Identification des canaux TRPC impliqués dans la potentialisation à long terme des interneurones de la région CA1 de l'hippocampe chez le rat

Le réseau neuronal de l’hippocampe joue un rôle central dans la mémoire en modifiant de façon durable l’efficacité de ses synapses. Dans les interneurones de la couche oriens/alveus (O/A), l’induction de la potentialisation à long terme (PLT) requiert les courants postsynaptiques excitateurs évoqués par les récepteurs métabotropes du glutamate de sous-type 1a (CPSEmGluR1a) et l’entrée subséquente de Ca2+ via des canaux de la famille des transient receptor potential (TRP). Le but de ce projet était d’identifier les canaux TRP responsables des CPSEmGluR1a et d’explorer les mécanismes moléculaires régulant leur ouverture. Nous avons déterminé par des enregistrements électrophysiologiques que les CPSEmGluR1a étaient spécifiques aux interneurones O/A et qu’ils étaient indépendants de la phospholipase C. Nous avons ensuite examiné l’expression des TRPC et leur interaction avec mGluR1a par les techniques de RT-PCR, d’immunofluorescence et de co-immunoprécipitation. Nos résultats montrent que TRPC1 et mGluR1a s’associent dans l’hippocampe et que ces deux protéines sont présentes dans les dendrites des interneurones O/A. En revanche, TRPC4 ne semble s’associer à mGluR1a qu’en système recombinant et leur colocalisation paraît limitée au corps cellulaire. Finalement, nous avons procédé à des enregistrements d’interneurones dans lesquels l’expression des TRPC a été sélectivement supprimée par la transfection d’ARN interférant et avons ainsi démontré que TRPC1, mais non TRPC4, est une sous-unité obligatoire du canal responsable des CPSEmGluR1a. Ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de la transmission synaptique des interneurones O/A et de mettre en évidence un rôle potentiel de TRPC1 dans la PLT.

Mécanismes de plasticité synaptique dans l’amygdale lors de la réactivation de la mémoire de peur auditive chez le rat : interaction dynamique des récepteurs NMDA et AMPA

La plasticité synaptique est une propriété indispensable à l’acquisition de la mémoire chez toutes les espèces étudiées, des invertébrés aux primates. La formation d’une mémoire débute par une phase de plasticité qui inclut une restructuration synaptique ; ensuite elle se poursuit par la consolidation de ces modifications, contribuant à la mémoire à long terme. Certaines mémoires redeviennent malléables lorsqu’elles sont rappelées. La trace mnésique entre alors dans une nouvelle de phase de plasticité, au cours de laquelle certaines composantes de la mémoire peuvent être mises à jour, puis reconsolidées. L’objectif de la présente thèse est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont activés lors du rappel d’une mémoire. Nous avons utilisé un modèle de conditionnement Pavlovien, combiné à l’administration d’agents pharmacologiques et à l’analyse quantitative de marqueurs de plasticité synaptique, afin d’étudier la dynamique de la mémoire de peur auditive chez des rats Sprague Dawley. La circuiterie neuronale et les mécanismes associatifs impliqués dans la neurobiologie de cette mémoire sont bien caractérisés, en particulier le rôle des récepteurs glutamatergiques de type NMDA et AMPA dans la plasticité synaptique et la consolidation. Nos résultats démontrent que le retour de la trace mnésique à un état de labilité nécessite l’activation des récepteurs NMDA dans l’amygdale baso-latérale à l’instant même du rappel, alors que les récepteurs AMPA sont requis pour l’expression comportementale de la réponse de peur conditionnée. D’autre part, les résultats identifient le rappel comme une phase bien plus dynamique que présumée, et suggèrent que l’expression de la peur conditionnée mette en jeu la régulation du trafic des récepteurs AMPA par les récepteurs NMDA. Le présent travail espère contribuer à la compréhension de la neurobiologie fondamentale de la mémoire. De plus, il propose une intégration des résultats aux modèles animaux d’étude des troubles psychologiques conséquents aux mémoires traumatiques chez l’humain, tels que les phobies et les syndromes de stress post-traumatiques.

Caractérisation de la pharmacocinétique suite à l’exposition multivoie au toluène, au n-hexane et au cyclohexane chez le rat

La contribution de l’inhalation et de la voie percutanée à l’exposition totale à des composés organiques volatils (COV) présents dans l’eau potable est une problématique qui suscite un intérêt grandissant en santé publique et au niveau réglementaire. Jusqu’à tout récemment, seule l’ingestion était considérée dans l’évaluation du risque des contaminants de l’eau. L’objectif de ce projet était de caractériser l’impact de l’exposition multivoie sur la pharmacocinétique et la dose interne de trois COV : le toluène (TOL), le n-hexane (HEX) et le cyclohexane (CYCLO). À cette fin, un modèle expérimental animal a été utilisé et un modèle toxicocinétique à base physiologique (TCBP) a été adapté pour le TOL. Des rats Sprague-Dawley ont été exposés par voies uniques (inhalation, orale et percutanée) ou simultanées (multivoie) aux solvants. Pour le TOL, les trois voies ont été expérimentées, alors que la voie percutanée n’a pas été retenue pour le HEX et le CYCLO. Des prélèvements sanguins ont permis de caractériser les cinétiques sanguines. Les niveaux sanguins, obtenus lors des expositions multivoies, étaient généralement plus élevés que la somme des niveaux associés aux expositions par voies uniques, fait illustré par le rapport des surfaces sous la courbe expérimentale versus les prédictions (TOL : 1,30 et 2,19 ; HEX : 1,55 ; CYCLO : 0,98 et 0,99). Le modèle TCBP prédit bien la cinétique du TOL lors d’expositions par voies uniques et par multivoies. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la dose interne résultant d’une exposition multivoie ne peut pas toujours être prédite par la somme des doses internes obtenues lors d’expositions par voies uniques. Ce phénomène serait explicable par la saturation du métabolisme. La modélisation TCBP est un outil efficace pour l’estimation du risque relatif à l’exposition multivoie aux COV présents dans l’eau potable.

Caractérisation de la toxicocinétique de l’octylphénol chez le rat en vue d’une meilleure analyse de risque toxicologique des perturbateurs endocriniens

Le p-tert-octylphénol est un produit présent dans l’environnement et issu de la dégradation des alkylphénols éthoxylés. Ce composé a la capacité de se lier au récepteur œstrogénique et d’exercer ainsi un léger effet œstrogénique. Les objectifs de cette étude étaient de 1) développer une méthode d'identification de l'octylphénol dans le sang et les tissus à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse jumelée à la spectrométrie de masse, 2) caractériser la toxicocinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol chez le rat Sprague-Dawley mâle et femelle et 3) développer un modèle toxicocinétique à base physiologique permettant de décrire la cinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol inchangé. Pour ce faire, des rats mâle et femelle Sprague-Dawley ont reçu des doses uniques d’octylphénol par les voies intraveineuse, orale et sous-cutanée. Deux autres groupes ont reçu des doses répétées d'octylphénol par voie orale pour une durée de 35 jours consécutifs pour les femelles ou 60 jours pour les mâles. Les concentrations sanguines et tissulaires d’octylphénol ont été mesurées à différents moments après administration à partir d’une méthode d’analyse développée dans nos laboratoires dans le cadre de ce projet. Les expériences impliquant des administrations uniques ont montré que les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol étaient en général plus élevées chez les femelles que chez les mâles. Des expériences réalisées avec des microsomes hépatiques ont confirmé que ces différences étaient vraisemblablement reliées au métabolisme de l'octylphénol. Les expériences impliquant des administrations répétées ont montré qu'il n'y avait pas d'accumulation d'octylphénol dans l'organisme aux doses étudiées. Les résultats obtenus expérimentalement ont servi à développer et valider un modèle toxicocinétique à base physiologique. Ce modèle a permis de simuler adéquatement les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol suite à des expositions intraveineuses, orales et sous-cutanées. En conclusion, cette étude a fourni des données essentielles sur la toxicocinétique de l'octylphénol. Ces données sont nécessaires pour établir la relation entre la dose externe et la dose interne et vont contribuer à une meilleure évaluation des risques liés à l'octylphénol.

Mécanismes traductionnels impliqués dans la potentialisation à long-terme de la transmission synaptique des cellules pyramidales de l’hippocampe chez le rongeur.

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes dont on ne comprend pas encore bien l’origine au niveau cellulaire et moléculaire. Cependant, il est largement admis que des changements plus simples au niveau synaptique, tels que la potentialisation à long-terme (long-term potentiation ou LTP) pourraient constituer la base cellulaire de la formation des nouveaux souvenirs. Ces mécanismes sont couramment étudiés au niveau de l’hippocampe, une région du lobe temporal reconnue comme étant nécessaire à la formation de la mémoire explicite chez les mammifères. La LTP est classiquement définie comme un renforcement durable de l’efficacité de connexions synaptiques ayant été stimulées de façon répétée et soutenue. De plus, on peut distinguer deux formes de LTP: une LTP précoce, qui repose sur la modification de protéines déjà formées, et une LTP tardive, qui requiert, elle, la synthèse de nouvelles protéines. Cependant, bien que de nombreuses études se soient intéressées au rôle de la traduction pour la maintenance de la LTP, les mécanismes couplant l’activité synaptique à la machinerie de synthèse protéique, de même que l’identité des protéines requises sont encore peu connus. Dans cette optique, cette thèse de doctorat s’est intéressée aux interactions entre l’activité synaptique et la régulation de la traduction. Il est par ailleurs reconnu que la régulation de la traduction des ARNm eukaryotiques se fait principalement au niveau de l’initiation. Nous avons donc étudié la modulation de deux voies majeures pour la régulation de la traduction au cours de la LTP : la voie GCN2/eIF2α et la voie mTOR. Ainsi, nos travaux ont tout d’abord démontré que la régulation de la voie GCN2/eIF2α et de la formation du complexe ternaire sont nécessaires à la maintenance de la plasticité synaptique et de la mémoire à long-terme. En effet, l’activité synaptique régule la phosphorylation de GCN2 et d’eIF2α, ce qui permet de moduler les niveaux du facteur de transcription ATF4. Celui-ci régule à son tour la transcription CREB-dépendante et permet ainsi de contrôler les niveaux d’expression génique et la synthèse de protéines nécessaires pour la stabilisation à long-terme des modifications synaptiques. De plus, la régulation de la voie mTOR et de la traduction spécifique des ARNm 5’TOP semble également jouer un rôle important pour la plasticité synaptique à long-terme. La modulation de cette cascade par l’activité synaptique augmente en effet spécifiquement la capacité de traduction des synapses activées, ce qui leur permet de traduire et d’incorporer les protéines nécessaires au renforcement durable des synapses. De telles recherches permettront sans doute de mieux comprendre la régulation des mécanismes traductionnels par l’activité synaptique, ainsi que leur importance pour la maintenance de la potentialisation à long-terme et de la mémoire à long-terme.

Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 en combinaison réduisent l’apoptose dans le système limbique après ischémie myocardique transitoire chez le rat

Nous avons démontré la présence d'apoptose dans le système limbique suivant un infarctus du myocarde. Cette mort cellulaire serait partiellement reliée à l'augmentation de cytokines pro-inflammatoires. Des études démontrent que certains probiotiques ont des effets bénéfiques en diminuant le ratio de cytokines pro/anti-inflammatoires. La prise de probiotiques en prévention, avant l’occlusion d’une artère coronarienne, pourrait-elle diminuer l’apoptose dans le système limbique? Méthodes : La combinaison de probiotiques Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 ou son véhicule fut additionné dans l’eau des rats pendant 28 jours consécutifs. Un infarctus du myocarde fut provoqué par l’occlusion de l’artère coronaire gauche. Après 40 minutes d'occlusion, les régions ischémiques ont été reperfusées pour 72 heures. Les animaux furent sacrifiés et la taille de l'infarctus mesurée. L'amygdale et l'hippocampe furent prélevés pour déterminer l'activité de la caspase-3 (pro-apoptotique), le ratio Bax/Bcl2(proapoptotique/ anti-apoptotique) et l'activité d'Akt (survie cellulaire). Résultats : La taille de l’infarctus n'est pas diminuée dans le groupe probiotique (45% de la région à risque)comparé au groupe placebo. Nos marqueurs d’apoptose démontrent une diminution dans les régions du gyrus denté, de l’amygdale latérale et médiane dans le groupe probiotique par rapport au placebo. L’activité de la caspase-3 et le ratio Bax:Bcl2 furent réduits dans le groupe probiotique de 50% et 40% respectivement (p < 0.05) et phosphorylation d’Akt fut augmentée de 35% (p<0.05). Aucune différence fut observée pour les régions Ca1 et Ca3. Conclusion : La combinaison de probiotiques utilisée réduit l’apoptose dans différentes régions du système limbique 72 heures après un IM.

Détermination des effets de l'administration des probiotiques sur l'attachement d'Escherichia Coli Entérotoxinogène F4 et l'expression de cytokines chez le porcelet sevré

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc.

Modèles de dysfonction érectile chez le rat

Des modèles de dysfonction érectile (DE) ont été développés et étudiés chez le rat. Cependant, peu de choses sont connues dans certains modèles présentant des facteurs de risque de la DE, en l’occurrence le rat soumis à une diète riche en glucose, le rat avec une restriction de croissance intra-utérine (RCIU) et le rat avec l’infusion continue de l’angiotensine (Ang) II en ce qui concerne l’évaluation de la fonction érectile in vivo. C’est ainsi que nous nous sommes proposés cette étude. La fonction érectile a été mesurée par la stimulation électrique du nerf caverneux à des cohortes de rats mâles Sprague-Dawley de différents âges comme suit: 1) des rats jeunes de 12 semaines d’âge, adultes reproducteurs à la retraite d’environ 30 semaines d’âge et des rats de 27 et 29 semaines soumis à une diète riche en glucose par l’eau de breuvage (10%) à court (1 semaine), moyen (6 semaines) et long (12 ou 13 semaines) termes; 2) des rats jeunes âgés de 12 semaines recevant une infusion soit de l’Ang II (200ng/kg/min) soit de la saline par mini-pompes osmotiques sous-cutanées pendant 1 et 2 semaines; et 3) des rats adultes âgés de 36 semaines avec une RCIU. La fonction érectile a été représentée par des courbes de variations de pression intracaverneuse (PIC) et d’aire sous la courbe (ASC) normalisées avec la pression artérielle moyenne (PAM) en réponse à la stimulation nerveuse à différents volts. À la fin des expériences, les animaux ont été sacrifiés, le sang recueilli pour le dosage de la glycémie et de l’insulinémie; le pénis, l’aorte thoracique et le cœur prélevés à des fins d’analyses protéique et histologique. La diète riche en glucose à court terme a eu un effet néfaste sur la fonction érectile chez le jeune rat mais bénéfique chez le rat adulte reproducteur; de même que pour les études à long terme, la diète riche en glucose a amélioré ou renversé la DE associée au vieillissement. Les rats avec RCIU ont exhibé une baisse très significative de la fonction érectile. Ces détériorations ou améliorations de la fonction érectile avec le glucose ou dans la RCIU ont été principalement associées à des modifications de l’expression de l’Akt, en plus d’une augmentation de l’insuline sérique dans les groupes avec le glucose. L’Ang II a entraîné une baisse de la fonction érectile, statistiquement très significative après 1 semaine et maintenue après 2 semaines de traitement, sans causer des changements morphologiques au cœur et à l’aorte thoracique. En conclusion : l’atteinte du système érectile se fait précocement dans les complications cardiovasculaires liées à l’activation du SRA, l’implication de l’Akt dans la modulation de la fonction érectile dépend de type de vieillissement et de la diète, le RCIU est un facteur de risque pour la DE.

Réduction des dommages myocardiques par le célécoxib suite à une ischémie transitoire chez le rat

Cette étude a été conçue afin d’évaluer l’effet d’un pré-traitement à long terme au célécoxib sur la taille d’infarctus suite à un infarctus du myocarde. Sachant que le célécoxib est un anti-inflammatoire et que des dommages myocardiques peuvent découler des processus inflammatoires, l’inhibition de l’inflammation devrait hypothétiquement réduire la taille d’un éventuel infarctus. Pour ce faire, un traitement au célécoxib (3 mg/kg/jour i.p.) ou au véhicule (DMSO 50% ; EtOH 15% ; eau distillée) a été administré chroniquement pendant 28 jours à des rats mâles Sprague-Dawley (n=18 par groupe) par pompes osmotiques ALZET. Après avoir été anesthésiés, les animaux ont été sujets à l’occlusion de l’artère coronaire gauche descendante, suivie d’une période de reperfusion de 24 heures. Les résultats démontrent que la taille de l’infarctus des animaux traités au célécoxib est significativement réduite comparativement à celle du groupe témoin (37,5±2,5% versus 48,0±2,6% de la zone à risque, p < 0,05). Par la suite, l’accumulation de neutrophiles indique une hausse de ces leucocytes pour la zone ischémique, sans toutefois discriminer entre les groupes traité et non-traité, qui contenaient aussi les couches sub-endocardique et sous-épicardique. Cependant, aucune différence significative est notée entre les groupes traité et témoin au niveau de l’expression de la prostaglandine E2 plasmatique et du facteur de nécrose tumorale alpha. D’un autre côté, l’apoptose, déterminée par le ratio de Bax/Bcl2 et par un essai TUNEL est significativement réduite pour la couche sub-endocardique de la zone à risque des animaux traités au célécoxib. Enfin, l’agrégation plaquettaire, induite à l’adénosine diphosphate et analysée dans le sang complet, suggère que le célécoxib diminue l’agrégation plaquettaire. Cette étude indique alors qu’un pré-traitement au célécoxib peut réduire la taille d’infarctus par un mécanisme impliquant l’apoptose.

Thérapie par les cellules souches mésenchymateuses dans la guérison tendineuse chez le cheval

Les tendinites sont des lésions communes chez le cheval athlète, ayant un impact financier et sportif considérable. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) de moelle osseuse (MO) sont empiriquement utilisées en clinique pour améliorer la guérison des affections myoarthrosquelettiques. Cependant, il est nécessaire de standardiser les protocoles d’isolement des CSMs équines et d’analyser leurs effets sur la guérison tendineuse pour ajuster leur dose. Les objectifs de cette étude étaient de comparer 3 méthodes d’isolement des CSMs équines et d’établir un modèle de guérison tendineuse minimal invasif pour analyser l’effet des CSMs sur cette guérison. Des CSMs de MO du sternum de juments étaient isolées par 3 protocoles couramment utilisés (adhérence au pétri (Classique) et 2 méthodes par gradient de densité (Percoll et Ficoll)). La viabilité des cellules après isolement, le rendement d’isolement, le nombre de CSMs obtenues après 14 jours de culture et leurs caractéristiques fonctionnelles (renouvellement et différentiation) étaient comparés entre les 3 protocoles. Les résultats suggéraient que le Percoll était le meilleur protocole en termes de rendement et de capacité de renouvellement des cellules. La différence n’était pas significative pour leur viabilité et leur capacité de différentiation. Un modèle de guérison tendineuse, consistant en une ténectomie du tendon extenseur latéral du doigt fut ensuite développé. Cependant, la grande variabilité interindividuelle de qualité de guérison dans le groupe pilote implique une ré-évaluation du modèle. Des études futures, avec des CSMs isolées par le Percoll dans de nouveaux modèles de guérison tendineuse devraient permettre de déterminer la dose adéquate de CSMs.

Caractérisation du risque associé au virus de l'hépatite E chez le porc

Dans cette étude, la bile d’un porc canadien naturellement infecté par une souche du virus de l’hépatite E (VHE) a été utilisée afin d’inoculer deux groupes de porcelets. Dans l’étude précoce (E), 4 porcelets âgés de 4 semaines et exempts de pathogènes spécifiques (SPF), ont été suivis jusqu’à 14 jours post-inoculation (pi). Dans l’étude tardive (L), 9 porcelets ont été suivis à chaque semaine jusqu’à l’abattage, soit 120 jours pi. À la nécropsie, la présence du VHE a été évaluée dans différents organes à 7, 14 et 120 jours pi. Des porcelets témoins (E=2 et L=3) ont été inoculés par de la bile exempte de VHE. Le virus a persisté chez certains animaux jusqu’à 84 à 105 jours pi dans le sérum malgré la présence d’anticorps IgG anti-VHE dans le sang, suggérant une virémie prolongée. L’excrétion virale dans les fèces s’est étalée également sur une période de 105 jours pi chez certains animaux. De plus, la détection de l’ARN viral dans les organes évalués s’est révélée presque nulle à l’âge d’abattage à l’exception de quelques vésicules biliaires, alors qu’on retrouvait l’ARN viral dans plusieurs organes à 7 et 14 jours pi. Pour évaluer la distribution du VHE chez les porcs commerciaux du Québec, un échantillonnage de porcs de trois abattoirs a été réalisé. Environ 100 échantillons de sang, fèces, foies et bile provenant des mêmes animaux en processus d’abattage ont été prélevés dans chacun des abattoirs, sur des porcs destinés à la consommation humaine. La détection de l’ARN viral et des anticorps du VHE a été réalisée à l’aide d’une RT-PCR nichée et d’un test ELISA adapté pour déceler les anticorps porcins anti-VHE. Chez les porcs d’abattoir, 12,9 % des échantillons de bile contenaient de l’ARN viral du VHE, alors que la détection virale était moindre dans les autres organes. Une séroprévalence en IgG de 26,0 % a été obtenue pour les sérums porcins analysés. Une analyse phylogénétique des différentes souches isolées pendant l’étude a démontré qu’elles sont du génotype 3. Ces données indiquent une exposition potentielle des travailleurs de l’industrie porcine au VHE porcin, notamment par les fèces, le sang et les organes et également pour les consommateurs par le biais des foies.