Estabelecimento de culturas de raízes e avaliação fitoquímica e da atividade antioxidante de Passiflora pohlii Mast

Passiflora pohlii Mast., conhecida como maracujá-do-campo ou maracujazinho, é uma espécie nativa do Brasil que apresenta características de interesse agronômico, principalmente em relação à tolerância a patógenos do solo pertencentes ao gênero Phytophtora sp, que provocam grandes prejuízos à cultura de maracujá. Embora ainda existam poucos trabalhos sobreesta espécie, estudos recentes com espécies do gênero descreveram atividades biológicas e farmacológicas em extratos de diferentes órgãos, incluindo folhas e raízes. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de culturas de raízes adventícias a partir de segmentos caulinares e radiculares excisados de plantas in vitro de P. pohlii e a avaliação do perfil fitoquímico e do potencial antioxidante dos extratos obtidos a partir de diferentes materiais obtidos in vitro, em comparação com plantas mantidas in vivo. Foram testados diferentes sistemas de cultura, além de tipos e concentrações de auxinas para a indução de raízes adventícias in vitro a partir de segmentos caulinares e radiculares. As culturas foram mantidas à temperatura de 252C, na presença ou ausência de luz. As respostas obtidas variaram de acordo com o tipo de explante utilizado. Segmentos internodais apresentaram a melhor taxa de indução de rizogênese em meio solidificado com ágar e suplementado com ANA a 2,7 μM, na ausência de luz, enquanto que segmentos radiculares tiveram maior taxa de proliferação em meio líquido sob agitação, suplementado com AIA a 2,85 μM, na ausência de luz. Os materiais botânicos produzidos in vitro, incluindo plantas completas e raízes adventícias obtidas a partir de segmentos internodais e radiculares, assim como plantas obtidas in vivo, foram utilizados para a produção de extratos etanólicos para a avaliação do perfil fitoquímico e da atividade antioxidante. As análises por CCD e CLAE-UV indicaram a presença de flavonoides e saponinas nos extratos de folhas de plantas mantidas in vivo e obtidas in vitro, enquanto que os extratos de raízes apresentaram apenas saponinas. Os extratos de folhas foram ainda submetidos à análise por CLAE-UV-IES-EM visando à identificação da massa molecular das substâncias encontradas. Foram identificados dois flavonoides, possivelmente isômeros, com massas moleculares de 607,2, nos extratos de folhas de plantas mantidas in vivo e obtidas in vitro. O potencial antioxidante dos diferentes materiais foi determinado pelos ensaios de 2,2-difenil-1-picril-hidrazila e CCD-DPPH. As maiores atividades antioxidantes foram observadas nos extratos de raízes primárias e secundárias excisadas de plantas mantidas in vivo. As estratégias de cultura de raízes in vitro descritas neste trabalho foram aplicadas com sucesso para P. pohlii. Além disso, a caracterização do perfil fitoquímico do material obtido in vitro e de plantas mantidas in vivo, assim como do seu potencial farmacológico, foi realizada pela primeira vez para a espécie

白皮松（Pinus bungeana）和青杄（Picea wilsonii）花粉脱壁技术建立及细胞学研究

花粉是种子植物受精过程中雄性生殖细胞的载体，在有性生殖过程中起着非常重要的作用。花粉与柱头、花柱、子房等都有相互作用，起识别作用的是细胞壁蛋白，而花粉粒的壁有明显的两层：内壁和外壁。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢、授粉－受精时间长等特点。花粉的内壁与外壁在花粉萌发和生长过程中的功能仍然缺乏研究，但是迄今为止现有的分子生物学技术在获得裸子植物花粉壁突变体方面并没有发挥作用。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)和青杄（Picea wilsonii）花粉为材料建立裸子植物花粉脱壁的体系，包 括脱外壁花粉和花粉原生质体的制备，即将花粉的两层壁逐层剥离，并在此基础上进行了细胞学研究。 本文首先建立了裸子植物脱外壁花粉的分离技术。实验表明低浓度的酶组合短暂酶解后，辅以机械研磨，可以释放出大量的脱外壁花粉。其中在这两种裸子植物中的处理稍有不同，白皮松的脱外壁花粉在含12％蔗糖，0.5%纤维素酶和0.3%离析酶的溶液，pH 5.8 ，孵育半小时，辅以一定力度机械研磨的方法获得，而青杄脱外壁花粉的条件是0.8%纤维素酶和0.5%离析酶、12％蔗糖的溶液，其它条件类似。 其次我们成功建立了一种快速、有效、可重复的分离白皮松和青杄花粉原生质体的系统，分离频率可高达70%。对白皮松而言，最好的分离条件是2% 纤维素酶、1.5%离析酶、15%蔗糖、pH 5.8，黑暗、24℃条件下轻微振荡、酶解6 小时。3％纤维素酶和2％离析酶组合比较适宜青杄花粉原生质体的分离，同时需要较低浓度的蔗糖溶液（12％）。青杄花粉原生质体要远大于白皮松花粉原生质体，前者直径为80µm，后者为40µm。强烈的FDA 荧光显示很好的活性。在制备的过程中，酶的浓度、酶的配比、酶解时间、渗透压调节剂、起始材料对分离率都有影响。 运用免疫荧光标记技术显示，脱外壁花粉的表面存在纤维素、果胶质、阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和凝集素结合位点，其中纤维素在整个表面都有分布，但在萌发孔附近的荧光最强;白皮松脱外壁花粉表面有胼胝质的存在，主要位于靠近气囊的部位，而青杄脱外壁花粉表面未能检测到胼胝质;酸性果胶质在白皮松脱外壁花粉靠近萌发孔处的荧光稍弱于其它部位，而在青杄脱外壁花粉的表面近极端的荧光要强于远极端;白皮松脱外壁花粉表面有酯化果胶的沉积，而青杄脱外壁花粉表面缺失酯化果胶;白皮松和青杄两种植物脱外壁花粉表面均有阿拉伯半乳糖的分布，而白皮松脱外壁花粉的荧光要远强于青杄;白皮松和青杄脱外壁花粉表面有伴刀豆凝集素（Conconavalin agglutinin, Con A ）和大豆凝集素（soybean agglutinin, SBA ）结合位点的分布，而缺失麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）结合位点。另外，傅立叶红外光谱(FTIR) 分析结果也同样支持上述结论。