and Xac3090. We also assessed the localization of these effector proteins fused to green fluorescent protein in the plant cell, and observed that they co-localized to the subcellular spaces in which the plant proteins with which they interacted were predicted to be confined. Our results suggest that, although AvrXacE1 localizes to the plant cell nucleus, where it interacts with transcription factors and DNA-binding proteins, AvrXacE2 appears to be involved in lesion-stimulating disease 1-mediated cell death, and Xac3090 is directed to the chloroplast where its function remains to be clarified.

Expression, crystallization and preliminary crystallographic analysis of PilZ(XAC1133) from Xanthomonas axonopodis pv. citri

Proteins containing PilZ domains are widespread in Gram-negative bacteria and have recently been shown to be involved in the control of biofilm formation, adherence, aggregation, virulence-factor production and motility. Furthermore, some PilZ domains have recently been shown to bind the second messenger bis(3'-> 5') cyclic diGMP. Here, the cloning, expression, purification and crystallization of PilZ(XAC1133), a protein consisting of a single PilZ domain from Xanthomonas axonopodis pv. citri, is reported. The closest PilZ(XAC1133) homologues in Pseudomonas aeruginosa and Neisseria meningitidis control type IV pilus function. Recombinant PilZ(XAC1133) containing selenomethionine was crystallized in space group P6(1). The unit-cell parameters were a = 62.125, b = 62.125, c = 83.543 angstrom. These crystals diffracted to 1.85 angstrom resolution and a MAD data set was collected at a synchrotron source. The calculated Matthews coefficient suggested the presence of two PilZ(XAC1133) molecules in the asymmetric unit.

Crystallization, data collection and data processing of maltose-binding protein (MalE) from the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri

Maltose-binding protein is the periplasmic component of the ABC transporter responsible for the uptake of maltose/maltodextrins. The Xanthomonas axonopodis pv. citri maltose-binding protein MalE has been crystallized at 293 Kusing the hanging-drop vapour-diffusion method. The crystal belonged to the primitive hexagonal space group P6(1)22, with unit-cell parameters a = 123.59, b = 123.59, c = 304.20 angstrom, and contained two molecules in the asymetric unit. It diffracted to 2.24 angstrom resolution.

Production of the refolded oligopeptide-binding protein (OppA) encoded by the citrus pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri

The oligopeptide-binding protein, OppA, binds and ushers oligopeptide substrates to the membrane-associated oligopeptide permease (Opp), a multi-component ABC-type transporter involved in the uptake of oligopeptides expressed by several bacterial species. In the present study, we report the cloning, purification, refolding and conformational analysis of a recombinant OppA protein derived from Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri), the etiological agent of citrus canker. The oppA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain under optimized inducing conditions and the recombinant protein remained largely insoluble. Solubilization was achieved following refolding of the denatured protein. Circular dichroism analysis indicated that the recombinant OppA protein preserved conformational features of orthologs expressed by other bacterial species. The refolded recombinant OppA represents a useful tool for structural and functional analyses of the X. citri protein.

Mutantes resistentes à Antibióticos em Xanthomonas Campestris (Fammel) Dowson

O presente trabalho, visou o estudo de mutantes resistentes à antibióticos na bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson. Foram obtidos mutantes resistentes à cinco antibióticos: penicilina, estreptomicina, aureomicina, cloranfenicol e éritromicina. O incremento de resistência em relação à linhagem original foi 4 vêzes para a penicilina, 8 para o cloranfenicol, 32 para a aureomicina e pelo menos 16 e 128 vêzes para a éritromicina e estreptomicina respectivamente. Em nenhum dos casos, verificou-se resistência cruzada ou sensibilidade colateral.

Comparação entre o crescimento de Xanthomonas Campestris (Pammel) Linhagens Mutantes resistentes a Antibióticos e Linhagens não Mutantes de Fammel Dowson

Foi comparado o crescimento de uma linhagem de Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson, com o crescimento de 3 linhagens dessa bactéria resistente à estreptomicina, penicilina e aureomicina. O crescimento da linhagem original, não diferiu do crescimento dos mutantes resistentes à estreptomicina e penicilina. O crescimento do mutante resistente à aureomicina foi mais lento do que o da linhagem original. O mutante resistente à estreptomicina apresentou o mesmo índice de crescimento, tanto em meio sem antibiótico, como em meio suplementado com a droga, o mesmo acontecendo com o mutante resistente à aureomicina. O mutante resistente à penicilina teve crescimento reduzido em meio suplementado com a droga em questão. Misturas de células sensíveis e resistentes à estreptomicina mantiveram-se constantes quanto à porcentagem de células sensíveis e resistentes inicialmente inoculadas, o mesmo acontecendo com a mistura de bactérias sensíveis e resistentes à penicilina. Houve uma variação nessas porcentagens, para o caso da aureomicina.

Resistência de Xanthomonas campestris com relação à tilosina e vancomicina

Foi estudada a resistência da bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson com relação a dois antibióticos: Tilosina e Vancomicina. Para a vancomicina, colônias resistentes apareceram até na mais alta concentração usada (256 mcg/ml.). Para a tilosina, em concentrações maiores que 128 mcg/ml não foram encontradas bactérias, resistentes. Tais resultados indicam que a X. campestris seguiu o modelo de "um só passo" para adquirir resistência a vancomicina e, o modelo de "múltiplos passos" com relação a resistência a tilosina.