Caractérisation du rôle de l’amyline (IAPP) dans le diabète de type 2 : études de dérivés peptidiques et de composés inhibiteurs de la formation d’amyloïde

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement.

Protein-Expressions-Analysen zur Etablierung prädiktiver Biomarker bei der Behandlung fortgeschrittener Tumoren der Mamma und der Prostata

Aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie zur Behandlung maligner Erkrankungen erfordern neuartige Verfahren zur Diagnostik und Selektion geeigneter Patienten. So ist das Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifizierung neuer Zielmoleküle, die die Vorhersage eines Therapieerfolges mit targeted drugs ermöglichen. Besondere Aufmerksamkeit gilt dem humanisierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab (Herceptin), der zur Therapie Her-2 überexprimierender, metastasierter Mammakarzinome eingesetzt wird. Jüngste Erkenntnisse lassen eine Anwendung dieses Medikamentes in der Behandlung des Hormon-unabhängigen Prostatakarzinoms möglich erscheinen. Therapie-beeinflussende Faktoren werden in der dem Rezeptor nachgeschalteten Signaltransduktion oder Veränderungen des Rezeptors selbst vermutet. Mittels Immunhistochemie wurden die Expressions- und Aktivierungsniveaus verschiedener Proteine der Her-2-assoziierten Signaltransduktion ermittelt; insgesamt wurden 37 molekulare Marker untersucht. In Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete korrespondierende Normal- und Tumorgewebe von 118 Mammakarzinom-Patientinnen sowie 78 Patienten mit Prostatakarzinom wurden in TMAs zusammengefasst. Die in Zusammenarbeit mit erfahrenen Pathologen ermittelten Ergebnisse dienten u.a. als Grundlage für zweidimensionales, unsupervised hierarchisches clustering. Ergebnis dieser Analysen war für beide untersuchten Tumorentitäten die Möglichkeit einer Subklassifizierung der untersuchten Populationen nach molekularen Eigenschaften. Hierbei zeigten sich jeweils neue Möglichkeiten zur Anwendung zielgerichteter Therapien, deren Effektivität Inhalt weiterführender Studien sein könnte. Zusätzlich wurden an insgesamt 43 Frischgeweben die möglichen Folgen des sog. shedding untersucht. Western Blot-basierte Untersuchungen zeigten hierbei die Möglichkeit der Selektion von Patienten aufgrund falsch-positiver Befunde in der derzeit als Standard geltenden Diagnostik. Zusätzlich konnte durch Vergleich mit einer Herceptin-sensitiven Zelllinie ein möglicher Zusammenhang eines Therapieerfolges mit dem Phosphorylierungs-/ Aktivierungszustand des Rezeptors ermittelt werden. Fehlende klinische Daten zum Verlauf der Erkrankung und Therapie der untersuchten Patienten lassen keine Aussagen über die tatsächliche Relevanz der ermittelten Befunde zu. Dennoch verdeutlichen die erhaltenen Resultate eindrucksvoll die Komplexität der molekularen Vorgänge, die zu einem Krebsgeschehen führen und damit Auswirkungen auf die Wirksamkeit von targeted drugs haben können. Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie erfordern Verbesserungen auf dem Gebiet der Diagnostik, die die sichere Selektion geeigneter Patienten erlauben. Die Zukunft der personalisierten, zielgerichteten Behandlung von Tumorerkrankungen wird verstärkt von molekularen Markerprofilen hnlich den hier vorgestellten Daten beeinflusst werden.

Spontaneous Periodontitis Development in Diabetic Rats Involves an Unrestricted Expression of Inflammatory Cytokines and Tissue Destructive Factors in the Absence of Major Changes in Commensal Oral Microbiota

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

No mutations found in exons of TP53, H-RAS and K-RAS genes in liver of male Wistar rats submitted to a medium-term chemical carcinogenesis assay

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR)

Este trabalho visou a comparação de cinco métodos diferentes de extração de DNA de materiais de arquivo (tecidos incluídos em parafina, esfregaços de sangue periférico - corados e não corados com Leishman, lâminas com mielogramas, gotas de sangue em Guthrie Card) e de fontes escassas (células bucais, um e três bulbos capilares e 2 mL de urina), para que fossem avaliadas a facilidade de aplicação e a facilidade de amplificação deste DNA pela técnica da reação de polimerização em cadeia (PCR). Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida ou não por purificação com fenol/clorofórmio; Chelex 100® (BioRad); Insta Gene® (BioRad) e fervura em água estéril. O DNA obtido foi testado para amplificação de três fragmentos gênicos: Brain-derived neutrophic factor (764 pb), Factor V Leiden (220 pb) e Abelson (106 pb). de acordo com o comprimento do fragmento gênico estudado, da fonte potencial de DNA e do método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização de procedimentos técnicos a serem incluídos no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - Unesp - Botucatu.

Geographic variation in Epstein-Barr virus-associated Burkitt's lymphoma in children from Brazil

In developing countries, BL has a strong association with EBV infection during childhood. In South America, the data have shown an EBV association intermediate between that reported in the United States (30%) and that in equatorial Africa (95%). Early age at EBV infection and lower socioeconomic status have been related to increased EBV-associated BL in developing countries. In Brazil, there are not enough data on childhood BL related to EBV infection. Our aim was to evaluate the clinicopathologic features and EBV association of 44 children with NHL from the state of Rio de Janeiro, situated in the southeast of Brazil. EBV was detected using RNA in situ hybridization in 36 biopsy specimens. DNA from fresh tumor samples and from paraffin-embedded tissues of patients were analyzed by PCR, in which the first reaction included primers for an EBNA-2 common region while the nested reaction amplified the region discriminating between EBV types I and 2 in separate reactions. EBV was detected in 21 of 29 BLs (72%), and type I virus infected the majority of EBV-positive BLs (18/21). There was a trend for younger age in children with EBV-positive BL compared to EBV-negative BL (median age 4 compared to 6 years, respectively; p = 0.056). Our study confirmed that in the southeast of Brazil BL had an intermediate association with EBV. A higher rate of EBV-associated BL was described in the northeast of Brazil. These differences are probably related to regional socioeconomic status. In conclusion, our study suggests that early infection with EBV in the background of a low socioeconomic condition associated with other environmental factors could contribute to BL in Brazil. (C) 2003 Wiley-Liss, Inc.

Microdissecção e captura a laser na investigação do gene TP53 em tecidos incluídos em parafina

INTRODUÇÃO: Microdissecção e captura a laser (MCL) é uma técnica de desenvolvimento recente que permite a coleta de células individuais ou pequeno conjunto de células para análise molecular. Atualmente, no Brasil, há raros microscópios para MCL, de modo que a divulgação dos procedimentos inerentes a essa técnica é oportuna para destacar seu amplo potencial para diagnóstico e investigação. OBJETIVO: Este trabalho descreve a padronização dos procedimentos de MCL e de extração de DNA de material fixado em formalina e incluído em parafina. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados o éxon 8 do gene TP53 e o gene da ciclofilina em amostras de tecido normal e de neoplasias de fígado e rim provenientes de modelo de carcinogênese química induzida em rato. A extração do DNA foi comprovada por reação em cadeia da polimerase (nested-PCR). RESULTADOS: Foram padronizados os procedimentos de preparo dos cortes histológicos, de microdissecção e captura a laser e de obtenção de seqüências gênicas pela reação de nested-PCR para tecidos incluídos em parafina. Obtivemos amplificação de 48,3% das amostras para o éxon 8 do gene TP53 e 51,7% para o gene da ciclofilina. Considerando pelo menos um dos dois segmentos gênicos, foram amplificadas 79,3% das amostras. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: A extração de DNA de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina e a técnica de nested-PCR foram adequadamente padronizadas para produtos gênicos de interesse, obtidos de material coletado por MCL. Esses procedimentos podem ser úteis para a obtenção de seqüências de DNA de arquivos para análise molecular.

Avaliação de dois métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação em PCR

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

DETECTION OF CELL-PROLIFERATION IN TISSUE-SECTIONS

1. Cell proliferation is of interest since abnormal cell proliferation appears to be a precursor of tumorigenesis and also because the quantitative description of cell proliferation in tumors can be used to predict the biological behavior of a particular neoplasia.2. Them am several reliable methods of studying cell proliferation in tissues. One of the most important is the detection of the Ki67 defined antigen in frozen sections. The number of cells expressing Ki67 correlates with histological grades of tumors and can also be predictive of clinical outcome. The Ki67 can be localized in tissue sections using monoclonal antibodies in association with the immunoperoxidase technique.3. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a component of DNA polymerase-delta and is another important cell proliferation marker manifesting a striking increase in concentration during the S phase of the cell cycle. 19A2 and PC10 are two different monoclonal antibodies which can be employed to detect PCNA in paraffin-embedded tissues.4. Molecular biology has also been making a great contribution to the study of cell proliferation. The most recent innovation in tissue identification of proliferating cells is the use of in situ hybridization for the localization of histone H3 and/or H4 mRNA. H3 mRNA-positive cells appear to be present in basal cells of the skin and in crypt cells of the intestine which are sites with high proliferation rate.

Avaliação da população de células tronco tumorais nas neoplasias da glândula mamária em cadelas

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Avaliação histopatológica, imunoistoquímica e detecção molecular do DNA viral no sistema nervoso central de bovinos inoculados experimentalmente com herpesvirus bovino 5

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Detecção do papilomavírus humano (HPV) em carcinoma epidermóide de lábio através da nested PCR e sua correlação com os fatores de risco, características clínicas, anatomopatológicas e de sobrevida

Pós-graduação em Odontologia - FOA

Alterações genômicas em tumores de glândulas salivares

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Extração de DNA de material de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR)

Pós-graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica - FMB

Análise das células tronco tumorais em neoplasias mamárias de cães

Mammary tumors are the most frequent cancers in dogs, representing about 50% of tumors, and have a higher incidence in females of middle aged and elderly. These tumors have been used as a model for breast cancer in women due to several common characteristics such as histological and immunohistochemical similarities. In the last decade, studies based on molecular profiles of breast cancer, made possible the identification of some neoplastic cells with characteristics of stem cells - cancer stem cells (CSC). One of the putative molecules of CSCs is CD44. Recent studies have established a crucial link between the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and the acquisition of molecular and functional properties of stem cells. For that reason we analyzed the expression of proteins CD44, Cytokeratins AE1/AE3 and Vimentin, in dogs mammary tumors, to investigate the potencial for CSC markers, and its relation with the EMT using immunohistochemistry in paraffin embedded tissues making use of techniques such as Tissue MicroArrays (TMA). Immunostaining of cytokeratin had no significant difference between benign and malignant tumors (p ≥ 0,05), being more intense in malignant tumors. However vimentina showed higher staining intensity in benign tumors, but with no significant difference (p ≤ 0,05). The expression of CD44 was higher in malignant tumors that have greater proliferative and metastatic potencial, however its relation with EMT was not detected in the analyzed tumors. The techniques applied for the TMAs were efficient and can be used in routine and later researches.