Étude de l'Endothelin-converting enzyme-like 1 (ECEL1), un nouveau membre de la famille de l'endopeptidase neutre-24.11 (EPN)

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Des chaperons pharmacologiques agissant sur les récepteurs V2 de la vasopressine offrent un traitement potentiel pour le diabète insipide néphrogénique

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude protéomique et bioinformatique du phagosome de la drosophile

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Involvement of Beta-arrestin 1 and Beta-arrestin 2 in store operated calcium entry

Résumé : La variation de la [Ca2+] intracellulaire participe à nombreux de processus biologiques. Les cellules eucaryotes expriment à la membrane plasmique une variété de canaux par lesquelles le calcium peut entrer. Dans les cellules non excitables, deux mécanismes principaux permettent l'entrée calcique; l'entrée capacitative de Ca2+ via Orai1 (SOCE) et l'entrée calcique activé par un récepteur (ROCE). Plusieurs protéines clés sont impliquées dans la régulation de ces voies d'entrée calcique, ainsi que dans l'homéostasie calcique. TRPC6 est un canal calcique impliquée dans l'entrée calcique dans les cellules à la suite d’une stimulation d’un récepteur hormonal. TRPC6 transloque à la membrane cellulaire et il y demeure jusqu'à ce que le stimulus soit retiré. Les mécanismes qui régulent le trafic et l'activation de TRPC6 sont cependant encore peu connus. Des découvertes récentes ont démontré qu'il y a un rôle potentiel de Rho kinase dans l'activité de TRPC6. Rho kinase est activée par la petite protéine G RhoA qui peut être activée par les protéines G hétérotrimériques Gα12 et Gα13. En plus de Gα12 et Gα13, les protéines de désensibilisation des GPCR β -arrestin 1 et / ou β-arrestin 2 peuvent aussi activer RhoA. Le but de notre étude est d'examiner la participation des protéines Gα12/13 et β-arrestin 1/ β-arrestin 2 dans l'activation de TRPC6 et de la protéine Orai1. Nous avons utilisé des ARN interférant (siRNA) spécifiques pour induire une réduction de l'expression de Gα12/13 ou β-arrestin 1/β-arrestin 2. La conséquence sur l’entrée de Ca2+ dans les cellules a été ensuite déterminée par imagerie calcique en temps réel suite à une stimulation par la vasopressine (AVP), thapsigargin ou carbachol. Nous avons donc identifié que dans des cellules A7r5, une lignée cellulaire de musculaires lisses vasculaires où le canal TRPC6 exprimé de manière endogène, la diminution de l’expression des protéines Gα12 ou Gα13 ne semble pas modifier l’entrée Ca2+ induit par l’AVP par rapport aux cellules témoins. D'autre part, la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 dans des cellules HEK 293 ainsi que des cellules HEK 293 exprimant de façon stable TRPC6 (cellules T6.11) ont augmenté l’entrée de Ca2+ induite par thapsigargin, un activateur pharmacologique de SOCE. Des études de co-immunoprécipitation démontrent une interaction entre la β-arrestin 1 et STIM1, alors qu'aucune interaction n'a été observée entre les β-arrestin 1 et Orai1. Nous avons de plus montré à l'aide d'analyse en microscopie confocale que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 n’influence pas la quantité d’Orai1 à la périphérie cellulaire. Cependant, des résultats préliminaires indiquent que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 augmente la quantité de STIM1-YFP dans l'espace intracellulaire et diminue sa quantité à la périphérie cellulaire. En conclusion, nous avons montré que les β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 sont impliquées dans l'entrée capacitative de Ca2+ (SOCE) et contrôlent la quantité de STIM1 dans le réticulum endoplasmique.

Élucidation et identification des différents interacteurs impliqués dans le mécanisme de régulation du LDLR par la protéine PCSK9

Résumé : Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de mortalité mondiale, soit le tiers des décès annuels selon l’Organisation mondiale de la Santé. L’hypercholestérolémie, caractérisée par une élévation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines de faible densité (LDL), est l’un des facteurs de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires. La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) joue un rôle essentiel dans l’homéostasie du cholestérol sanguin par la régulation des niveaux protéiques du récepteur LDL (LDLR). PCSK9 est capable de se lier au LDLR et favorise l’internalisation et la dégradation du récepteur dans les lysosomes. L’inhibition de PCSK9 s’avère une cible thérapeutique validée pour le traitement de l’hypercholestérolémie et la prévention des maladies cardiovasculaires. Par contre, plusieurs mécanismes responsables de la régulation et la dégradation du complexe PCSK9-LDLR n’ont pas encore été complètement caractérisés comme la régulation par la protéine annexin A2 (AnxA2), un inhibiteur endogène de PCSK9. De plus, plusieurs évidences suggèrent la présence d’une ou plusieurs protéines, encore inconnues, impliquées dans le mécanisme d’action de PCSK9. Celles-ci pourraient réguler l’internalisation et le transport du complexe PCSK9-LDLR vers les lysosomes. Les objectifs de cette thèse sont de mieux définir le rôle et l’impact de l’AnxA2 sur la protéine PCSK9 en plus d’identifier de nouveaux partenaires d’interactions de PCSK9 pour mieux caractériser son mécanisme d’action sur la régulation des niveaux de LDLR. Nous avons démontré que l’inhibition de PCSK9 par l’AnxA2 extracellulaire s’effectue via sa liaison aux domaines M1+M2 de la région C-terminale de PCSK9 et nous avons mis en évidence les premières preuves d’un contrôle intracellulaire de l’AnxA2 sur la traduction de l’ARNm de PCSK9. Nos résultats révèlent une liaison de l’AnxA2 à l’ARN messager de PCSK9 qui cause une répression traductionnelle. Nous avons également identifié la protéine glypican-3 (GPC3) comme un nouveau partenaire d’interaction extracellulaire avec le PCSK9 et intracellulaire avec le complexe PCSK9-LDLR dans le réticulum endoplasmique des cellules HepG2 et Huh7. Nos études démontrent que GPC3 réduit l’activité extracellulaire de PCSK9 en agissant comme un compétiteur du LDLR pour la liaison avec PCSK9. Une meilleure compréhension des mécanismes de régulation et de dégradation du complexe PCKS9-LDLR permettra de mieux évaluer l’impact et l’efficacité des inhibiteurs de la protéine PCSK9.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Etude des propriétés dynamiques de la sécrétion régulée des vésicules glutamatergiques des astrocytes

RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est composé de différents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont très longtemps restés dans l'ombre alors que les neurones, bénéficiant des outils ad hoc pour être stimulés et étudiés, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le développement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non électriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'être passives et participent activement au fonctionnement cérébral. Cette participation au fonctionnement cérébral se fait en partie par le biais de la libération de substances neuro-actives (appellées gliotransmetteurs) que les astrocytes libèrent à proximité des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libération de gliotransmetteurs est principalement causée par l'activité neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Néanmoins, nous savons encore peu de chose sur les propriétés précises de la libération des gliotransmetteurs. Comprendre les propriétés spatio-temporelles de cette libération est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. En utilisant des outils fluorescents récemment développés et en combinant différentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations très précises sur la libération de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirmé que cette libération était un processus très rapide et qu'elle était contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libération des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble être à la base de la libération extrêmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidité de libération et cette complexité structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulièrement adaptées à une communication rapide et qu'elles peuvent, au même titre que les neurones dont elles seraient les partenaires légitimes, participer à la transmission et à l'intégration de l'information cérébrale.RESUMEDe petites vésicules, les « SLMVs » ou « Synaptic Like MicroVesicles », exprimant des transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluTs) et libérant du glutamate par exocytose régulée, ont récemment été décrites dans les astrocytes en culture et in situ. Néanmoins, nous savons peu de chose sur les propriétés précises de la sécrétion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulussécrétion des astrocytes n'est pas basé sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais nécessite l'intervention de seconds messagers et la libération du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les propriétés spatio-temporelles de la sécrétion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. Nous avons utilisé des outils fluorescents récemment développés pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la sécrétion des SLMVs à l'échelle de la cellule mais également à l'échelle des évènements. L'utilisation combinée de l'épifluorescence et de la fluorescence à onde évanescente nous a permis d'obtenir une résolution temporelle et spatiale sans précédent. Ainsi avons-nous confirmé que la sécrétion régulée des astrocytes était un processus très rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons découvert que cette sécrétion est contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit des compartiments cytosoliques délimités par le RE à proximité de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble être à la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la sécrétion. L'existence de compartiments subcellulaires indépendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manière efficace la nonexcitabilité électrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des différents pools de vésicules recrutés séquentiellement et fusionnant selon des modalités distinctes ainsi que l'existence de mécanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggèrent que les astrocytes peuvent faire face à une stimulation soutenue de leur sécrétion. Ces données suggèrent que la libération de gliotransmetteurs par exocytose régulée n'est pas seulement une propriété des astrocytes en culture mais bien le résultat d'une forte spécialisation de ces cellules pour la sécrétion. La rapidité de cette sécrétion donne aux astrocytes toutes les compétences pour pouvoir intervenir de manière active dans la transmission et l'intégration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.

Étude de la symbiose actinorhizienne chez l'aulne en présence de résidus miniers aurifères acidogènes

Les concentrations de métaux lourds retrouvées dans les sols augmentent considérablement depuis la révolution industrielle et s’accumulent quotidiennement dans la biosphère. Ces composés métalliques persisteront pendant plusieurs années au niveau des différents écosystèmes affectés et voyageront dans les chaînes alimentaires par bioaccumulation. Les activités humaines, telle que l’industrie minière contribuent activement à cette problématique environnementale. En effet, l’excavation minière perturbe la roche-mère et favorise l’oxydation des métaux lourds sulfurés qui, lentement, produiront de l’acide sulfurique. Cette acidification peut mobiliser les éléments métalliques stables en condition neutre ou alcaline. Ces phénomènes induisent la formation du drainage minier acide (DMA) qui peut contaminer les cours d’eau ou les nappes phréatiques à proximité. Plusieurs mines sont situées en Abitibi-Témiscamingue en raison de l’abondance de divers minerais dans la roche mère tels que l’or. Une importante quantité de déchets industriels est produite lors de l’excavation du minerai, dont les résidus miniers entreposés dans des bassins de rétention extérieurs. Ces bassins prennent de l’expansion quotidiennement autour du site minier substituant la place de la végétation saine et des territoires. Une mise en végétation des sites miniers du Québec est exigée depuis 1995 afin de redonner une apparence naturelle aux sites et limiter le phénomène d’érosion. Depuis 2013, un plan de réaménagement et de restauration des sites exploités est obligatoire selon la loi sur les mines. Ces bassins seront donc ciblés pour effectuer des essais de revégétalisation par l’entremise de plantes actinorhiziennes. Les plantes actinorhiziennes sont des végétaux robustes pouvant coloniser nombreux habitats perturbés et hostiles. L’aulne est une plante actinorhizienne pouvant établir une relation symbiotique avec l’actinobactérie fixatrice d’azote du genre Frankia. La symbiose actinorhizienne est une interaction équitablement profitable entre la plante et la bactérie. Cette symbiose repose sur la capacité de la bactérie à transformer, au niveau des nodules, l’azote atmosphérique en ammonium assimilable grâce à une enzyme spécifique, la nitrogénase. Lorsque la symbiose est bien établie, elle donnera un avantage significatif aux plantes pour leur développement et leur croissance, et ce, même dans un substrat pauvre en nutriments ou contaminé. En effet, la symbiose actinorhizienne permet d’améliorer la structure physicochimique d’un sol et de l’enrichir en azote grâce à la fixation de l’azote atmosphérique. Dans la région de l’Abitibi-Témiscamingue, la mine Doyon est une mine d’or qui détient des sols acidogènes contenant des traces non négligeables de métaux lourds. Ce projet de recherche en microbiologie environnementale avait comme objectif principal d’évaluer la capacité des aulnes rugueux et des aulnes crispés à coloniser des résidus miniers acidogènes aurifères (concentrations différentes de 0 %, 35 %, 65 % et 100 %) avec ou sans l’aide de Frankia. La dispersion des contaminants par les feuilles a aussi été étudiée afin d’évaluer le risque environnemental de l’utilisation des aulnes sur le terrain à des fins de revégétalisation. Les objectifs préliminaires avaient comme but d’évaluer la résistance, de manière individuelle, de la souche ACN10a du genre Frankia (par extrait aqueux) puis des espèces d’aulne aux résidus miniers non stérilisés. Par le fait même, la microflore des résidus miniers a été étudiée dans le but d’isoler des espèces symbiotiques d’endophytes écoadaptées aux conditions arides du site minier Doyon. Concernant les objectifs préliminaires, les résultats ont démontré que la souche ACN10a résiste bien jusqu’à 35 % d’extrait aqueux de résidus miniers de la mine Doyon. Pour les concentrations supérieures à 50 %, Frankia (souche ACN10a) a démontré une respiration cellulaire et des concentrations protéiques décroissantes en raison de la présence d’éléments toxiques biodisponibles dans l’extrait aqueux. Par ailleurs, les aulnes rugueux et crispés ont démontré une tolérance jusqu’à la concentration de 35 % de résidus miniers non stérilisés sans la présence de Frankia. Par la suite, les résultats d’isolement n’ont pas démontré la capacité des aulnes à recruter des bactéries symbiotiques à partir des résidus miniers de la mine Doyon. Concernant l’objectif principal, les résultats ont démontré que l’aulne rugueux résiste mieux que l’aulne crispé jusqu’aux concentrations de 35 % de résidus miniers lorsqu’inoculés en manifestant une meilleure biomasse sèche totale, une plus grande concentration de chlorophylle dans les feuilles et un plus grand nombre spécifique de nodules. L’établissement symbiotique a été affecté par la présence des résidus miniers acidogène révélant que le nombre de site d’infection racinaire diminuait en fonction des concentrations de résidus miniers croissantes (0 %, 35 %, 65 % et 100 %). Ensuite, une analyse des éléments chimiques des feuilles a démontré que le transfert des métaux lourds des résidus miniers vers les feuilles était minime. Les plantes révélant de hautes teneurs en métaux lourds dans leurs feuilles ont développé par le fait même, une faible biomasse aérienne limitant ainsi la dispersion de contaminants lors de la perte des feuilles à l’automne. Le modèle expérimental aulne-Frankia possédait un seuil de tolérance visible à la concentration de 35 % de résidus miniers acidogènes aurifères de la mine Doyon. De plus, la présence de la symbiose actinorhizienne a modulé la distribution de certains éléments chimiques dans les feuilles en comparaison avec les aulnes non-inoculés (molybdène, nickel). Puis, une similarité a été notée dans la composition chimique des feuilles d’aulnes inoculés s’étant développés dans 0 % (témoin positif) et 35 % de résidus miniers.