Mécanismes d'action des anti-oestrogènes totaux

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Fonctions de l'oncoprotéine LMO2 déterminées par ses interactions protéiques

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants.

Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

Mécanismes d'action des antioestrogènes totaux

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant.

A study of the polycomb group complexes in the maintenance of heterochromatic genome stability and Alzheimer's disease.

La démence d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive et irreversible des fonctions cognitives et des compétences intellectuelles. La maladie d’Alzheimer se présente sous deux formes: la forme familiale ou précoce (EOAD) qui représente 5% des cas et elle est liée à des mutations génétiques affectant le métabolisme des peptides amyloïde; et la forme tardive ou sporadique (LOAD) qui représente 95% des cas mais son étiologie est encore mal définie. Cependant, le vieillissement reste le principal facteur de risque pour développer LOAD. Les changements épigénétiques impliquant des modifications des histones jouent un rôle crucial dans les maladies neurodégénératives et le vieillissement lié à l'âge. Des données récentes ont décrit LOAD comme un désordre de l'épigénome et ont associé ce trouble à l'instabilité génomique. Les protéines Polycomb sont des modificateurs épigénétiques qui induisent le remodelage de la chromatine et la répression des gènes à l'hétérochromatine facultative. Nous rapportons que les souris hétérozygotes pour une protéine Polycomb développent avec l'âge un trouble neurologique ressemblant à LOAD caractérisé par l’altération des fonctions cognitives, la phosphorylation de la protéine tau, l'accumulation des peptides amyloïde, et le dysfonctionnement synaptique. Ce phénotype pathologique est précédé par la décondensation de l’hétérochromatine neuronale et l'activation de la réponse aux dommages à l'ADN. Parallèlement, une réduction d’expression de polycomb, malformations de l'hétérochromatine neuronale, et l'accumulation de dommages à l'ADN étaient également présents dans les cerveaux de patients LOAD. Remarquablement, les dommages de l'ADN ne sont pas distribués de façon aléatoire sur le génome mais sont enrichis au niveau des séquences répétitives. Les conclusions présentées dans cette thèse ont identifié des modifications épigénétiques spécifiques qui conduisent à une instabilité génomique aberrante menant à la formation de LOAD. Ces résultats vont aider au développement de nouveaux traitements qui peuvent potentiellement ralentir la neurodégénérescence.

Regulation of gene expression in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste.

Fonction de CFTR dans les processus de réparation de l’épithélium des voies aériennes et développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en fibrose kystique

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations dans le gène codant pour le canal CFTR. La mutation la plus commune est la délétion du résidu Phe508 (∆F508), qui entraîne un mauvais repliement et la dégradation de la protéine mutée. Ainsi, l’absence du CFTR cause un dysfonctionnement du transport ionique et liquidien qui altère le phénomène de clairance mucociliaire. Il en résulte une accumulation de mucus visqueux obstruant les voies aériennes favorisant une colonisation bactérienne, spécialement par P. aeruginosa, et une inflammation chronique. Ces phénomènes entraînent des lésions épithéliales et un remodelage des voies aériennes. Selon nos analyses ultrastructurales de poumons issus de patients FK au moment de la transplantation, certaines zones de l’épithélium FK montrait des signes de d’initiation des processus de réparation. Malgré cela, un dommage épithélial progressif est observé chez les patients FK et il apparaît évident que les processus de réparation sont insuffisants pour permettre le rétablissement de l’intégrité épithéliale. Le principal objectif de mon étude était d’étudier le rôle du CFTR dans les mécanismes de réparation de l’épithélium FK et de déterminer l’impact de la correction du CFTR sur la réparation épithéliale et ce, en condition aseptique et en présence d’infection. Mes travaux montrent que l’épithélium des voies aériennes FK présente un défaut de réparation, associé, du moins en partie, à l’absence d’un CFTR fonctionnel. De plus, nous avons démontré pour la première fois que l’application du correcteur du CFTR VRT-325 permettait, non seulement, la maturation du CFTR, mais également une amélioration de la capacité des monocouches de cellules des voies aériennes FK à se réparer. D’autre part, nous avons montré que la présence du filtrat bactérien de P. aeruginosa (PsaDM) altérait non seulement l’expression et la fonction du CFTR, mais également les processus de réparation épithéliale. Enfin, nos résultats montrent que l’infection affecte la maturation du CFTR induite par le VRT-325 et diminue les effets bénéfiques du VRT-325 sur la réparation épithéliale. Mes travaux permettent de mieux comprendre le rôle du CFTR dans les processus de réparation de l’épithélium FK et de proposer une nouvelle approche thérapeutique visant à promouvoir la régénération épithéliale chez les patients FK afin de tenter de stabiliser leur état, malgré l’effet délétère de la composante infectieuse.

Investigation of the structure and dynamics of the centromeric epigenetic mark

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire.

Destins des S-RNases et interactions moléculaires dans le tube pollinique dans le cadre de l’auto-incompatibilité gamétophytique chez Solanum chacoense

L’auto-incompatibilité (AI) est une barrière reproductive prézygotique qui permet aux pistils d’une fleur de rejeter leur propre pollen. Les systèmes d’AI peuvent prévenir l’autofertilisation et ainsi limiter l’inbreeding. Dans l’AI gamétophytique, le génotype du pollen détermine son propre phénotype d’incompatibilité, et dans ce système, les déterminants mâles et femelles de l’AI sont codés par un locus multigénique et multi-allélique désigné le locus S. Chez les Solanaceae, le déterminant femelle de l’AI est une glycoprotéine stylaire extracellulaire fortement polymorphique possédant une activité ribonucléase et désignée S-RNase. Les S-RNases montrent un patron caractéristique de deux régions hypervariables (HVa et HVb), responsables de leur détermination allélique, et cinq régions hautement conservées (C1 à C5) impliquées dans l’activité catalytique ou la stabilisation structurelle de ces protéines. Dans ce travail, nous avons investigué plusieurs caractéristiques des S-RNases et identifié un nouveau ligand potentiel aux S-RNases chez Solanum chacoense. L’objectif de notre première étude était l’élucidation du rôle de la région C4 des S-RNases. Afin de tester l’hypothèse selon laquelle la région C4 serait impliquée dans le repliement ou la stabilité des S-RNases, nous avons généré un mutant dans lequel les quatre résidus chargés présents en région C4 furent remplacés par des résidus glycine. Cette protéine mutante ne s’accumulant pas à des niveaux détectables, la région C4 semble bien avoir un rôle structurel. Afin de vérifier si C4 est impliquée dans une liaison avec une autre protéine, nous avons généré le mutant R115G, dans lequel un acide aminé chargé fût éliminé afin de réduire les affinités de liaison dans cette région. Ce mutant n’affectant pas le phénotype de rejet pollinique, il est peu probable que la région C4 soit impliquée dans la liaison des S-RNases avec un ligand ou leur pénétration à l’intérieur des tubes polliniques. Enfin, le mutant K113R, dans lequel le seul résidu lysine conservé parmi toutes les S-RNases fût remplacé par un résidu arginine, fût généré afin de vérifier si cette lysine était un site potentiel d’ubiquitination des S-RNases. Toutefois, la dégradation des S-RNases ne fût pas inhibée. Ces résultats indiquent que C4 joue probablement un rôle structurel de stabilisation des S-RNases. Dans une seconde étude, nous avons analysé le rôle de la glycosylation des S-RNases, dont un site, en région C2, est conservé parmi toutes les S-RNases. Afin d’évaluer la possibilité que les sucres conjugués constituent une cible potentielle d’ubiquitination, nous avons généré une S11-RNase dont l‘unique site de glycosylation en C2 fût éliminé. Ce mutant se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage, démontrant que l’absence de glycosylation ne confère pas un phénotype de rejet constitutif du pollen. Afin de déterminer si l’introduction d’un sucre dans la région HVa de la S11-RNase pourrait affecter le rejet pollinique, nous avons généré un second mutant comportant un site additionnel de glycosylation dans la région HVa et une troisième construction qui comporte elle aussi ce nouveau site mais dont le site en région C2 fût éliminé. Le mutant comportant deux sites de glycosylation se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage mais, de manière surprenante, le mutant uniquement glycosylé en région HVa peut aussi rejeter le pollen d’haplotype S13. Nous proposons que la forme non glycosylée de ce mutant constitue un allèle à double spécificité, semblable à un autre allèle à double spécificité préalablement décrit. Il est intéressant de noter que puisque ce phénotype n’est pas observé dans le mutant comportant deux sites de glycosylation, cela suggère que les S-RNases ne sont pas déglycosylées à l’intérieur du pollen. Dans la dernière étude, nous avons réalisé plusieurs expériences d’interactions protéine-protéine afin d’identifier de potentiels interactants polliniques avec les S-RNases. Nous avons démontré que eEF1A, un composant de la machinerie de traduction chez les eucaryotes, peut lier une S11-RNase immobilisée sur résine concanavaline A. Des analyses de type pull-down utilisant la protéine eEF1A de S. chacoense étiquetée avec GST confirment cette interaction. Nous avons aussi montré que la liaison, préalablement constatée, entre eEF1A et l’actine est stimulée en présence de la S11-RNase, bien que cette dernière ne puisse directement lier l’actine. Enfin, nous avons constaté que dans les tubes polliniques incompatibles, l’actine adopte une structure agrégée qui co-localise avec les S-RNases. Ces résultats suggèrent que la liaison entre eEF1A et les S-RNases pourrait constituer un potentiel lien fonctionnel entre les S-RNases et l’altération du cytosquelette d’actine observée lors des réactions d’AI. Par ailleurs, si cette liaison est en mesure de titrer les S-RNases disponibles à l’intérieur du tube pollinique, ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi des quantités minimales ou « seuils » de S-RNases sont nécessaires au déclenchement des réactions d’AI.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Dynamic epigenetic changes in immune responses to infection in human dendritic cells

La méthylation de l'ADN est une marque épigénétique importante chez les mammifères. Malgré le fait que la méthylation de la cytosine en 5' (5mC) soit reconnue comme une modification épigénétique stable, il devient de plus en plus reconnu qu'elle soit un processus plus dynamique impliquant des voies de méthylation et de déméthylation actives. La dynamique de la méthylation de l'ADN est désormais bien caractérisée dans le développement et dans le fonctionnement cellulaire des mammifères. Très peu est cependant connu concernant les implications régulatrices dans les réponses immunitaires. Pour se faire, nous avons effectué des analyses du niveau de transcription des gènes ainsi que du profilage épigénétique de cellules dendritiques (DCs) humaines. Ceux-ci ont été faits avant et après infection par le pathogène Mycobacterium tuberculosis (MTB). Nos résultats fournissent le premier portrait génomique du remodelage épigénétique survenant dans les DCs en réponse à une infection bactérienne. Nous avons constaté que les changements dans la méthylation de l'ADN sont omniprésents, identifiant 3,926 régions différentiellement méthylées lors des infections par MTB (MTB-RDMs). Les MTB-RDMs montrent un chevauchement frappant avec les régions génomiques marquées par les histones associées avec des régions amplificatrices. De plus, nos analyses ont révélées que les MTB-RDMs sont activement liées par des facteurs de transcription associés à l'immunité avant même d'être infecté par MTB, suggérant ces domaines comme étant des éléments d'activation dans un état de dormance. Nos données suggèrent que les changements actifs dans la méthylation jouent un rôle essentiel pour contrôler la réponse cellulaire des DCs à l'infection bactérienne.

Un criblage ciblant de nouveaux facteurs impliqués dans l’assemblage mitotique des chromosomes dans le nématode C. elegans

La division cellulaire est un processus fondamental des êtres vivants. À chaque division cellulaire, le matériel génétique d'une cellule mère est dupliqué et ségrégé pour produire deux cellules filles identiques; un processus nommé la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matériel génétique pour être en mesure de séparer mécaniquement et également le matériel génétique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission inégale du matériel génétique. Il est suggéré dans la littérature que ces phénomènes pourraient causé la transformation des cellules cancéreuses. Par contre, le mécanisme moléculaire générant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernières décennies, plusieurs approches expérimentales ont identifié quelques protéines conservées dans ce processus. Pour déterminer le rôle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectué un criblage par ARNi couplé à de l'imagerie à haute-résolution en temps réel chez l'embryon de C. elegans. Grâce à cette technique, j'ai découvert sept nouvelles protéines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonucléotide réductase (RNR) et Topoisomérase II (topo-II). Dans cette thèse, je décrirai le rôle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mécanismes moléculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indépendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite à la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est à l'opposé de la position des autres facteurs connus qui sont impliqués dans la condensation des chromosomes. Ceci représente un nouveau mécanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai découvert un rôle non-enzymatique à la protéine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqué dans la stabilité des nucléosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thèse, je rapporte également des résultats préliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs découverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse révèle que la déplétion des nouvelles protéines montre des phénotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en métaphase sont assemblés par trois protéines ayant des activités différentes d'échafaudage: topoisomérase II, les complexes condensines et les protéines centromériques. En conclusion, ces études prouvent le mécanisme moléculaire de certaines protéines qui contribuent à la formation des chromosomes mitotiques.

Expression des histones déméthylases dans les cellules hématopoïétiques humaines et les leucémies aiguës

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique.

Histone H2B-R95A mutant identifies the pheromone pathway that signals cell cycle arrest during rapamycin response

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.