Occurrence of anti-Neospora caninum and anti-Toxoplasma gondii antibodies in dogs with visceral leishmaniasis

Uninfected dogs and those naturally infected with Leishmania chagasi exhibiting different clinical forms of disease were evaluated for the presence of anti-Neospora caninum and anti-Toxoplasma gondii antibodies. Blood samples were collected from 110 mongrel dogs. Sera were tested using the indirect fluorescent antibody test (IFAT), and the animals with visceral leishmaniasis (VL) (n=60) were classified clinically. Out of the 110 sera investigated, 5 (4.5%) were positive for N. caninum (IFAT>50) and 36 (32.7%) for T. gondii (IFAT>16). Anti-L. chagasi antibody titers in asymptomatic dogs (n=10) were found to be significantly lower (P<0.05) than those in oligosymptomatic ones (n=22), which were in turn significantly lower (P<0.05) than those in symptomatic ones (n=28). No association between Leishmania and N. caninum infections was observed. Among dogs infected with L. chagasi, a tendency (P=0.053) towards an association between the infection with T. gondii and the appearance of VL symptoms was observed, suggesting that the clinical manifestation of VL in dogs may enhance their susceptibility to T. gondii. The possible influence of the immunosuppressive status of canine leishmaniasis in the different clinical forms of the disease is discussed.

Sheep abortion associated with Neospora caninum in Mato Grosso do Sul, Brazil

Canids are the main hosts of Neospora caninum, but cattle, (sheep, goats and horses may serve as intermediary hosts. N. caninum infection of pregnant intermediary hosts may provoke abortion and neonatal infections. This study is the first to report lamb abortion associated with N. caninum in Mato Grosso do Sul. Epidemiological data were obtained from interviews with sheep producers. For microscopic examination, fragments of different organs removed from 4 sheep fetuses, aborted and necropsied, were fixed in 10% formaldehyde, embedded in paraffin and subjected to the hematoxylin-eosin staining protocol and immunohistochemistry (IHC) to test for N. caninum and Toxoplasma gondii. The abortion outbreak studied was reported from a herd of 268 Santa Inês sheep (including 186 pregnant ewes), with 10 abortion cases in the last third of gestation. Four fetuses were examined, 3 from a same ewe. At necropsy, one fetus exhibited crackling in the lung and all its organs were reddish. Histological findings detected mononuclear cell infiltrates among myocardium fibers and around blood vessels, in addition to circular structures with basophilic points resembling protozoans. IHC tests revealed strongly positive staining for N. caninum and weakly positive for T. gondii, characterizing N. caninum infection.

Neospora caninum em bovinos em matadouros de Pernambuco e Alagoas

A neosporose bovina é uma doença infecciosa causada pelo Neospora caninum, parasito intracelular obrigatório, sendo considerada uma das principais causas de aborto na espécie bovina em diversos países. Objetivou-se estudar a ocorrência de N. caninum em vacas e fetos nos Estados de Pernambuco e Alagoas, Brasil. Foram coletadas 306 amostras de soro sanguíneo de vacas abatidas causada pelo Neospora caninum, parasito intracelular obri-e 30 fetos nos Estados de Pernambuco e Alagoas. Para o gatório, sendo considerada uma das principais causas de diagnóstico sorológico utilizou-se a técnica de Reação de aborto na espécie bovina em diversos países. Objetivou-se Imunoflurescência Indireta (RIFI) com ponto de corte estudar a ocorrência de N. caninum em vacas e fetos nos 1:200 para os soros das vacas e para os soros fetais utilizou Estados de Pernambuco e Alagoas, Brasil. Foram coletadas 306 amostras de soro sanguíneo de vacas abatidas e 30 fetos nos Estados de Pernambuco e Alagoas. Para o diagnóstico sorológico utilizou-se a técnica de Reação de Imunoflurescência Indireta (RIFI) com ponto de corte 1:200 para os soros das vacas e para os soros fetais utilizou ponto de corte 1:25. Para a pesquisa do DNA parasitário utilizaram-se tecidos fetais submetidos à técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Na sorologia, observou-se 39/306 (12,6%) das vacas positivas e 5/30 (16,7%) dos fetos positivos. Na detecção do parasito 8/30 (26,6%) dos fetos foram positivos na PCR. Os resultados obtidos neste estudo quanto à presença do parasito nos fetos são inéditos para a região estudada e permitem concluir que este agente deve ser incluído no estudo das causas de aborto na espécie bovina nesta região do Brasil.

Seroprevalence and risk factors associated with infection by Neospora caninum of dairy cattle in the state of Alagoas, Brazil

The objective of this study was to investigate the prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle from milk producing farms of the microregion of Batalha, state of Alagoas, Brazil, as well as to identify the risk factors associated with the infection. Blood samples were collected from 1,004 cattle of 17 farms for the serological investigation regarding the presence of anti-N. caninum antibodies by the Indirect Immunofluorescence Reaction Technique (IMRT). From the total amount of samples analyzed, 77/1,004 (7.67%) were positive and 927/1,004 (92.33%) were negative. The logistical regression identified that cattle from farms without consortium breeding have an infection risk 6.33 (p<0.001; C.I. 2.89-13.10) times higher than cattle from farms with that type of breeding. Cattle from farms where the aborted fetuses are not adequately buried have an infection risk 3.04 (p<0.001; C.I. 1.64-5.63) times higher than cattle from farms with adequate destination of these fetuses. Infection by N. caninum occurs in cattle of the investigated region. The factors identified in our study can be used as risk indicators, so that control measures could be implemented to avoid infection by N. caninum in the herds of this region.

Comparação das técnicas de ELISA indireto e Imunofluorescência indireta na detecção de anticorpos anti-Neospora caninum em búfalas (Bubalus bubalis)

Para comparar dois testes sorológicos na detecção de anticorpos anti-Neospora caninum em soros sanguíneos de búfalas, foram coletados amostras de 288 búfalas entre dois a dez anos de idade. Para identificar a presença de imunoglobulina G anti-N. caninum utilizou-se à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), tendo o título 200 como ponto de corte, e o Ensaio Imunoenzimático indireto (ELISA-indireto), considerando-se positiva as amostras que obtiveram razão S/P>0,5. Observaram-se 153 (53,12%) animais soropositivos para N. caninum, através da RIFI, enquanto que 50 (17,36%) animais foram reagentes no ELISA. A ocorrência de anticorpos anti-N. caninum demonstram que o parasito esta circulando entre búfalas criadas no estado do Pará, sendo que ambos os teste de RIFI e ELISA podem ser utilizados para diagnosticar imunoglobulinas contra este agente. No entanto observou-se uma fraca correlação (Kappa=0,36) entre ambos os testes, considerando a RIFI como padrão ouro.

Desempenho reprodutivo entre receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum, após a transferência de embriões

O uso do conhecimento de biotécnicas para a melhoria da produção de bens e serviços tem avançado significativamente. O controle de doenças infecciosas continua a representar o maior obstáculo para a saúde dos animais. A perda embrionária pode ser responsável pelo aumento de prejuízos econômicos isolados para os produtores de bovinos. A infecção por Neospora caninum tem emergido como uma importante doença reprodutiva e, em vários países, tem sido diagnosticada como principal causa de aborto. O objetivo desse trabalho foi comparar o desempenho reprodutivo em receptoras bovinas não contaminadas e naturalmente infectadas por Neospora caninum após a transferência de embriões (TE). A escolha dos animais (n=395) para o experimento foi realizada através de avaliação ginecológica, via palpação transretal. As vacinações seguiram protocolo sanitário recomendado para a TE. O manejo nutricional foi baseado no National Research Council (NRC, 1999). A TE de embriões descongelados foi feita após a sincronização do ciclo estral das receptoras. Para a avaliação do desempenho reprodutivo se utilizou de ultrassonografia transretal. A identificação das receptoras positivas para Neospora caninum realizou-se através do teste de ELISA e, para as amostras reagentes, confirmação através de imunofluorescência indireta (IFI). Os dados foram analisados utilizando Past® e foram considerados estatisticamente significantes (P<0,01). Os resultados mostram uma taxa de prenhes (n=191) de 48,35%, seguida de uma taxa de abortos aos 60 dias de gestação (n=14) de 3,5% e abortos ao sexto mês de gestação (n=12) de 3,04%. Esses resultados tornam-se relevantes quando se leva em consideração que, receptoras infectadas pelo protozoário não apresentaram uma taxa elevada de perdas gestacionais. A insignificância estatística dos dados obtidos nesse estudo confere a segurança em sugerir que não há necessidade em implantar o diagnóstico ou controle prévios para Neosporose em rebanhos aptos a TE.

Concomitant infection of Neospora caninum and Bovine Herpesvirus type 5 in spontaneous bovine abortions

Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) has not been conclusively demonstrated to cause bovine abortion. Brain lesions produced by Neospora caninum and Bovine Herpesvirus type 1 (BoHV-1) exhibit common features. Therefore, careful microscopic evaluation and additional diagnostic procedures are required to achieve an accurate final etiological diagnosis. The aim of the present work was to investigate the occurrence of infections due to BoHV-1, BoHV-5 and N. caninum in 68 cases of spontaneous bovine abortions which showed microscopic lesions in the fetal central nervous system. This study allowed the identification of 4 (5.9%) fetuses with dual infection by BoHV-5 and N. caninum and 33 (48.5%) cases in which N. caninum was the sole pathogen identified. All cases were negative to BoHV-1. The results of this study provide evidence that dual infection by BoHV-5 and N. caninum occur during pregnancy in cattle; however, the role of BoHV-5 as a primary cause of bovine abortion needs further research. Molecular diagnosis of BoHV-5 and N. caninum confirmed the importance of applying complementary assays to improve the sensitivity of diagnosing bovine abortion.

Desenvolvimento e padronização do Dot-ELISA usando peptídeos recombinantes para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum

A neosporose é reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos últimos anos esta doença tem atraído o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e métodos eficazes de diagnóstico desta doença. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum com um peptídeo recombinate como antígeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnóstico a campo. O peptídeo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genética reversa de epítopos antigênicos originados de uma proteína de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronização do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antígeno e posteriormente os soros foram diluídos em solução de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelação foi feita mediante a adição de Proteína G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solução reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo após a padronização foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescência indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnóstico a campo na Plataforma Tecnológica RapidFlow-Through Miriad®, o peptídeo rNcGRA1 apresentou marcações visíveis ao reagir com os soros positivos, e não apresentou marcações usando os soros negativos. Este estudo é o primeiro a utilizar peptídeos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnóstico sorológico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum.

Occurrences of anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum antibodies in sheep from four districts of Tocantins state, Brazilian Legal Amazon Region

Toxoplasmosis and neosporosis have been recognized as economically important diseases with considerable impact on the livestock industry. Little is known concerning the occurrence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sheep from Tocantins state, Brazil. Here, we investigated antibodies against these parasites and associated factors in 182 sheep from Araguaína, Santa Terezinha do Tocantins, Arguianópolis and Palmeiras do Tocantins districts, Tocantins. Sheep sera were assayed for T. gondii and N. caninum IgG antibodies by indirect fluorescence antibody test (IFAT), using cut-off point at a dilution of 1:40 and 1:25 respectively. The prevalence of seropositive animal for T. gondii was 13.74% and 13.74% for N. caninum. None of the characteristics studied including reproductive problems, presence of cats, presence of dogs and veterinary care (p>0.05) was associated with occurrence of T. gondii or N. caninum infection. Only breed was identified as associated factor for the occurrence of toxoplasmosis in sheep (p<0.05). The present study is the first report on serum occurrence of T. gondii and N. caninum in sheep from the state of Tocantins, Brazil.

Aborto bovino por Neospora caninum: fatores associados ao resultado positivo da imunoistoquímica

Um total de 237 fetos bovinos abortados foram enviados ao Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul entre junho de 1999 e maio de 2004. Tecidos destes fetos foram analisados através da histologia e imunoistoquímica (IHQ) anti-Neospora caninum. Destes, 72 apresentaram lesões histológicas sugestivas de infecção por protozoário, caraterizadas pela presença de miosite não-supurativa, miocardite não-supurativa, pneumonia intersticial mononuclear associada a focos de necrose e encefalite necrosante não-supurativa multifocal. O cérebro apresentava consistência líquida ou semi-líquida em 61,1% dos fetos, dificultando a obtenção de tecido para a análise histológica e IHQ. A IHQ revelou a presença de taquizoítos e raros cistos de N. caninum no cérebro de 33/47 (70,2%) dos fetos que apresentam lesões histológicas sugestivas de infecção por protozoário. No modelo final da análise multivariada, três variáveis estiveram associadas significativamente com resultado positivo na IHQ nos fetos abortados: consistência do cérebro (P=0,031), lesão no cérebro (P=0,028) e idade (P=0,189). As chances de um resultado positivo na IHQ de N. caninum foram 4,35 vezes maiores (OR=4,35; 95% CI:1,1320-2,8116) quando o feto apresentava cérebro com consistência considerada normal e 4,94 vezes maiores (OR=4,94; 95%CI: 0,1646-3,0313) na presença de lesão sugestiva de infecção por protozoário caracterizada por encefalite de intensidade variada. A probabilidade de resultado positivo na IHQ foi inversamente proporcional à idade fetal, cada mês adicional de gestação diminuíram as chances de um feto apresentar resultado positivo na imunoistoquímica por 0,41 (OR=0,41, 95%CI: 1,5982- 0,1436).

Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros, cães e trabalhadores rurais da região Sudoeste do Estado de Mato Grosso

Considerando a importância da neosporose interferindo na produtividade animal, avaliou-se a frequência de anticorpos anti-Neospora caninum em amostras de soros de bovinos leiteiros da Região Sudoeste do Estado de Mato Grosso, Brasil, complementando-se com amostras sorológicas colhidas de cães e de humanos que conviviam nas mesmas propriedades rurais amostradas. Um total de 1.036 amostras de soros foram analisadas, sendo 932 de fêmeas bovinas leiteiras, 37 de cães e 67 de humanos, provenientes de 24 propriedades e examinados por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI). As amostras de soros humanos reagentes foram testadas novamente por Western-blotting para confirmação dos resultados. Anticorpos anti-N. caninum foram encontrados em 499 bovinos (53,5%), em pelo menos um animal positivo por propriedade, em 25 caninos (67,6%) e em sete humanos (10,5%). Não houve diferença significativa no número de bovinos positivos por faixa etária. Os resultados obtidos indicam uma ampla disseminação de N. caninum na região estudada.

Neospora caninum infection in birds: experimental infections in chicken and embryonated eggs

Neospora caninum causes economical impact in cattle-raising farms since it is implicated as the major cause of bovine abortions. Although infection by the parasite has been widely described in mammals, the role of birds in its life-cycle is still obscure. Therefore, this work aimed to evaluate the infection by N. caninum in different chicken models. Experimental infections were conducted in 7-day-old chicks, laying hens and embryonated eggs, where samples were analysed for parasite burden, IgG antibodies and lesions promoted. Chickens demonstrated an asymptomatic infection, although with seroconversion and systemic replication of the parasite. In laying hens, no signs of vertical transmission were observed. However, embryonated eggs inoculated by the allantoic cavity route demonstrated susceptibility to infection, with mortality rates around 50% independent of the inoculum dose. Additionally, dogs became infected after ingestion of different amounts of inoculated eggs, producing either oocysts or specific IgG antibodies. The results herein presented demonstrate that chickens may be intermediate hosts of N. caninum and that embryonated eggs could be a useful model to study the parasite's biology.

Possible role of bovine trophoblast giant cells in transplacental transmission of Neospora caninum in cattle

Neospora caninum is an aplicomplexan parasite that has brought several concerns to cattle raisers worldwide due to its relationship to fetal loss. However, the mechanism of the parasite's transplacental infection and induced abortions are not completely understood. Bovine trophoblastic binucleated cells (BNC) play a major role in the maternal-fetal interactions, migrating during the entire pregnancy from chorionic connections to uterine epithelium. This study aimed to investigate the possible role of BNC as phagocytic cells and its participation in the bovine transplacental infection of N. caninum. BNC was isolated by discontinuous Percoll gradient, and characterized by Hoeschst 33342 nucleus-specific staining. Isolated BNC were cultured in DMEM supplemented with 10% bovine fetal serum, and infected with 10(4) tachyzoites of N. caninum NC-1 strain. Parasite invasion was visualized by indirect immunofluorescence and Giemsa technique. Multiplication of parasites took place in 2-3 day cycles. Healthy cows' placenta and normal and infected cultured BNC was immunostained with monoclonal antibodies against CD-163, MAC-387 and NOS, demonstrating their phagocyte capacity. Thus, BNC was characterized as cells with macrophagic activity, which may host N. caninum in vitro. Therefore, we may conclude that BNC could potentially participate in the transplacental infection of bovine neosporosis.

Pigeons (Columba livia) are a suitable experimental model for Neospora caninum infection in birds

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Occurrence of anti-Neospora caninum and anti-Toxoplasma gondii IgG antibodies in goats and sheep in western Maranhão, Brazil

A neosporose e a toxoplasmose são doenças parasitárias que podem causar problemas reprodutivos em caprinos e ovinos. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de anticorpos IgG anti-Neospora caninum e anti-Toxoplasma gondii em caprinos e ovinos dos municípios de Amarante do Maranhão e Buritirana, microrregião de Imperatriz, Oeste maranhense, Nordeste do Brasil, bem como avaliar fatores associados à infecção por esses agentes etiológicos. Amostras de sangue de 110 animais (46 caprinos e 64 ovinos), provenientes de cinco propriedades, foram coletadas, e a reação de imunofluorescência indireta utilizada para o diagnóstico sorológico. Das 46 amostras de caprinos, 17,39% (n = 8) apresentaram anticorpos anti-N. caninum e 4,35% (n = 2) anti-T. gondii, enquanto das 64 amostras de ovinos, 4,69% (n = 3) e 18,75% (n = 12) apresentaram anticorpos anti-N. caninum e anti-T. gondii, respectivamente. Não houve diferença significativa, considerando-se a presença de gato e/ou cão na propriedade e assistência veterinária para ambos os agentes estudados. Entretanto, suplementação alimentar e presença de animais com problemas reprodutivos diferiram significativamente (p < 0,05) em ovinos e caprinos, respectivamente. Os resultados do presente estudo demonstraram que caprinos e ovinos, da região Oeste do Maranhão são expostos aos coccídios N. caninum e T. gondii. Essa é a primeira evidência desses agentes em pequenos ruminantes nessa região.