Interrelation entre déficits métaboliques et neuropathologie associée à la maladie d’Alzheimer chez la souris 3xTg-AD

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative qui cause le plus important nombre de cas de démence. On estime que près de 15% des canadiens âgés de plus de 65 ans sont atteints de la MA. Avec le vieillissement de la population, le nombre de cas augmentera de manière substantielle dans les prochaines années. À l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de ralentir la progression de la maladie. Pour plus de 99% des cas, ses causes exactes demeurent indéterminées. Toutefois, de nombreux facteurs de risque ont été identifiés. Parmi eux, on retrouve plusieurs facteurs liés au métabolisme énergétique dont l’obésité et le diabète de type 2 (DT2). De manière intéressante, des modifications du métabolisme, telles qu’une résistance à l’insuline centrale et périphérique, sont également observées chez les patients Alzheimer. Afin de mieux comprendre l’interaction entre le DT2 et la MA, nous avons d’abord étudié les altérations métaboliques chez la souris triple transgénique (3xTg-AD), un modèle murin de la MA. Nous avons, en premier lieu, observé une intolérance au glucose qui progresse avec l’âge, qui est plus importante chez les femelles et qui semble liée à l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) humain dans le pancréas. Ensuite, nous avons nourri cette souris avec une diète riche en gras pour vérifier l’impact d’une aggravation des déficits métaboliques sur la pathologie Alzheimer. L’aggravation de l’intolérance au glucose chez les souris 3xTg-AD semblait liée à l’atrophie des îlots de Langerhans et, en conséquence, à une réduction de la production d’insuline en réponse à l’injection de glucose. En plus de l’aggravation des déficits métaboliques, la diète riche en gras a augmenté de manière drastique l’accumulation de la forme soluble du peptide Aβ dans le cortex et a déterioré la mémoire des souris 3xTg-AD. De manière intéressante, l’élévation du peptide Aβ et les troubles de la mémoire ont été rétablis par l’administration d’une seule dose d’insuline. Aussi, nous avons observé une augmentation du peptide Aβ dans le plasma 30 minutes à la suite de l’injection d’insuline, suggérant qu’il est possible que la baisse rapide du peptide soit en partie causée par une élévation de la clairance du peptide au cerveau. Ces résultats renforcent les évidences supportant le potentiel thérapeutique de l’insuline dans le traitement de la MA. Toutefois, les résultats chez les patients mettent en lumière l’inefficacité de l’administration intranasale d’insuline chez les porteurs de l’allèle 4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOE4). Afin de comprendre les raisons qui expliquent cette différence de réponse à l’insuline chez les porteurs de l’APOE4, nous avons injecté des souris exprimant l’APOE3 et l’APOE4 humain avec de l’insuline dans le but de vérifier l’effet central et périphérique de l’insuline chez ces animaux. Les souris APOE4 montrent une plus importante élévation de la signalisation de l’insuline au cerveau comparativement aux souris APOE3. Cette plus haute réponse est aussi associée à une élévation plus importante de la phosphorylation de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la MA. En somme, ces résultats suggèrent qu’il existe un cercle vicieux entre la MA et le DT2. L’administration d’insuline a un potentiel thérapeutique intéressant pour la MA, malgré des effets limités chez les patients APOE4 en raison de son impact probable sur la phosphorylation de la protéine tau.

Modulation du cytochrome P450 par l’insuffisance rénale chronique dans un modèle murin transgénique

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une diminution de la clairance métabolique des médicaments résultant en partie de l’inhibition des cytochromes P450 (CYP450) et des enzymes de phase II, notamment la N-acétyltransférase 2 (NAT2), tel que démontré chez le rat. Nous avons précédemment démontré le rôle de l'hormone parathyroïdienne (PTH) dans la diminution des CYP450 hépatiques chez le rat souffrant d’IRC. Toutefois, l’étude des mécanismes sous-jacents pouvant être facilitée par l’utilisation de souris transgéniques, l’objectif de cette étude consiste à confirmer ces résultats dans un modèle murin. D’abord, afin de valider ce modèle expérimental, une IRC a été induite par néphrectomie subtotale 3/4 chez des souris C57BL/6, puis l’expression protéique et génique des CYP450 et de la Nat2 hépatiques a été étudiée. Les résultats indiquent que l’IRC induit effectivement une diminution d’expression de ces enzymes dans un modèle murin. Ensuite, des souris mutantes pour le gène codant la PTH (PTH-/-) et les souris correspondantes de type sauvage (PTH+/+) ont été néphrectomisées, puis l’expression protéique et génique des CYP450 hépatiques a été analysée. Si la PTH est responsable de la diminution du CYP450 en situation d’IRC, les souris PTH-/- atteintes d’IRC ne devraient présenter aucune baisse d’expression. Les résultats obtenus pour les souris PTH-/- ne peuvent être interprétés, puisque chez les souris PTH+/+ atteintes d'IRC, le CYP450 hépatique est inchangé par rapport aux souris PTH+/+ témoins. Des expériences supplémentaires seront requises afin de déterminer si la régulation à la baisse du CYP450 précédemment observée est contrecarrée par l’absence de PTH.

Exploration pathologique des souris transgéniques porteuses du gène VPU de VIH-1

L‟infection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le système immunitaire et conduit à une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par conséquent, entraîne un état d‟immunodéficience. Cette immunodéficience permet l'établissement d‟infections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associées au Sida. Ces patients peuvent aussi développer des lymphomes, lésions du système nerveux central et une atteinte rénale. L'ampleur et la sévérité des conditions associées observées chez les patients infectés par le VIH-1 ne peuvent être imputées seulement au processus infectieux et à la déplétion des cellules T CD4+. Ceci suggère que les produits des gènes de régulation pourraient avoir des effets cytopathogènes. Cependant, les études sur la physiopathogenèse induite par le VIH ou ses différents gènes ont été difficiles à mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infectés par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider à disséquer le rôle des différents composants du génome viral et les mécanismes pathogénétiques impliqués. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modèle de souris transgéniques pour le gène vpu. Vpu code pour une phosphoprotéine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions à la surface cellulaire, induit la dégradation des CD4, induit la régulation négative des CMH-1, augmente la susceptibilité à la mort cellulaire des lymphocytes T infectés par le VIH et favorise la réplication virale en empêchant les mécanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractérisé pathologiquement un modèle de souris transgéniques porteuses du gène vpu du VIH-1. Nos résultats démontrent que l‟expression de vpu chez les souris transgéniques induit le développement spontané d‟une hyperplasie lymphoïde pansystémique, une splénomégalie avec une hyperplasie lymphoïde folliculaire évoluant en lésions prémalignes et malignes qui présentent certaines similarités avec la maladie de Castleman et une iv glomérulonéphrite mesangioproliférative qui rappelle certaines altérations de néphropathie associée au VIH chez les patients infectés. L‟ensemble des altérations démontre que les souris Tg/vpu développent une activation chronique et non spécifique du système immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une dérégulation de l‟IL-6 et une hyperplasie du réseau de cellules métallophiliques pourraient être impliquées. D‟autres résultats obtenus sur les évaluations du fonctionnement du système immunitaire de la rate et du thymus mettent en évidence une susceptibilité augmentée des lymphocytes des tissus lymphoïdes aux effets apoptotiques de la dexaméthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules d‟organes lymphoïdes ainsi qu‟une réaction inflammatoire (Schwartzman) exacerbée et des anomalies dans la réaction d‟hypersensibilité retardée expérimentale. Ce modèle transgénique reproduit plusieurs anomalies rencontrées chez les patients infectés par le VIH et ouvre de nouvelles hypothèses sur la pathogenèse de l‟infection par le VIH.

Développement ontogénique des lymphocytes B chez la souris et inactivation de jeunes lymphocytes B par un antigène

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Exercice physique et athérosclérose : quels sont les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'exercice qui préviennent et protègent de l'athérosclérose? : approche chez un modèle expérimental d'athérosclérose : la souris génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-)

RESUME : L'athérosclérose, pathologie inflammatoire artérielle chronique, est à l'origine de la plupart des maladies cardiovasculaires qui constituent l'une des premières causes de morbidité et mortalité en France. Les études observationnelles et expérimentales montrent que l'exercice physique prévient la mortalité cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes précisant les bénéfices cliniques de l'exercice sur l'athérosclérose sont encore largement inconnus. Le but général de ce travail a donc été d'explorer, en utilisant un modèle expérimental d'athérosclérose, la souris hypercholestérolémique génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-), les mécanismes athéroprotecteurs de l'exercice. La dysfonction endothéliale, généralement associée aux facteurs de risque cardiovasculaire, serait l'une des étapes précoces majeures de l'athérogenèse. Elle est caractérisée par une diminution de la biodisponibilité en monoxyde d'azote (NO) avec la perte de ses propriétés vasculo-protectrices, ce qui favorise un climat pro-athérogène (stress oxydatif, adhésion et infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi artérielle...) conduisant à la formation de la plaque athéromateuse. L'objectif de notre premier travail a donc été d'explorer les effets de l'exercice d'une part, sur le développement des plaques athéromateuses et d'autre part, sur la fonction endothéliale de la souris apoE-/-. Nos résultats montrent que l'exercice réduit significativement l'extension de l'athérosclérose et prévient la dysfonction endothéliale. L'explication pharmacologique montre que l'exercice stimule la fonction endothéliale via, notamment, une plus grande sensibilité des récepteurs endothéliaux muscariniques, ce qui active les événements signalétiques cellulaires récepteurs-dépendants à l'origine d'une bioactivité accrue de NO. Les complications cliniques graves de l'athérosclérose sont induites par la rupture de la plaque instable provoquant la formation d'un thrombus occlusif et l'ischémie du territoire tissulaire en aval. L'objectif de notre deuxième travail a été d'examiner l'effet de l'exercice sur la qualité/stabilité de la plaque. Nos résultats indiquent que l'exercice de longue durée stabilise la plaque en augmentant le nombre de cellules musculaires lisses et en diminuant le nombre de macrophages intra-plaques. Nos résultats montrent aussi que la phosphorylation de la eNOS (NO Synthase endothéliale) Akt-dépendante n'est pas le mécanisme moléculaire majeur à l'origine de ce bénéfice. Enfin, dans notre troisième travail, nous avons investigué l'effet de l'exercice sur le développement de la plaque vulnérable. Nos résultats montrent, chez un modèle murin de plaque instable (modèle d'hypertension rénovasculaire à rénine et angiotensine II élevés) que l'exercice prévient l'apparition de la plaque vulnérable indépendamment d'un effet hémodynamique. Ce bénéfice serait associé à une diminution de l'expression vasculaire des récepteurs AT1 de l'Angiotensine II. Nos résultats justifient l'importance de l'exercice comme outil préventif des maladies cardiovasculaires. ABSTRACT : Atherosclerosis, a chronic inflammatory disease, is one of the main causes of morbidity and mortality in France. Observational and experimental data indicate that regular physical exercise has a positive impact on cardiovascular mortality. However, the mechanisms by which exercise exerts clinical benefits on atherosclerosis are still unknown. The general aim of this work was to elucidate the anti-atherosclerotic effects of exercise, using a mouse model of atherosclerosis: the apolipoprotein E-deficient mice (apoE-/- mice). Endothelial dysfunction, generally associated with cardiovascular risk factors, has been recognized to be a major and early step in atherogenesis. Endothelial dysfunction is characterized by Nitric Oxide (NO) biodisponibility reduction with loss of NO-mediated vasculoprotective actions. This leads to vascular effects such as increased oxidative stress and increased adhesion of inflammatory cells into arterial wall thus playing a role in atherosclerotic plaque development. Therefore, one of the objective of our study was to explore the effects of exercise on atherosclerotic plaque extension and on endothelial function in apoE-/- mice. Results show that exercise significantly reduces plaque progression and prevents endothelial dysfunction. Pharmacological explanation indicates that exercise stimulates endothelial function by increasing muscarinic receptors sensitivity which in turn activates intracellular signalling receptor-dependent events leading to increased NO bioactivity. The clinical manifestations of atherosclerosis are the consequences of unstable plaque rupture with thrombus formation leading to tissue ischemia. The second aim of our work was to determine the effect of exercise on plaque stability. We demonstrate that long-term exercise stabilizes atherosclerotic plaques as shown by decreased macrophage and increased Smooth Muscle Cells plaque content. Our results also suggest that the Akt-dependent eNOS phosphorylation pathway is not the primary molecular mechanism mediating these beneficial effects. Finally, we assessed a putative beneficial effect of exercise on vulnerable plaque development. In a mouse model of Angiotensine II (Ang II)-mediated vulnerable atherosclerotic plaques, we provide fist evidence that exercise prevents atherosclerosis progression and plaque vulnerability. The beneficial effect of swimming was associated with decreased aortic Ang II AT1 receptor expression independently from any hemodynamic change. These findings suggest clinical benefit of exercise in terms of cardiovascular event protection.

Abelis Souris, Rothomagensis, ad Cardinalem Borbonium tragoedia de sinistro fato Gallorum apud Veromanduos ; acta primùm Lutetiae, Remigialibus ludis, à Secundis Navarricis anno 1557.

Mazarinaeus

Nouvelle vague d'OGM dans nos assiettes : Qu'en est-il du cadre législatif canadien à l'égard du saumon transgénique ?

Marie-Ève Couture-Ménard, Étudiante à la maîtrise (Faculté de droit, Université de Montréal, Directrice de recherche : T. Leroux)

Évaluation neurobiologique des souris spontanément hypertendues : Du vieillissement à la génomique comparative

Le but de cette thèse est premièrement d’évaluer l’effet du vieillissement sur les fonctions psychomotrices des souches de souris sélectionnées génétiquement en fonction de leur tension artérielle (TA); deuxièmement, de localiser les déterminants génétiques des phénotypes psychophysiologiques à partir de souches recombinantes congéniques (RCS). Ces travaux ont mené à la publication de 4 articles. Le premier article décrit l’évaluation des fonctions psychomotrices des souches avec une tension artérielle élevée (HBP), basse (LBP) et normale (NBP). La performance aux épreuves d’exploration, d’habiletés motrices et d’apprentissage spatial, a été mesurée sur deux cohortes âgées respectivement de 12 mois et de trois mois. Indépendamment de l’âge, les HBPs sont hyperactives dans l’open-field (OF), mais pas dans le test d’exploration de trous. Inversement, les LBP explorent moins d’espaces que les NBP et, à trois mois seulement, sont hypoactives dans l’OF. Par ailleurs, les HBPs et les LBP présentent des déficits précoces de coordination motrice et des fonctions visuo-motrices. Le second article concerne l’évaluation longitudinale de la coordination motrice, de l’anxiété et de l’apprentissage spatial des souches HBP, LBP et NBP, à l’âge de deux mois et de 12 mois. Le vieillissement accentue l’hyperactivité des HBPs dans l’OF. Par contre, l’hypoactivité des souris LBP est détectable seulement à l’âge de deux mois. Indépendamment de l’âge, les souris HBP et LBP montrent une perception réduite du danger dans l’épreuve d’anxiété et des dysfonctions visuo-motrices au labyrinthe aquatique. Enfin, des déficits précoces de coordination motrice se manifestent seulement chez les HBPs. Il reste à déterminer si les déficits observés sont liés à des déterminants génétiques indépendants ou secondaires aux altérations de la tension artérielle. Le troisième article présente la comparaison entre les souches consanguines A/J et C57Bl/6J (B6) aux épreuves de l’OF, de la planche à trous, du labyrinthe aquatique et du cintre (coordination motrice). Les B6 explore d’avantage l’OF et la planche à trous. Les B6 sont moins rapides sur le cintre, mais supérieurs aux A/J dans le labyrinthe aquatique, avec une plate-forme invisible ou visible. Ces résultats démontrent l’implication de déterminants génétiques. Cette thèse se termine par un quatrième article sur la localisation des déterminants génétiques de la susceptibilité au stress dans les RCS, dérivées de A/J et B6, et présentant un agencement spécifique de 12.5% du génome. La réactivité émotionnelle est évaluée dans l’OF et le plus-maze; la réponse de stress est mesurée par radio télémétrie de la température interne pendant le stress d’immobilisation (SI) sous diète régulière et riche en sel; l’excrétion des électrolytes urinaires est dosée après 24 heures de diète salée. Les loci les plus significatifs sont situés dans les régions suivantes: de l’émotionalité dans l’OF (Emo1) sur le chr. 1 (LOD=4.6) correspondant à la région homologue impliquée dans la cohorte d’hypertension familiale du Saguenay; de la dopa décarboxylase (ddc) sur le chr. 11 pour l’émergence du plus-maze (LOD=4.7); de la protéine liant l’endotoxine (lbp) sur le chr. 2 pour l’hypothermie initiale en réponse au SI (LOD=4); et de HSP90 sur le chr. 12 pour l’excrétion de Ca++ (LOD=4.6). Des banques de données sont ensuite interrogées pour recenser les polymorphismes des régions régulatrices ou codantes des gènes candidats chez les souches ancestrales A/J et B6, dont les séquences sont disponibles pour le génome entier. Des utilitaires web permettent de dévoiler les changements dans la structure secondaire de l’ARNm, l’interférence avec des microARN ou avec d’autres motifs de liaison. Plusieurs SNPs fonctionnels ont été identifiés pour le QTL du chr. 1, particulièrement dans les éléments de régulation; ceux-ci impliquant des gènes reliés avec les réponses inflammatoire/immunitaire ou avec le système cardiovasculaire. La quantification par la PCR confirme une régulation à la baisse d’atp1a2 dans le cœur et le cerveau des souches susceptibles à l’anxiété. Ces résultats confirment l’intrication des altérations de la susceptibilité au stress et de la régulation de la TA.

Étude de la fonction ovarienne chez les souris déficientes des enzymes hyaluronidases

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

Rôle du système rénine-angiotensine intrarénal dans l’hypertension et les dommages rénaux chez les souris transgéniques diabétiques

Plusieurs expériences et études cliniques ont démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) peut induire l’hypertension, un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et rénales. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique substrat du RAS. Cependant, il n’a pas encore été démontré si l’activation du RAS intrarénal peut à elle seule induire des dommages rénaux, indépendamment de l’hypertension systémique, et ainsi jouer un rôle prépondérant dans la progression de la néphropathie diabétique. Afin d’explorer le rôle du RAS intrarénal dans les dommages rénaux, un diabète a été induit par l’injection de streptozotocin chez des souris transgéniques (Tg) surexprimant l’Agt de rat dans les cellules des tubules proximaux du rein (RPTC). Les souris Tg diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS (perindopril et losartan), de l’insuline ou une combinaison des deux pour 4 semaines avant d’être euthanasiées. Pour une autre étude, des souris Tg non-diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS, l’hydralazine (vasodilatateur) ou l’apocynine (inhibiteur de la NADPH oxydase) pour une période de 8 semaines avant l’euthanasie. Des souris non-Tg ont été utilisées comme contrôles. Des cellules immortalisées de tubule proximal de rat (IRPTC) transfectées de manière stable avec un plasmide contenant l’Agt ou un plasmide contrôle ont été employées comme modèle in vitro. Nos résultats ont démontré que les souris Tg présentaient une augmentation significative de la pression systolique, l’albuminurie, l’apoptose des RPTC et l’expression de gènes pro-apoptotiques par rapport aux souris non-Tg. Les mêmes changements ont été observés chez les souris Tg diabétiques par rapport aux souris non-Tg diabétiques. L’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS ont permis d’atténuer ces changements, sauf l’hypertension qui n’était réduite que par les inhibiteurs du RAS. Chez les IRPTC transfectées avec l’Agt in vitro, les hautes concentrations de glucose augmentent l’apoptose et l’activité de la caspase-3 par rapport aux cellules contrôles et l’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS empêchent ces augmentations. En plus des changements physiologiques, les RPTC des souris Tg présentent aussi une augmentation significative de la production des espèces réactive de l’oxygène (ROS) et de l’activité de la NADPH oxydase, ainsi qu’une augmentation de l’expression du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1), de l’inhibiteur activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1), des protéines de la matrice extracellulaire, du collagène de type IV et de la sousunité p47 de la NADPH oxydase. Le traitement des souris Tg avec l’apocynine et le perindopril a permis d’améliorer tous ces changements, sauf l’hypertension qui n’était pas corrigée par l’apocynine. D’autre part, l’hydralazine a prévenu l’hypertension, sans modifier l’albuminurie, l’apoptose des RPTC ou l’expression des gènes pro-apoptotiques. Ces résultats montrent bien que l’activation du RAS intrarénal et l’hyperglycémie agissent de concert pour induire l’albuminurie et l’apoptose des RPTC, indépendamment de l’hypertension systémique. La génération des ROS via l’activation de la NADPH oxydase induit en partie l’action du RAS intrarénal sur l’apoptose des RPTC, la fibrose tubulo-interstitielle et l’albuminurie chez les souris Tg. D’autre part, une expérience en cours a tenté d’encore mieux délimiter les effets de l’activation du RAS intrarénal, tout en éliminant la néphrotoxicité du STZ. Pour cette étude, les souris Tg surexprimant l’Agt de rat dans leurs RPTC ont été croisées aux souris Ins2Akita, un modèle spontané de diabète de type I, afin de générer des souris Akita-rAgt-Tg. Les résultats préliminaires indiquent que le RAS intrarénal est activé dans les souris Akita et que la combinaison avec l’hyperglycémie induit du stress du réticulum endoplasmique (ER) dans les RPTC in vivo. Le stress du ER contribue à l’apoptose des RPTC observée dans le diabète, à tout le moins dans le modèle Akita. Le traitement avec des inhibiteurs du RAS permet d’atténuer certains des dommanges rénaux observés dans les souris Akita-rAgt-Tg.

La fibrose en deux parties : de la paillasse à la souris

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

The role of DcR3 in systemic lupus erythematosus and islet β-Cell viability and function

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots.