Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the lectin from Canavalia gladiata seeds

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Crystallization and preliminary X-ray analysis of SIII-SPIII, a ahospholipase A2 isolated from the venom of Bothrops jararacussu

Large single crystals have been obtained of SIII-SPIII, a phospholipase A2 from the venom of Bothrops jararacussu. The crystals belong to the orthorhombic system space group C222, and diffract X-rays to a resolution of 1.9 Å. Preliminary analysis reveals the presence of one molecule in the crystallographic asymmetric unit. The crystal structure is currently being determined using molecular replacement techniques.

Estudos estruturais da Purina Nucleosídeo Fosforilase do Mycobacterium tuberculosis complexada com ligantes

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudos estruturais de uma lectina presente em sementes de Lotus tetragonolobus

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of importin-alpha from Neurospora crassa

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Crystallization and preliminary X-ray diffraction of malate dehydrogenase from Plasmodium falciparum

The expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction characterization of malate dehydrogenase (MDH) from the malarial parasite Plasmodium falciparum (PfMDH) are reported. In order to gain a deeper understanding of the function and role of PfMDH, the protein was purified to homogeneity. The purified protein crystallized in space group P1, with unit-cell parameters a = 72, b = 157, c = 159 angstrom, a = 105, beta = 101, ? = 95 degrees. The resulting crystals diffracted to a maximal resolution of 2.24 angstrom and the structure has been solved by molecular replacement, with 16 monomers in the asymmetric unit. The 16 monomers are arranged into four independent tetramers, in agreement with previous reports demonstrating the tetrameric solution state of PfMDH. The X-ray structure of PfMDH is expected to clarify the differences in catalysis by PfMDH compared with other MDH family members and to provide a basis for the structure-based design of specific PfMDH inhibitors as well as general MDH inhibitors.

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of three myotoxic phospholipases A2 from Bothrops brazili venom

Two myotoxic and noncatalytic Lys49-phospholipases A2 (braziliantoxin-II and MT-II) and a myotoxic and catalytic phospholipase A2 (braziliantoxin-III) from the venom of the Amazonian snake Bothrops brazili were crystallized. The crystals diffracted to resolutions in the range 2.562.05 angstrom and belonged to space groups P3121 (braziliantoxin-II), P6522 (braziliantoxin-III) and P21 (MT-II). The structures were solved by molecular-replacement techniques. Both of the Lys49-phospholipases A2 (braziliantoxin-II and MT-II) contained a dimer in the asymmetric unit, while the Asp49-phospholipase A2 braziliantoxin-III contained a monomer in its asymmetric unit. Analysis of the quaternary assemblies of the braziliantoxin-II and MT-II structures using the PISA program indicated that both models have a dimeric conformation in solution. The same analysis of the braziliantoxin-III structure indicated that this protein does not dimerize in solution and probably acts as a monomer in vivo, similar to other snake-venom Asp49-phospholipases A2.

Crystal structure of Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

Abstract Background Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) (EC 2.4.2.8) is a central enzyme in the purine recycling pathway. Parasitic protozoa of the order Kinetoplastida cannot synthesize purines de novo and use the salvage pathway to synthesize purine bases, making this an attractive target for antiparasitic drug design. Results The glycosomal HGPRT from Leishmania tarentolae in a catalytically active form purified and co-crystallized with a guanosine monophosphate (GMP) in the active site. The dimeric structure of HGPRT has been solved by molecular replacement and refined against data extending to 2.1 Å resolution. The structure reveals the contacts of the active site residues with GMP. Conclusion Comparative analysis of the active sites of Leishmania and human HGPRT revealed subtle differences in the position of the ligand and its interaction with the active site residues, which could be responsible for the different reactivities of the enzymes to allopurinol reported in the literature. The solution and analysis of the structure of Leishmania HGPRT may contribute to further investigations leading to a full understanding of this important enzyme family in protozoan parasites.

Staphylococcus aureus thiaminase II: oligomerization warrants proteolytic protection against serine proteases

Staphylococcus aureus TenA (SaTenA) is a thiaminase type II enzyme that catalyzes the deamination of aminopyrimidine, as well as the cleavage of thiamine into 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine (HMP) and 5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazole (THZ), within thiamine (vitamin B1) metabolism. Further, by analogy with studies of Bacillus subtilis TenA, SaTenA may act as a regulator controlling the secretion of extracellular proteases such as the subtilisin type of enzymes in bacteria. Thiamine biosynthesis has been identified as a potential drug target of the multi-resistant pathogen S. aureus and therefore all enzymes involved in the S. aureus thiamine pathway are presently being investigated in detail. Here, the structure of SaTenA, determined by molecular replacement and refined at 2.7 A ° resolution to an R factor of 21.6% with one homotetramer in the asymmetric unit in the orthorhombic space group P212121, is presented. The tetrameric state of wild-type (WT) SaTenA was postulated to be the functional biological unit and was confirmed by small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments in solution. To obtain insights into structural and functional features of the oligomeric SaTenA, comparative kinetic investigations as well as experiments analyzing the structural stability of the WT SaTenA tetramer versus a monomeric SaTenA mutant were performed.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.

Die Kristallstruktur zweier Atmungsproteine: das Hämoglobin des Meerschweinchens und das 24-mere Hämocyanin des Kaiserskorpions

Im Verlauf der vorgestellten Arbeit konnten die Kristallstrukturen zweier Atmungsproteine gelöst werden. Da diese Strukturen mit verschiedenen Auflösungen gelöst wurden, wurden für die beiden Modelle unterschiedliche Methoden verwendet.rnrnDie Kristalle des Hämoglobins des Meerschweinchens Cavia porcellus erlaubten eine Messung von Streureflexen bis zu einer Auflösung von 1.7 Ǻ. Damit konnten das Molecular Replacement und das folgende Refinement mit geringen Vorgaben durchgeführt werden.rnAnhand der ermittelten Struktur konnte gezeigt werden, dass die Höhenadaptation des Hämoglobins des Meerschweinchens auf einer Stabilisierung des R2-Zustandes und einer gleichzeitigen Destabilisierung des T-Zustandes beruht. Die zu Grunde liegenden Aminosäureaustausche konnten identifiziert und der resultierende Mechanismus postuliert werden. Die Durchführung von Mutagenese-Experimenten am Hämoglobin des Meerschweinchens könnte die vorgestellte Hypothese bestätigen.rnrnDie Kristallstruktur des 24-meren Hämocyanins aus Pandinus imperator konnte durch eine Kombination von Röntgenkristallographie und Homologiemodellierung mit einer Auflösung von 6.5 Ǻ gelöst werden. Allerdings wäre die Bestimmung der Phasen durch Molecular Replacement ohne die vor kurzem publizierte Kryo-EM Struktur nicht möglich gewesen [Cong et al., 2009].rnDamit ist es durch die Kombination verschiedener Methoden erstmalig gelungen die Struktur eines Hämocyanins dieser Größe (Mw = 1.7 MDa) zu lösen. Die Auflösung von 6.5 Ǻ, eine für die Kristallographie relativ geringe Auflösung, erlaubte die Bestimmung des Cα-Traces des Proteins mit hoher Genauigkeit.rnDurch die Kristallstruktur konnte das zu Grunde liegende Kryo-EM Modell aus [Cong et al., 2009] bestätigt werden. Insbesondere die Position der α-Helices konnte mittels Kristallographie mit einer höheren Genauigkeit bestimmt werden. Durch die Verwendung von OMIT-Maps wurde sichergestellt, dass die Struktur nicht "kopiert" wurde. Die Übereinstimmung ist deshalb auf die Struktur des Hämocyanins im gemessenen Kristall zurückzuführen, nicht auf einen Bias bei der Auswertung.rnAnhand der Kristallstruktur konnten für die Kooperativität im Trimer potentiell entscheidende Aminosäuren identifiziert werden. Diese Aminosäuren könnten im Vergleich zur bekannten trimeren Struktur aus Limulus polyphemus zur Ausbildung zusätzlicher Bindungen zwischen den Untereinheiten führen. Diese Bindungen könnten eine wichtige Rolle beim Konformationsübergang zwischen dem T- und R-Zustand spielen.rn

Substrate-induced conformational change in a trimeric ornithine transcarbamoylase

The crystal structure of Escherichia coli ornithine transcarbamoylase (OTCase, EC 2.1.3.3) complexed with the bisubstrate analog N-(phosphonacetyl)-l-ornithine (PALO) has been determined at 2.8-Å resolution. This research on the structure of a transcarbamoylase catalytic trimer with a substrate analog bound provides new insights into the linkages between substrate binding, protein–protein interactions, and conformational change. The structure was solved by molecular replacement with the Pseudomonas aeruginosa catabolic OTCase catalytic trimer (Villeret, V., Tricot, C., Stalon, V. & Dideberg, O. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10762–10766; Protein Data Bank reference pdb 1otc) as the model and refined to a crystallographic R value of 21.3%. Each polypeptide chain folds into two domains, a carbamoyl phosphate binding domain and an l-ornithine binding domain. The bound inhibitor interacts with the side chains and/or backbone atoms of Lys-53, Ser-55, Thr-56, Arg-57, Thr-58, Arg-106, His-133, Asn-167, Asp-231, Met-236, Leu-274, Arg-319 as well as Gln-82 and Lys-86 from an adjacent chain. Comparison with the unligated P. aeruginosa catabolic OTCase structure indicates that binding of the substrate analog results in closure of the two domains of each chain. As in E. coli aspartate transcarbamoylase, the 240s loop undergoes the largest conformational change upon substrate binding. The clinical implications for human OTCase deficiency are discussed.

Structure at 2.7 Å resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome c oxidase complexed with an antibody FV fragment

The aa3 type cytochrome c oxidase consisting of the core subunits I and II only was isolated from the soil bacterium Paracoccus denitrificans and crystallized as complex with a monoclonal antibody Fv fragment. Crystals could be grown in the presence of a number of different nonionic detergents. However, only undecyl-β-d-maltoside and cyclohexyl-hexyl-β-d-maltoside yielded well-ordered crystals suitable for high resolution x-ray crystallographic studies. The crystals belong to space group P212121 and diffract x-rays to at least 2.5 Å (1 Å = 0.1 nm) resolution using synchrotron radiation. The structure was determined to a resolution of 2.7 Å using molecular replacement and refined to a crystallographic R-factor of 20.5% (Rfree = 25.9%). The refined model includes subunits I and II and the 2 chains of the Fv fragment, 2 heme A molecules, 3 copper atoms, and 1 Mg/Mn atom, a new metal (Ca) binding site, 52 tentatively identified water molecules, and 9 detergent molecules. Only four of the water molecules are located in the cytoplasmic half of cytochrome c oxidase. Most of them are near the interface of subunits I and II. Several waters form a hydrogen-bonded cluster, including the heme propionates and the Mg/Mn binding site. The Fv fragment binds to the periplasmic polar domain of subunit II and is critically involved in the formation of the crystal lattice. The crystallization procedure is well reproducible and will allow for the analysis of the structures of mechanistically interesting mutant cytochrome c oxidases.

The crystal structure of human interferon β at 2.2-Å resolution

Type I interferons (IFNs) are helical cytokines that have diverse biological activities despite the fact that they appear to interact with the same receptor system. To achieve a better understanding of the structural basis for the different activities of α and β IFNs, we have determined the crystal structure of glycosylated human IFN-β at 2.2-Å resolution by molecular replacement. The molecule adopts a fold similar to that of the previously determined structures of murine IFN-β and human IFN-α2b but displays several distinct structural features. Like human IFN-α2b, human IFN-β contains a zinc-binding site at the interface of the two molecules in the asymmetric unit, raising the question of functional relevance for IFN-β dimers. However, unlike the human IFN-α2b dimer, in which homologous surfaces form the interface, human IFN-β dimerizes with contact surfaces from opposite sides of the molecule. The relevance of the structure to the effects of point mutations in IFN-β at specific exposed residues is discussed. A potential role of ligand–ligand interactions in the conformational assembly of IFN receptor components is discussed.