Optimization of sample preparation for next-generation sequencing with Illumina Genome Analyzer II

The growing interest for sequencing with higher throughput in the last decade has led to the development of new sequencing applications. This thesis concentrates on optimizing DNA library preparation for Illumina Genome Analyzer II sequencer. The library preparation steps that were optimized include fragmentation, PCR purification and quantification. DNA fragmentation was performed with focused sonication in different concentrations and durations. Two column based PCR purification method, gel matrix method and magnetic bead based method were compared. Quantitative PCR and gel electrophoresis in a chip were compared for DNA quantification. The magnetic bead purification was found to be the most efficient and flexible purification method. The fragmentation protocol was changed to produce longer fragments to be compatible with longer sequencing reads. Quantitative PCR correlates better with the cluster number and should thus be considered to be the default quantification method for sequencing. As a result of this study more data have been acquired from sequencing with lower costs and troubleshooting has become easier as qualification steps have been added to the protocol. New sequencing instruments and applications will create a demand for further optimizations in future.

Diproline Templates as Folding Nuclei in Designed Peptides. Conformational Analysis of Synthetic Peptide Helices Containing Amino Terminal Pro-Pro Segments

The effect of N-terminal diproline segments in nucleating helical folding in designed peptides has been studied in two model sequences Piv-Pro-Pro-Aib-Leu-Aib-Phe-OMe (1) and Boc-Aib-Pro-Pro-Aib-Val-Ala-Phe-OMe (2). The structure of 1 in crystals, determined by X-ray diffraction, reveals a helical (RR) conformation for the segment residues 2 to 5, stabilized by one 4 -> 1 hydrogen bond and two 5 -> 1 interactions. The N-terminus residue, Pro(1) adopts a polyproline II (P-II) conformation. NMR studies in three different solvent systems support a conformation similar to that observed in crystals. In the apolar solvent CDCl3, NOE data favor the population of both completely helical and partially unfolded structures. In the former, the Pro-Pro segment adopts an alpha(R)-alpha(R) conformation, whereas in the latter, a P-II-alpha(R) structure is established. The conformational equilibrium shifts in favor of the P-II-alpha(R) structure in solvents like methanol and DMSO. A significant population of the Pro(1)- Pro(2) cis conformer is also observed. The NMR results are consistent with the population of at least three conformational states about Pro- Pro segment: trans alpha(R)-alpha(R), trans P-II-alpha(R) and cis P-II-alpha(R). Of these, the two trans conformers are in rapid dynamic exchange on the NMR time scale, whereas the interconversion between cis and trans form is slow. Similar results are obtained with peptide 2. Analysis of 462 diproline segments in protein crystal structures reveals 25 examples of the alpha(R)-alpha(R) conformation followed by a helix. Modeling and energy minimization studies suggest that both P-II-alpha(R) and alpha(R)-alpha(R) conformations have very similar energies in the model hexapeptide 1

Structure and conformation of the calcium complex of cyclo(Ala-Leu-Pro-Gly)2 in two crystal forms

Crystal structures of two different forms of the calcium perchlorate complex of cyclo(Ala-Leu-Pro-Gly)2 have been determined and refined using X-ray crystallographic techniques. Orthorhombic form: C32H52N8O8.Ca(ClO4)2.7H2O.2CH3OH, space group C222(1), a = 14.366, b = 18.653, c = 19.824 A, Z = 4, R = 0.068 for 2208 observed reflections. Monoclinic form: C32H52N8O8.Ca(ClO4)2.4H2O, space group C2, a = 21.096, b = 10.182, c = 11.256 A, beta = 103.33 degrees, Z = 2, R = 0.075 for 2165 observed reflections. The cyclic peptide molecule in both the structures has the form of a twofold symmetric, slightly elongated bowl. Type II' beta-turns, involving Gly and Ala at the corners, exist at the two ends of the molecule. The interior of the molecule is substantially hydrophilic, and the external surface of the bowl is largely hydrophobic. The calcium ion is located at the centre of the mouth of the bowl-like molecule. In both crystal forms, four peptide carbonyl oxygens from the cyclic peptide and two solvent oxygens coordinate to the metal ion. The mode of complexation may be described as incomplete encapsulation as, for example, in the case of metal complexes of antamanide. In the crystal structures the complex ions are held together by hydrogen bonds involving perchlorate ions and water molecules. The molecular structure observed in the crystals is entirely consistent with the results of solution studies, which also indicate the conformation of the cyclic peptide in the complex to be similar to that of the uncomplexed molecule.

Epithelial atrophy in oral submucous fibrosis is mediated by copper (II) and arecoline of areca nut

Exposure of oral cavity to areca nut is associated with several pathological conditions including oral submucous fibrosis (OSF). Histopathologically OSF is characterized by epithelial atrophy, chronic inflammation, juxtaepithelial hyalinization, leading to fibrosis of submucosal tissue and affects 0.5% of the population in the Indian subcontinent. As the molecular mechanisms leading to atrophied epithelium and fibrosis are poorly understood, we studied areca nut actions on human keratinocyte and gingival fibroblast cells. Areca nut water extract (ANW) was cytotoxic to epithelial cells and had a pro-proliferative effect on fibroblasts. This opposite effect of ANW on epithelial and fibroblast cells was intriguing but reflects the OSF histopathology such as epithelial atrophy and proliferation of fibroblasts. We demonstrate that the pro-proliferative effects of ANW on fibroblasts are dependent on insulin-like growth factor signalling while the cytotoxic effects on keratinocytes are dependent on the generation of reactive oxygen species. Treatment of keratinocytes with arecoline which is a component of ANW along with copper resulted in enhanced cytotoxicity which becomes comparable to IC50 of ANW. Furthermore, studies using cyclic voltammetry, mass spectrometry and plasmid cleavage assay suggested that the presence of arecoline increases oxidation reduction potential of copper leading to enhanced cleavage of DNA which could generate an apoptotic response. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling assay and Ki-67 index of OSF tissue sections suggested epithelial apoptosis, which could be responsible for the atrophy of OSF epithelium.

Efeitos cardiovasculares da transferência adotiva de linfócitos T reguladores em camundongos submetidos à infusão crônica de angiotensina II e de aldosterona

A angiotensina (Ang) II e aldosterona induzem hipertensão arterial por mecanismos em parte mediados pela imunidade adaptativa, envolvendo linfócitos T auxiliares respondedores (Tresp). Os linfócitos T reguladores (Treg) são capazes de suprimir os efeitos próinflamatórios do sistema imune. O presente estudo avaliou se a transferência adotiva de Treg é capaz de prevenir a hipertensão e a lesão vascular induzidas pela Ang II ou pela aldosterona, em dois protocolos distintos. No protocolo com Ang II, camundongos machos C57BL/6 sofreram a injeção endovenosa de Treg ou Tresp, sendo depois infundidos com Ang II (1μg/kg/min), ou salina (grupo controle) por 14 dias. No protocolo com aldosterona, um outro conjunto de animais sofreu injeções de Treg ou Tresp, sendo depois infundido com aldosterona (600μg/kg/d) ou salina (grupo controle), pelo mesmo intervalo de tempo. O grupo tratado com aldosterona recebeu salina 1% na água. Tanto o grupo Ang II como aldosterona apresentaram elevação da pressão arterial sistólica (43% e 31% respectivamente), da atividade da NADPH oxidase na aorta (1,5 e 1,9 vezes, respectivamente) e no coração (1,8 e 2,4 vezes, respectivamente) e uma redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina (de 70% e 56%, respectivamente), quando comparados com os respectivos controles (P<0,05). Adicionalmente, a administração de Ang II proporcionou um aumento rigidez vascular (P<0,001), na expressão de VCAM-1 nas artérias mesentéricas (P<0,05), na infiltração aórtica de macrófagos e linfócitos T (P<0,001) e nos níveis plasmáticos das citocinas inflamatórias interferon (INF)-γ, interleucina (IL)-6, Tumor necrosis factor (TNF)-α e IL-10 (P<0,05). Ang II causou uma queda de 43% no número de células Foxp3+ no córtex renal, enquanto que a transferência adotiva de Treg aumentou as células Foxp3+ em duas vezes em comparação com o controle. A administração de Treg preveniu o remodelamento vascular induzido pela aldosterona, observado na relação média/lúmen e na área transversal da média das artérias mesentéricas (P<0,05). Todos os parâmetros acima foram prevenidos com a administração de Treg, mas não de Tresp. Estes resultados demonstram que Treg são capazes de impedir a lesão vascular e a hipertensão mediadas por Ang II ou por aldosterona, em parte através de ações antiinflamatórias. Em conclusão, uma abordagem imuno-modulatória pode prevenir o aumento da pressão arterial, o estresse oxidativo vascular, a inflamação e a disfunção endotelial induzidos por Ang II ou aldosterona.

Pellino3 targets RIP1 and regulates the pro-apoptotic effects of TNF-∝

Tumour necrosis factor-a (TNF) can activate NF-?B to induce pro-inflammatory genes but can also stimulate the caspase cascade to promote apoptosis. Here we show that deficiency of the ubiquitin E3 ligase, Pellino3, sensitizes cells to TNF-induced apoptosis without inhibiting the NF-?B pathway. Suppressed expression of Pellino3 leads to enhanced formation of the death-induced signalling complex, complex II, in response to TNF. We show that Pellino3 targets RIP1, in a TNF-dependent manner, to inhibit TNF-induced complex II formation and caspase 8-mediated cleavage of RIP1 in response to TNF/cycloheximide co-stimulation. Pellino3-deficient mice also show increased sensitivity to TNF-induced apoptosis and greatly increased lethality in response to TNF administration. These findings define Pellino3 as a novel regulator of TNF signalling and an important determining factor in dictating whether TNF induces cell survival or death.

Bestimmung des Kostenverlaufs von Molkereiabteilungen in Abhängigkeit von der Kapazitätsgröße und -auslastung. II Teil:Abteilung Sprühtrocknung

In der vorliegenden Arbeit werden die Kosten der Sprüh­trocknung bei drei verschiedenen Kapazitätsgrößen mit jeweils variierender Kapazitätsauslastung nach einer speziellen Form der Teilkostenrechnung bestimmt. Die Kapazitätsgrößen betragen 10800, 21600 und 32400 kg Magermilch pro Stunde. Die verarbeiteten Milchmengen liegen zwischen 12,8 Mio. und 256,6 Mio. kg im Jahr; dabei variie­en die Stückkosten zwischen 4,80 und 1,78 Pf/kg Mm. Es hat sich dabei gezeigt, daß die Kostendegression bedeutend stärker durch den Grad der Kapazitätsauslastung als durch die Kapazitätsgröße beeinflußt wird.

A-kinase anchoring protein-Lbc promotes pro-fibrotic signaling in cardiac fibroblasts

In response to stress or injury the heart undergoes an adverse remodeling process associated with cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis. Transformation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts is a crucial event initiating the fibrotic process. Cardiac myofibroblasts invade the myocardium and secrete excess amounts of extracellular matrix proteins, which cause myocardial stiffening, cardiac dysfunctions and progression to heart failure. While several studies indicate that the small GTPase RhoA can promote profibrotic responses, the exchange factors that modulate its activity in cardiac fibroblasts are yet to be identified. In the present study, we show that AKAP-Lbc, an A-kinase anchoring protein (AKAP) with an intrinsic Rho-specific guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity, is critical for activating RhoA and transducing profibrotic signals downstream of type I angiotensin II receptors (AT1Rs) in cardiac fibroblasts. In particular, our results indicate that suppression of AKAP-Lbc expression by infecting adult rat ventricular fibroblasts with lentiviruses encoding AKAP-Lbc specific short hairpin (sh) RNAs strongly reduces the ability of angiotensin II to promote RhoA activation, differentiation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts, collagen deposition as well as myofibroblast migration. Interestingly, AT1Rs promote AKAP-Lbc activation via a pathway that requires the α subunit of the heterotrimeric G protein G12. These findings identify AKAP-Lbc as a key Rho-guanine nucleotide exchange factor modulating profibrotic responses in cardiac fibroblasts.

Recueil de pièces, manuscrites et imprimées, mémoires, arrêts, statuts, requêtes, factums, libelles, extraits des Registres du Parlement, etc., concernant l'Université de Paris, principalement pendant le XVIIe siècle. II.

On y remarque : Factums pour et contre Philippe de Buisine, docteur régent et doyen de la Faculté de décret, impr. (fol. 3, 11, etc.) ; — Discours de Philippe DE BUISINE, 1656, etc., in-4°, impr. (fol. 26, 29, 40) ; — « Franciscus DE ROYE, antecessor Andegavensis, ad capit. super specula 28 de privil. et excess. privil. apud Greg., ubi Apologeticus pro omnibus Galliarum antecessoribus, contra Parisienses canonici juris professores », Angers, Pierre Avril, 1665, in-4° de 58 pages, impr. (fol. 56) ; — « Pro omnibus Franciae antecessoribus praescriptio adversus canonistas Parisienses... », Bourges, Jean Toubeau, 1665, in-4° de 36 pages, impr. (fol. 118) ; — « Protrepticum ad Regem et omnes per Europam principes de usu et necessitate juris civilis Romanorum et ejus in integrum restituendi rationibus sive in Academiis sive in Tribunalibus », Bourges, Jean Toubeau, 1666, in-4° de 13 pages, impr. (fol. 136) ; — Copie d'un acte de Louis XIV, 1655 (fol. 158) ; — « Statuta Facultatis medicinae Parisiensis, 1660 », in-16 de 104 pages, impr. (fol. 164) ; — Factums et autres pièces imprimées concernant François Blondel, docteur régent en la Faculté de médecine, 1666 (fol. 217, etc.), — notamment : « Francisci BLONDELI, doctoris medici Parisiensis, ad clarissimum virum Petrum Alliot, Barroducaeum, ducis a Lotharingia consiliarium et medicum ordinarium, epistola de nuntio profligati sine ferro et igne carcinomatis, ducibus itineris Hippocrate et Galeno, nunc nuper ab eodem misso ad chirurgiae studiosos », 1666, in-4° de 38 pages, impr. (fol. 231) ; — « Antonii MENJOTII, consiliarii et medici regii, epistola apologetica de variis sectis amplectendis, ejusdemque epistolae adversus Hadriani Scauri ineptias defensio », 1666, in-4° de 32 pages, impr. (fol. 287) ; — Suite d'épigrammes et autres pièces de vers, en latin, concernant principalement des médecins, in-4°, impr. (fol. 303) ; — « ALETHOPHANIS archiatri ad Jacobum Thevartum, ex-medicum Parisiensem et R. M., hoc est reum manifestarium violati sacramenti nec non corruptae artis, epistola..., Eleutheris, typis notoriis, anno 1655 », in-4° de 35 pages, impr. (fol. 317) ; — « Lettre écrite à Monsieur Oldenburg, gentilhomme anglois et secrétaire de l'Académie royalle d'Angleterre, par Jean DENIS, docteur en médecine et professeur ez mathématiques, touchant les différens qui sont arrivez à l'occasion de la transfusion du sang », 1668, in-4° de 12 pages, impr. (fol. 336) ; — « Statuta honorandae nationis gallicanae », in-4° de 27 pages, impr. (fol. 345) ; — « Demande des docteurs de Sorbonne aux héritiers du cardinal de Richelieu, tant pour achever les bastimens de l'église et du collège, que pour l'entretien desdicts bastimens, à quoy a esté accordé 60.000 livres pour l'entretien des bastimens » (fol. 359) ; — « Fondatio et statuta Collegii et capellanie Cenomanensis pro pauperibus dioeceseos Cenomanicae, ut studeant in alma Universitate Parisiensi et secundum decreta ipsius vitam degant », in-8° de 45 pages, impr. (fol. 371) ; — « Contrat entre R. P. Charles de Beaumanoir, évesque du Mans, et les Jésuites du Collège de Clermont, par lequel une chapelle et un collège fondé par l'éminentissime cardinal de Luxembourg, pour entretenir des pauvres boursiers en l'Université de Paris, sont vendus et achetez à prix d'argent » [1625], in-8° de 24 pages (fol. 395) ; — « De statu Andegavensis Academiae Papirii MASSONI rectoris oratio... », 1571, in-8° de 16 pages non chiffrées, impr. (fol. 407) ; — « Sorbona instaurata, seu illustrissimo cardinali D. Joanni Armando de Richelieu, provisori Sorbonae, actio gratiarum Joannis FILESACI, doctoris theologi sorbonici », 1629, in-4° de 35 pages, impr. (fol. 415), — et « Gratulatio illustrissimi cardinalis », 1629, in-4° de 3 pages, impr. (fol. 432) ; — « Déclaration du Roy, portant establissement d'une Académie et Collège royal en la ville de Richelieu et les privilèges attribuez à icelle, ensemble les statuts et règlemens de ladite Académie », 1641, in-4° de 22 pages, impr. (fol. 435), — et copie manuscrite (fol. 679) ; — « La Fondation du Collège Mazarini » [1661], in-4° de 16 pages, impr. (fol. 447) ; — « Concordat fait entre MM. les exécuteurs de la fondation du Collège... Mazarini, et les religieux de la Congrégation de saint Maur, pour l'union de l'abbaye de S. Michel en l'Herm », Paris, Antoine Vitré, 1669, in-4° de 15 pages, impr. (fol. 455) ; — Pièces concernant le Collège d'Harcourt : Factum in-4°, impr. (fol. 463), — et « Statuta venerabilis Collegii Harcuriani », statuts de 1311, s. l. n. d., in-4° de 16 pages, impr. (fol. 503) ; — Pièces sur les « petites écoles », notamment : Acte orig. de Louis XIV, 6 mai 1675 (fol. 513), — et « Mémoires justificatifs des conclusions de l'Université sur le fait des petites escoles » (fol. 515) ; — Censure de l'Historia Universitatis Parisiensis de Du Boulay : « Excerpta ex opere M. Caesaris Egasse cognomento Bullaei, aliàs du Boulay, quod inscribitur : Historia Universitatis Parisiensis, contra fidem et sacram doctrinam », s. d., in-folio de 53 pages, impr. (fol. 526), — et « Notae ad censuram editam nomine Facultatis theologiae in opus quod inscribitur : Historia Universitatis Parisiensis » [1667], in-4° de 12 pages, impr. (fol. 552) ; — Copie d'un acte de Philippe VI de Valois, « certa gratia facta scolaribus Universitatis Aurelianensis », 1337 (fol. 581) ; — « Johannis ROBERTI, antecessorum Aurelianensium ordinis decani et consiliarii regii, de Aurelianensi juris utriusque schola instauranda oratio... », Orléans, Olivier Boynard, 1582, in-4° de 16 feuillets, impr. (fol. 586) ; — « Francisci GALTERI, Parisini, pro Academia oratio, habita pridie idus januarii, in aula Harcuriana... », 1597, in-16 de 42 pages, impr. (fol. 606) ; — Pièces concernant les messagers de l'Université (fol. 632, etc.) ; — Requête de l'Université contre les Jésuites (fol. 641) ; — « Mémoire pour l'establissement de quatre chaires de professeurs de théologie en l'Université d'Angers » (fol. 657).

Recueil d'actes des rois de France Philippe IV, Louis X, Philippe V, Charles IV, Philippe VI, Jean II, Charles V, Charles VI, des rois d'Aragon Alphonse IV et Pierre IV, du pape Clément VI, de Jean, frère de Charles V, duc de Berry, de Jean de Montfort, duc de Bretagne, de Henri de Savoisy, doyen de Langres, de Hugues Aubriot, garde de la prévôté de Paris. Copies.

Contient : 1 « Lictera quod gentes in obsequiis regis exeuntes pedagia vel costumas pro eorum victualibus non solvant ». Acte de PHILIPPE LE LONG. Paris, 10 janvier 1317. En latin ; 2 « Ordinacio super utilitate defectuum factorum in actione personali ». En latin ; 3 « Ordinacio super modo procedendi contra refformatores per regnum destinatos ». De 1325 à 1348. En français ; 4 « Ordinacio super falsa costuma vocata Hallebie ». Acte de CHARLES LE BEL. Mars 1325-1326. En français ; 5 Acte de PHILIPPE LE BEL, concernant un privilège accordé aux religieux du Mont Saint-Eloi par le roi saint Louis. En latin ; 6 « Ordinacio super regalia regis ». Acte inachevé de PHILIPPE VI, concernant le procès pendant « pour cause de la prebende de Chartres » entre « Me Estienne Rogier, d'une part, et Me Guillaume de S. Germain, presbtre, d'autre part ». Après 1334. En français ; 7-9 Actes de PHILIPPE VI de Valois ; 7 « Super convencionibus marcharum » concessarum « inter reges Francorum et Arragonum ». Contient un acte en latin du roi d'Aragon ALPHONSE IV, du mois de novembre 1332, et est daté du 22 août 1335. En français ; 8 « Idem ut supra ». Contient un acte en latin de PHILIPPE LE BEL, daté de Poissy, le 26 avril 1313. Paris, 17 octobre 1335. En latin ; 9 « Quid subditi regis Aragonum dicunt quod conventiones inter reges Francie et Arragonie infringebantur sub colore cujusdam statuti hic subscripti. Et sunt hic inserti tenores statuti et convencionum, querimonia et declaratio ». Paris, 28 octobre 1335. Cet acte en contient un de PHILIPPE VI, daté de Poissy, 6 novembre 1333, un de PHILIPPE LE BEL, daté de Poissy, 26 avril 1313, un de PHILIPPE VI, du 12 février 1333-1334. Tous ces actes sont en latin ; 10 Lettre du roi JEAN au roi d'Aragon Pierre IV. 10 août 1355. En latin ; 11-13 Actes en français de PHILIPPE VI de Valois ; 11 « Gracia facta gentibus de Calesio ». Amiens, 7 septembre 1347 ; 12 « La copie des lectres sur l'ordonnance des dons ». Chantecoc, 11 mai 1333 ; 13 « Lictera ad idem ». Brives, 27 décembre 1335 ; 14-19 Actes du roi JEAN ; 14 En faveur de Jacques Darten, chevalier, conseiller au parlement de Paris. Le roi l'exempte des péages et autres impôts qui auraient dû être perçus à l'entrée de Paris sur les objets de consommation à l'usage dudit Darten. 28 mars. Sans date d'année. En latin ; 15 Au sujet du testament laissé par Gilles de Senneville, physicien dudit roi. 2 janvier 1355-1356. En latin ; 16 « De renunciacione appellacionum ». 24 novembre 1354. En latin ; 17 « Mandatum regis ad causam canonicatus et prebende sancti Urbani Trecensis, quos rex contulerat Jacobo Cousin, et dux » Normanniae « contulerat Petro de Auxerio, quod prior sit pocior... Datum apud Chanteaus, die XXII decembris » 1361. En latin ; 18 « Mandatum clausum ad idem ». Dijon, 27 décembre 1360. En français ; 19 « Ordinacio facta Ambianis per regem Johannem super facto gentium armorum, refformatorum, Lombardorum, usurariorum et Judeorum ». Amiens, 5 décembre 1363. En français ; 20 « Revocatio domaniorum, facta per regem ». Acte de CHARLES V. Paris, 24 juillet 1364. En français ; 21 « Ordinaciones facte Remis per regem JOHANNEM de Judeis, de Lombardis, de refformatoribus et aliis officiariis regis. Reims, 21 octobre 1363. En français ; 22 « Bulla » papae CLEMENTIS VI, « quod non possit promulgari in regno Francie sentencia interdicti » ; 23 « Tractatus inter regem » Carolum V et Johannem IV de Monteforti, « ducem Britannie ». Acte de JEAN IV DE MONTFORT, duc DE BRETAGNE. « Donné en nostre ville de Guerande, le Xe jour du mois d'avril, l'an de grace mil CCC. et IIIIXX ». En français ; 24-25 Acte de CHARLES VI ; 24 Il accorde aux conseillers du parlement de Paris, de la chambre des enquêtes et des requêtes du palais et aux « greffiers d'icelles », et aussi à ses avocat et procureur en parlement, « que de l'imposicion et du quatreiesme du creu de leurs... heritaiges et vendu à detail et en gros sans marchandise et sans fraude, ilz soient franz, quictes et exempts doresenavant sans ce que on leurs en puisse aucune chose demander ». Paris, 14 mars 1397-1398. En français ; 25 Il déclare avoir mandé au chancelier Arnaud de Corbie de tenir « requestes generalles » et « en icelles » donner et faire « graces et remissions de tous cas » ; et il ordonne au parlement d'entériner lesd. graces et remissions ainsi prononcées. Paris, 13 mars 1401-1402. En français ; 26 Acte de PHILIPPE VI DE VALOIS, du 10 juillet 1336. S'adressant au bailli d'Amiens, il lui mande d'empêcher l'évêque d'Amiens de citer devant lui les bourgeois d'Amiens qui s'étaient rendus coupables d'adultères et de les condamner à des amendes. En latin ; 27-29 Actes de CHARLES VI ; 27 Ordonnance concernant les « cités, villes, chasteaulz et forteresses qui sont assises oultre la rivière de Loyre, et aussi... celles qui sont assises sur la mer et à six lieues prez en... Normandie, et semblablement... celles de... Picardie oultre la rivière de Soine (sic), et... toutes les autres qui sont en la frontière » du « royaume, en toutes les marches de l'empire », pour qu'il y soit diligemment fait « guet et garde de jour et de nuyt par les habitants des lieux ». Rouen, 22 octobre 1399. En français ; 28 « Lictera quod curia provideat reparacionibus ecclesiarum et edifficiorum ». Paris, 29 janvier 1414-1415. En latin ; 29 « Lictera signifficacionis, quod gentes parlamenti quicte sunt a decimis pape ». Paris, 15 juillet 1411. En latin ; 30 HENRI DE SAVOISY, doyen de Langres et receveur général de la décime imposée par le concile de l'église gallicane tenu naguères à Paris, s'adressant au receveur particulier de ladite décime dans le diocèse de Châlons, lui mande de surseoir la perception de la décime due par Me Jacque Bajulard, conseiller du roi en sa cour du parlement, jusqu'à nouvel ordre, les conseillers du parlement prétendant être exempts de ladite décime. Paris, 3 août 1412. En latin ; 31 Acte de CHARLES V : « Quod primogenitus regis in XIIII° anno censeatur major et pubes ad infrascripta ». Au Bois de Vincennes, au mois d'août 1374. En latin ; 32 « L'ordonnance faicte sur le grand scel du roy ». Acte de PHILIPPE LE LONG. Au mois de février 1320-1321. En français ; 33-34 Actes de CHARLES V, dauphin et roi ; 33 « Quod pro quibuscumque licteris regis non remictantur cause coram rege, nec differantur arresta ». Paris, 22 juillet 136. ». En latin ; 34 « Contra pedagiarios... Pronunciatum fuit die IXa maii millesimo CCCmo LXVI° ». En latin ; 35 « Decretalis » ; 36-37 Acte de CHARLES VI ; 36 Ordonnance concernant les débiteurs poursuivis pour leurs dettes. « Se aucun appelle de l'execucion de aucunes desd. lectres où il chiet garnison de main, en cas d'opposicion... le sergent ou autre executeur, qui sera commis à faire lad. execucion, ne surseira point de proceder en icelle, mais y procedera et pourra proceder et ne differera point aud. appel, jusques à ce que l'obligié aura garnye nostre main souffisamment, selon l'usaige et coustume du païs, de la somme pour laquelle sera requise ou commencée execucion contre luy ». Paris, 21 novembre 1384. En français ; 37 « Ordonnance sur le fait de la visitacion du domaine du roy et comme le roy succède aux bastards et autres gens aubains et espaves decedés sans hoirs naturelz ». Paris, 5 septembre 1386. En français ; 38 Acte de « JEHAN, filz du roy DE FRANCE, duc DE BERRY et d'Auvergne, et conte de Poictiers », confirmant les lettres par lesquelles son frère CHARLES V octroie « que il, ses hoirs, successeurs aians cause joïssent et usent paisiblement et perpetuellement à tousjours mès des domaines, justices, noblesses, seigneuries et aultres droiz des... duchés de Berry et d'Auvergne, de la conté de Poictiers, de Cholet, de Melle » audit duc appartenant, moyennant les réserves exprimées dans lesdites lettres de Charles V transcrites dans ledit acte. Ces lettres sont datées de Paris le 3 mars 1374-1375, l'acte du duc de Berry est du même mois. En français ; 39 « Ordinacio quod nullus in partibus occitanis et juris scripti ab interlocutoriis aut gravaminibus pro » differenda « solucione debitorum regiorum et jurium fiscalium, nisi tales sint interlocutorie vel gravamina, quod in diffinitiva reparari nequeant, nec eciam a debitorum ipsorum execucionibus nisi prius manu munita » audiatur « appellans ». Acte de CHARLES VI. Paris, 24 février 1391-1392. En latin ; 40-41 Actes de PHILLIPPE IV, dit LE BEL ; 40 Il accorde à Jean, duc de Bretagne, que ses sujets de Bretagne ne pourront être ajournés devant le parlement de Paris, « fours tant seulement en cas d'appel de deffault de droit ou de faulz et mauvaiz jugemens ou en autres cas appartenans » à la « souveraineté royal ». Février 1296-1297. Le duc de Bretagne est qualifié comte dans cet acte, qui est en français ; 41 « Aliud privilegium pro duce Britannie ». S'adressant aux baillis de Tours et de Coutances, il leur mande que les appellations des sujets bretons du duc de Bretagne ne seront reçues au parlement de Paris que dans le cas où ils seraient défendeurs. 1302-1303, le mardi avant l'Annonciation, c'est-à-dire le 19 mars. En latin ; 42 Acte de PHILIPPE V, dit LE LONG. Traduction en latin du texte français de l'acte de Philippe IV mentionné sous l'article 40. Paris, janvier 1316-1317 ; 43-47 Actes de CHARLES VI ; 43 « Ordinatio super sacramento confessionis dande et ministrande judicatis seu condempnatis ad mortem ». Paris, 11 février 1396-1397. En français ; 44 « Lictera quod nullus de patria juris scripti admictatur de cetero ad appellandum pro adherentibus aut adherere volentibus... nec ei per cancellariam nostram inhibitorie lictere concedantur, nisi prius constiterit appellacioni sic interposite adherentes vel adherere volentes infra decem dies adhesisse ». Paris, 1399. En latin ; 45 Le roi, s'adressant aux « generaulz conseilliers à Paris sur le fait des aides ordonnées pour la guerre », leur mande expressément qu'ils fassent « tenir quictes et paisibles de l'imposicion et du IIIIme du creu de leurs heritaiges vendu à détail et en gros sans marchandise et sans fraude », les conseillers, les gens de son parlement à Paris, de la chambre des enquêtes et des requêtes du palais et les greffiers de ces cours et aussi les avocat et procureur du roi au parlement. En français. Paris, 12 août 1400 ; 46 « Lectres notables sur le faict des finances » et de la « justice des aydes » ; touchant le domaine, les eaux et forêts, les monnaies, le parlement, la chambre des comptes, les maîtres des requêtes de l'hôtel, les secretaires des conseils, le grand conseil, reduisant le nombre des offices et introduisant l'élection pour les offices du parlement. Paris, 7 janvier 1400-1401. En français ; 47 Il ordonne « que tous ceulz qui ont esté pourveuz à prelatures ou autres dignités et ausquelz aucuns benefices ont esté conferés par les ordinaires » durant le temps de la soustraction du royaume à l'obéissance du pape, « supposé que lesd. prelatures, dignités ou benefices feussent paravant reservés à court de Romme, demeurent paisiblement en possession et saisine de leurs prelatures, dignités et benefices, et qu'ilz en joïssent sans empeschemens quezlconques et qu'ilz ne soient contrains à paier au pape ou à ses collecteurs ou commis... aucune finance », et ainsi soit-il de ceux qui ont été pourvus avant ladite soustraction ou depuis la restitution de l'obéissance au pape. Paris, 19 décembre 1403. En français ; 48-51 Actes de PHILIPPE VI ; 48 « Lictera » de tutore sive curatore dando ad litem pendentem inter heredes comitis de « Dampno Martino, ex parte una, et heredes Johannis « de Tria, ex altera, racione castri de Monciaco ». 1330. En latin ; 49 « De erroribus proponendis contra arresta curie parlamenti ». 1331 ou 1342. En latin ; 50 Formule concernant la compétence des sergents royaux. S. D. En latin ; 51 « Lictera de non dando officia antequam de facto vacent ». En français. Poncourt, 9 juillet 1341 ; 52 Acte de PHILIPPE V LE LONG. Les gens de son hôtel sont exempts du péage et des autres impôts pour les vivres qu'ils font venir pour leur usage. Paris, 10 janvier 1317-1318. En latin ; 53-55 Actes de PHILIPPE VI DE VALOIS ; 53 « Ordinatio super regalia regis ». Vincennes, octobre 1334. En français ; 54 « Ordinaciones regis facte super redditibus solvendis ob causam mutacionis pecunie seu monete ». Paris, 27 janvier 1347-1348. En français ; 55 « Ordonnance que les sergens ramenans la complaincte sur le lieu fairont resaisir reaulment et de faict, avant que recevoir l'opposant à opposition ». 1347, « post festum beati Martini yemalis ». En latin ; 56 Acte de CHARLES V : « Ordinaciones requestarum ». Paris, novembre 1364 ; 57 « Extractum ordinacionum super juridicione connestabularii, marescallorum, magistrorum hospicii, magistrorum requestarum, admiraldi, magistri balistariorum et magistrorum aquarum et forestarum ». Extrait d'une ordonnance du roi JEAN, du 28 décembre 1355, par HUGUES AUBRIOT, garde de la prévôté de Paris, à la requête de « messire Freslin, marquis de Saluches et seigneur de Montjay », extrait fait le mardi 12 février 1380-1381. En français ; 58 Acte de CHARLES VI : « Nove ordinaciones facte super refformacione ecclesiastici regiminis ». Paris, en l'hôtel St-Paul, le 6 octobre 1385. En latin ; 59 Acte de LOUIS X LE HUTIN, par lequel étant à Vincennes, au mois de décembre 1314, il vidime un acte de PHILIPPE LE BEL du 9 mai 1302, « touchant la jurisdiction ecclesiastique ». En latin ; 60 Deux articles d'une ordonnance de PHILIPPE LE BEL, du 26 février 1305, le premier sur de nouveaux péages, le second sur une nouvelle levée de décimes imposée par les prélats et autres personnes ecclésiastiques, contre laquelle il ordonne au sénéchal de Toulouse de défendre les consuls et les villes. En latin ; 61 Lettres de LOUIS LE HUTIN, adressées aux baillis d'Amiens, de Vermandois, de Senlis, et provoquées par les supplications de l'évêque de Beauvais, Jean de Marigny, pour leur rappeler son ordonnance donnée à Vincennes au mois de décembre 1315, « pro libertate ecclesiastica », les six ordonnances de Philippe le Bel, dont il donne les premiers mots, et une autre ordonnance de lui-même ; 62-65 Actes de CHARLES VI ; 62 Lettre au bailli d'Amiens, sur la plainte de Jean de Boissi, évêque d'Amiens, au sujet d'un cri fait « au siège de Grantvillier », que l'évêque regardait comme portant atteinte à sa juridiction. Paris, 7 mars 1404-1405. En français ; 63 Ordonnance qui prescrit au prévôt de Paris et aux baillis et sénéchaux, ce qu'ils doivent faire pour mettre en bon état les biens dépendants des bénéfices », pour mettre en sûreté les effets de succession des évêques et des autres bénéficiers. Paris, en l'hôtel St-Paul, 6 octobre 1385. En latin ; 64 Ordonnance touchant l'aliénation du domaine. Paris, 28 février 1401-2. En français ; 65 Fin d'un acte du 7 mars 1404-1405. En français ; 66 « Extraict des registres de parlement » touchant « la cause d'entre le conte de Brayne, d'une part, et l'evesque de Terouane, d'autre... Fait en parlement, le mardi 24e jour de may » 1463. En français

Modulation de l’expression du récepteur B1 des kinines par l’angiotensine II et l’endothéline-1 dans des cellules musculaires lisses vasculaires

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension.

Effet du bosentan sur les niveaux d'inflammation systémique et rénale chez des patients avec néphropathie diabétique traités par bloqueurs de récepteurs de l'angiotensine II

Outre les facteurs métaboliques et hémodynamiques, l’inflammation est actuellement considérée comme un facteur pathogénique potentiel de la néphropathie diabétique (ND), pouvant contribuer à l’initiation et à la progression de la maladie. Les mécanismes menant au développement de l’inflammation rénale dans la ND sont encore peu connus, bien qu’une augmentation d’activité des systèmes rénine angiotensine (RAS) et de l’endothéline (ET) semble y contribuer. L’objectif général de cette étude mono-centre, à double aveugle, randomisée et incluant un groupe placebo était de démontrer que l’inhibition simultanée du RAS et du système de l’ET chez des patients avec ND induisait des effets rénoprotecteurs et anti-inflammatoires supérieurs à ceux observés par blocage du RAS seul. L’objectif spécifique de notre étude était d’évaluer la possibilité que l’administration d’un bloqueur des récepteurs de l’ET-1, le bosentan, à des patients atteints de ND et traités par bloqueurs des récepteurs de l’angiotensine II (BRA), réduisait, chez ces derniers, la protéinurie et les marqueurs inflammatoires systémiques et rénaux. Ce travail constitue un rapport d’un cas clinique et illustre les résultats obtenus suite à l’administration pendant 16 semaines du bosentan chez un patient diabétique de type 2 avec néphropathie clinique traité au long cours par BRA. Le protocole de recherche comprenait 6 visites médicales à 4 semaines d’intervalle, la première visite (V1) correspondant au recrutement du patient, la deuxième visite (V2) constituant le temps 0 de l’étude et la dernière visite (V6) représentant la fin de l’étude. Des échantillons de sang et d’urine étaient prélevés à 3 reprises soit à V2, V4 c’est-à-dire 8 semaines après le début du traitement et à V6 soit 16 semaines après le début du traitement pour mesure des taux sériques et urinaires de divers facteurs pro-inflammatoires incluant l’ET-1, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), l’interleukine-6 (IL-6), le facteur chémoattractant des monocytes-1 (MCP-1), la molécule d’adhésion intracellulaire-1 (ICAM-1), la molécule d’adhésion vasculaire-1 (VCAM-1) et la protéine C-réactive (CRP). Un profil lipidique était aussi déterminé au début et à la fin de l’étude. La fonction rénale était mesurée aux visites V1, V2, V4 et V6 par détermination du taux de filtration glomérulaire (TFG) et de l’excrétion urinaire d’albumine (UAE). Des tests biochimiques de routine étaient aussi faits à chaque visite. La corrélation entre les paramètres inflammatoires et rénaux sous étude et la filtration glomérulaire était enfin déterminée. Nos résultats chez ce sujet ont démontré que le bosentan réduisait l’UAE de 32 % et 35% aux semaines 8 et 16, et ce, sans affecter la pression artérielle ou la filtration glomérulaire. L'effet anti-protéinurique du bosentan était associé à une réduction des concentrations urinaires de VCAM-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α et d’ET-1 ainsi qu’à une diminution des concentrations sériques de TNF-α. Le changement dans la protéinurie était corrélé de manière positive avec les changements des niveaux urinaires de VCAM-1 (r=0.86), ICAM-1 (r=0.88), ET-1 (r=0.94), et du TNF-α (r=0.96) ainsi qu’avec les changements des niveaux sériques de TNF-α (r=0.98). Ces données suggèrent que l’inhibition du système de l’ET induit dans la ND des effets rénoprotecteurs additifs à ceux observés par blocage du RAS seul. Ils supportent le concept que l’activation du système de l’ET au niveau rénal, par ses effets inflammatoires, puisse jouer un rôle important dans la pathogenèse de la ND. L’effet anti-inflammatoire et anti-protéinurique du bosentan constitue une découverte intéressante susceptible d’engendrer dans le futur une alternative thérapeutique et préventive dans la prise en charge de la ND.

Conception, synthèse et diversification de l'azaGly-Pro : un mime de tour beta, outil d'étude structure-activité : application au développement d'un nouvel agent tocolytique

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré.

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.