Produção de conídios do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em diferentes condições de cultivo e em biorreator de bandeja

Pós-graduação em Microbiologia - IBILCE

Produção de conídios do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em diferentes condições de cultivo e em biorreator de bandeja

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Pathogenicity of Metarhizium anisopliae towards Rhipicephalus (Boophilus) microplus under laboratory and field conditions

Metarhizium anisopliae is one of the most studied agents of biological control of several arthropod plagues, including the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Studies have been conducted to assess the fungal complex infection process towards its hosts. To accomplish that, mutant strains overexpressing or lacking assumed determinant genes for the process were constructed over the years. A fundamental experiment to demonstrate a particular gene or set of genes participation is the bioassay. The comparison of bioassays using wild and engineered strains is an essential tool to affirm a given gene is crucial in the process. Therefore, the in vitro bioassays should mimic the results obtained in tests under field conditions. In this study, tests under laboratory and filed conditions were done and a correlation analysis was performed in order to statistically validate in vitro bioassays. Tick egg laying, larvae hatching and host mortality were recorded in each experiment through 21 days, both under laboratory and field conditions. In all cases, M. anisopliae treatments were statistically different from the control treatments. A linear regression analysis was performed between the cases. Laboratory results showed a statistically significant correlation with the field conditions using the Pearson's Correlation Test (P < 0.01 host mortality - 0.969, tick egg laying - 0.977 and larvae hatching - 0.956). These results legitimize the in vitro bioassays and, therefore, constitute them as a valid tool for studying this fungus behavior, so they can be used to infer M. anisopliae response towards R. (Boophilus) microplus.

Characterization of a new toxin from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae: the ribotoxin anisoplin

Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus relevant in biotechnology with applications like malaria vector control. Studies of its virulence factors are therefore of great interest. Fungal ribotoxins are toxic ribonucleases with extraordinary efficiency against target ribosomes and suggested as potential insecticides. Here, we describe this ribotoxin characteristic activity in M. anisopliae cultures. Anisoplin has been obtained as a recombinant protein and further characterized. It is structurally similar to hirsutellin A, the ribotoxin from the entomopathogen Hirsutella thompsonii. Moreover, anisoplin shows the ribonucleolytic activity typical of ribotoxins and cytotoxicity against insect cells. How Metarhizium uses this toxin and possible applications are on perspective.

Inoculaci?n y establecimiento endof?tico de cepas de los hongos entomopat?genos beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae y lecanicillium lecanii en plantas de fr?jol (Phaseolus vulgaris) [recurso electr?nico]

Los hongos end?fitos han recibido una creciente atenci?n en los a?os recientes, ya que han demostrado tener un potencial econ?mico en la agronom?a, debido a su posible uso como agentes de control biol?gico. El establecimiento endof?tico de hongos entomopat?genos en cultivos de inter?s, ofrece un campo amplio y prometedor para comprender las relaciones entre plantas y hongos y los mecanismos de defensa que estos ?ltimos pueden inducir en las plantas. El presente estudio busc? inocular y evaluar la colonizaci?n endof?tica de tres especies de hongos entomopat?genos en plantas de fr?jol (Phaseolus vulgaris). Para ello, se emplearon dos cepas de cada especie, una comercial y la otra de la colecci?n de entomopat?genos del Centro Internacional de Agricultura Tropical; cada cepa constituy? un tratamiento individual. A partir de la siembra y desarrollo de las cepas, se generaron in?culos de 108 conidios/mL que fueron inoculados en las plantas de fr?jol Diacol, variedad Calima. Se encontr? que Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae y Lecanicillium lecanii colonizaron individualmente las hojas de fr?jol. Los porcentajes de colonizaci?n promedio para las cepas de la colecci?n del CIAT fueron de 16% (?= 18,84) para B. bassiana, 13% (?= 4,96) en M. anisopliae y 4% (?= 4,64) para L. lecanii. Con respecto a las cepas comerciales, estos valores fueron 4% (?= 4,64) para B. bassiana; 26% (?= 32) para M. anisopliae y 44% (?= 13,02) para L. lecanii. Todas las cepas de hongos inoculadas pudieron ser recuperadas de tejido vegetal, lo que sugiere su posible uso como agentes de control biol?gico al menos para el cultivo del fr?jol.

Produção e caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais

Chitosan is a natural polymer, biodegradable, nontoxic, high molecular weight derived from marine animals, insects and microorganisms. Oligomers of glucosamine (GlcN) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) have interesting biological activities, including antitumor effects, antimicrobial activity, antioxidant and others. The alternative proposed by this work was to study the viability of producing chitooligosaccharides using a crude enzymes extract produced by the fungus Metarhizium anisopliae. Hydrolysis of chitosan was carried out at different times, from 10 to 60 minutes to produce chitooligosaccharides with detection and quantification performed by High Performace Liquid Chromatography (HPLC). The evaluation of cytotoxicity of chitosan oligomers was carried out in tumor cells (HepG2 and HeLa) and non-tumor (3T3). The cells were treated for 72 hours with the oligomers and cell viability investigated using the method of MTT. The production of chitosan oligomers was higher for 10 minutes of hydrolysis, with pentamers concentration of 0.15 mg/mL, but the hexamers, the molecules showing greater interest in biological properties, were observed only with 30 minutes of hydrolysis with a concentration of 0.004 mg/mL. A study to evaluate the biological activities of COS including cytotoxicity in tumor and normal cells and various tests in vitro antioxidant activity of pure chitosan oligomers and the mixture of oligomers produced by the crude enzyme was performed. Moreover, the compound with the highest cytotoxicity among the oligomers was pure glucosamine, with IC50 values of 0.30; 0.49; 0.44 mg/mL for HepG2 cells, HeLa and 3T3, respectively. Superoxide anion scavenging was the mainly antioxidant activity showed by the COS and oligomers. This activity was also depending on the oligomer composition in the chitosan hydrolysates. The oligomers produced by hydrolysis for 20 minutes was analyzed for the ability to inhibit tumor cells showing inhibition of proliferation only in HeLa cells, did not show any effect in HepG2 cells and fibroblast cells (3T3)

Efeito do fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. (Deuteromycetes) para Astyanax scabripinnis (Jenyns, 1842) (Pisces: Characidae).

Avaliou-se o efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch.) para Astyanax scabripinnis (Jenyns, 1842)(Pisces, Characidae), em condições de laboratório. Suspensões aquosas de conídios recémproduzidos, viáveis (viabilidade mínima 90%) e inviabilizados por meio de autoclavagem (121º C, 20 minutos, a 1 atm), na concentração de 6,5 x 1010 conídios/aquário (equivalente a 5 x 1015 conídios/ ha, que representa 1.000 vezes a concentração recomendada para o controle de cigarrinhas de pastagens, principal praga-alvo deste entomopatógeno no Brasil), foram aplicadas em aquários contendo A. scabripinnis. Foram analisadas amostras de água e dos peixes, dos quais foram dissecados as brânquias e o estômago, em diferentes intervalos de tempo, a fim de se avaliar a presença dos conídios. Observaram-se diariamente o comportamento e a mortalidade de peixes em ambos os tratamentos. Avaliou-se nos peixes sobreviventes a morfologia das células das brânquias e do fígado. Verificou-se que nas brânquias não houve alteração no número de conídios ao longo de 16 dias de contato, sendo que no estômago houve um ligeiro acréscimo inicial seguido de redução constante. A viabilidade dos conídios em todos os locais avaliados decresceu após 24 horas da aplicação. Constatou-se que não houve morte ou quaisquer alterações comportamentais após 30 dias de contato, indicando a ausência de efeitos adversos associados à capacidade do fungo em provocar infecção ou exercer efeitos tóxicos em ambos os organismos-teste.

Characterization of a new toxin from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae: the ribotoxin anisoplin

Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus relevant in biotechnology with applications like malaria vector control. Studies of its virulence factors are therefore of great interest. Fungal ribotoxins are toxic ribonucleases with extraordinary efficiency against target ribosomes and suggested as potential insecticides. Here, we describe this ribotoxin characteristic activity in M. anisopliae cultures. Anisoplin has been obtained as a recombinant protein and further characterized. It is structurally similar to hirsutellin A, the ribotoxin from the entomopathogen Hirsutella thompsonii. Moreover, anisoplin shows the ribonucleolytic activity typical of ribotoxins and cytotoxicity against insect cells. How Metarhizium uses this toxin and possible applications are on perspective.

Control microbial del picudo negro Cosmopolites sordidus, (Germar, 1824) usando hongos entomopatógenos Beauveria bassiana (Bals vuill) y Metarhizum anisopliae (Metsch sorokin) en el cultivo de plátano

El presente estudio se llevó a cabo desde Julio de 1996 a Marzo de 1997, con el objetivo de determinar el efecto de las aplicaciones de Beauveria bassíana (Bals) vuill y Metarhízíum anisopliae (Metsch) sorokin en diferentes momentos sobre la dinámica poblacional de picudo negro, Cosmopolites sordídus (Germar 1824) dichos hongos fueron aplicados en suspención acuosa y en trampas de pseudotallos de plátano, variedad "Cuerno". Los tratamientos evaluados fueron: 1) aplicación de Beauveria bassiana:. 2) aplicación con Metarhizium anisopliae: 3) Trampas+ aplicación de B. bassiana: 4) trampas+ aplicación de M. anisopliae: 5) Control físico. Eliminación manual de las poblaciones de adultos de picudo capturado por medio de trampas. 6) Testigo. No se realizó ningún tipo de control especial. En los resultados obtenidos se determinó que no hay diferencias estadísticas significativas entra los tratamientos aplicados Al mismo tiempo se determinó que los tratamientos evaluados no redujeron el número de picudo negro y el nivel de daño presente en la plantación. Se logró determinar que la plantación esta siendo afectada por C. Sordidus asociado con nemátodos ; los que debilitan la planta provocando mayor caída de las misma.

Efeito de beauveria bassiana (bals.) Vuillemin eMetarhizium anisopliae (metsch.) sorokin nos parâmetros biológicos de trichogramma atopovirilia oatman & platner, 1983 (hymenoptera: trichogrammatidae)

Two bioassays were performed to evaluate the effect of two biopesticides based on Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin and Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin on the biological parameters of Trichogramma atopovirilia Oatman & Platner, 1983. In the first one, displays with S. frugiperda, 1797 eggs were dropped into the biopesticide suspension and offered to the parasitoid females for 24 hours. In the second one, parasitoid females were fed with a suspension containing honey and biopesticide suspension. In both cases, after the parasitoid death they were mantained into a humid chamber to observe fungus sporulation. The experiments were maintained in a climatized chamber at 25 +/- 1 degrees C, RH 70 +/- 10%, and photophase of 14 hours. The longevity and adult mortality, total parasitism, progeny emergency, number of individuals per egg and sexual ratio were analyzed. The biopesticides did not affect the evaluated parameters and no fungus sporulation was observed in dead females. It is possible to assert that the entomopathogenic fungi B. bassiana and M. anisopliae can be used with T. atopovirilia in IPM S. frugiperda systems.

Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by Mertarhizium anisopliae as revealed by scanning eletron microscopy and histopathology

O presente trabalho teve como objetivo verificar a forma de penetração do fungo Metarhizium anisopliae em ovos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, assim como as lesões infringidas no interior do ovo. A aderência e penetração do fungo foram estudadas por meio da microscopia eletrônica de varredura e a ação do fungo nos tecidos internos avaliada em secções histológicas convencionais. Para observação destes eventos, realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos de ovos do R. sanguineus contendo 25 mg cada. Os ovos foram banhados durante 3 minutos, sob agitação manual, em suspensão com concentração de 10(8) conídios/mL. Nos grupos controle o banho foi realizado apenas no veículo da suspensão. Os ovos foram processados para análise histopatológica e microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: 1 e 18h, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e onze dias. Observou-se grande germinação de conídios em 67% dos ovos 18h após a inoculação e o fungo penetrou em 92,6% dos ovos 5 dias após a infecção. A extrusão do patógeno ocorreu em 87% dos ovos 7 dias após a infecção, chegando a 100% no 9º dia. Nas análises histopatológicas não foram observadas lesões dignas de nota, porem deve-se ressaltar que houve significativa redução (53,9%) na eclosão a partir dos ovos infectados.

Evaluación de hongos entomopatogenos sobre plagas claves en el cultivo del arroz (Julio a octubre del 2000)

Con el objetivo de evaluar el efecto de tres cepas de hongos entomopatógenos formuladas en polvo y aceite, sobre las poblaciones del chinche de la espiga del arroz Oebalus insularis (Stal), la novia del arroz Rupela albinella (Cramer) y el saltamonte Conocephalus sp se realizó un experimento en condiciones de campo y laboratorio durante Agosto a Diciembre del 2000. A nivel de laboratorio se evaluaron las cepas 38, 64, 114 y 121 de Beauveria bassiana (Bals), sobre la mortalidad del chinche, las cepas evaluadas a nivel de campo fueron 114 y 121 también de Beauveria bassiana(Bals) y la cepa Niña bonita de Metarhizium anisopliae (Metch); se evaluó además la mezcla de las cepas Ma-NB más Bb-121, comparadas con una parcela sin aplicación de hongos y uso de Metamidofos. Se utilizó el umbral de 0.6 chinches en 10 redadas para realizar las aplicaciones, los muestreos se realizaron cada se mana, iniciando antes de la floración hasta finalizar el período de protección de espiga. Se seleccionaron cinco sitios al azar en cada tratamiento y se registró el número de plagas capturadas. Se inició con una aplicación preventiva del hongo, cuando se observó entre el 5 y 10% de floración, posteriormente fueron aplicados cuando se alcanzó el umbral de daño. Los resultados obtenidos indican que los tratamientos tuvieron un comportamiento similar, se encontró diferencias significativas entre las poblaciones de plagas en las fechas de muestreo (P:0.0001); sin embargo, se pudo observar que las cepas Ma-N B y Bb-114 formuladas en polvo iniciaron con la mayor población y al final del ciclo la incidencia de la plagas en dichas parcelas fue un poco menor que en las demás. En cambio los tratamientos Ma-NB + Bb-121 y Bb-114 formuladas en aceite presentaron poblaciones de la plaga ligeramente mayores que los demás tratamientos. Las cepas Bb-114 y Ma-NB, así como la mezcla de ambas, formuladas en polvo, en concentraciones de 10 12 conidias/ml son promisorias para el manejo de las plagas objeto de estudio. A nivel de laboratorio las cepas que se comportaron mejor fueron la 64 y 114 de Beauveria bassiana.

Uso de hongos entomopatogenos para el control de mosca blanca (Bemisia tabaci) en diferentes especies de plantas hospederas bajo condiciones de invernadero

El objetivo de esta investigación fue evaluar la influencia de diferentes cepas de hongos entomopatógenos para el control de mosca blanca en diferentes especies de plantas hospederas. El estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria entre los meses de Octubre 2010 a Febrero 2011. Los tratamientos consistieron en cuatro especies de plantas: Tomate ( Solanum lycopersicum L) , Frijol (Phaseolus vulgaris L ) , Pipián (Cucurbita mixta) y Berenjena (Solanum melongena). Los hongos entomopatógenos utilizados en el estudio fueron: Paecilomyces fumosoroseus, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado, con cuatro tratamientos y cuatro repeticiones. Realizando un experimento con cada una de las cepas de hongos evaluados. Cada planta fue infestada con 15 parejas de adultos de mosca blanca, obtenidas de una cría de mosca blanca en plantas de frijol. Cuando las ninfas alcanzaron el estado ninfa III, se procedió a la inoculación de los hongos. Para cada especie de planta se utilizó un testigo el que fue tratado con agua destilada. Los muestreos se realizaron cada 48 horas, iniciando 96 horas después de la aplicación de los hongos ento mopatógenos. Las variables evaluadas fueron: Número de huevos, número de ninfas, número de ninfas muertas y número de adultos emergidos. Las ninfas muertas se colocaron en cámara húmeda para propiciar el crecimiento del hongo, para su debida identificación. Se en contraron diferencias significativas entre tratamientos y también hubo diferencias significativas entre fechas de muestreo. En general en las plantas de tomate se observó mayor mortalidad de ninfas. En plantas de tomate y frijol la mayor mortalidad de ninfas de B. tabaci fue causada por Metarhizium anisopliae cepa – NB. En plantas de Berenjena y Pipián Paecilomyces fumosoroseus cepa–Nic fue el que causó la mayor mortalidad de ninfas.Los tratamientos testigos Tomate, Frijol y Berenjena presentaron la menor mortalidad de ninfas. El mayor número de adultos emergidos se observó en el tratamiento Berenjena testigo y el menor número de adultos emergidos se presentó en tratamiento Pipián tratado con Beauveria bassiana cepa 114.

Insecticidas botánicos y biológicos en el manejo del chinche patas de hoja (Leptoglossus zonatus, Dallas. Hemíptera: Coreidae) y la mosquita negra (trigona silvestrianum, Vachall, Himenóptera: Apidae) y su efecto sobre los enemigos naturales. Cultivo de Marañon (Anacardium occidentale L.), León, Nicaragua

El chinche patas de hoja (Leptoglossus zonatus Dallas) y la mosquita negra (Trigona silvestrianun,Vachal) han provocado severos problemas fitosanitarios y económicos para los productores de marañón (Anacardium occidentale L) en el occidente de Nicaragua (León y Chinandega). Estas plagas han provocado grandes e importantes pérdidas significativas en el rendimiento y calidad, además como resultado, se han aumentado los costos de producción en este cultivo. Ante la problemática existente en estas zonas y con el propósito de encontrar una solución al problema, se realizó un estudio en la comarca Chacraseca del departamento de León, en el periodo comprendido entre febrero 2009 a mayo 2010, con el objetivo de evaluar cuatro alternativas botánicas y una biológica para el manejo del chinche patas de hoja y la mosquita negra. Las alternativas evaluadas fueron: chile + ajo + jabón, cebolla + crisantemo, chile + ajo, Metarhizium anisopliae,chile + jabón y un testigo (agua). Las variables evaluadas fueron: número de chinches por árbol y número de mosquita negra por árbol, también se evaluó el rendimiento en kg/ha a través de un análisis económico de presupuesto parcial. Para decidir el momento de aplicación de los productos se realizaron muestreos semanales tomando como nivel crítico un chinche o mosquita negra por árbol. Los resultados obtenidos en este estudio indican que el tratamiento chile + ajo + jabón fue el que presentó la menor fluctuación poblacional del chinche patas de hoja y mosquita negra, seguido por el tratamiento chile +ajo. El análisis económico basado en un presupuesto parcial determinó que el tratamiento chile + ajo + Jabón fue el que presentó los mejores rendimientos, los menores costos variables y el mayor beneficio neto, la tasa de retorno marginal resultó que en el tratamiento chile + jabón se obtiene por cada dólar invertido, una ganancia de 40 centavos de dólar.

Manejo del complejo plagas raspadores chupadores ácaro blanco (Polyphagotarsonemus latus, Bank) y trips (Frankliniella occidentalis, Pergande.) en chiltoma (Capsicum annum L.) en campo abierto, Managua, Nicaragua 2014

El ácaro blanco ( Polyphagotarsonemus latus, Bank ) y Trips ( Frankliniella occidentalis , Pergande ) se han convertido en problemas fitosanitarios importantes en el cultivo de Chiltoma ( Capsicum annuum , L.), e stas plagas han provocado importantes pérdidas e conómicas, disminuyendo así la calidad de los frutos y aumentando los costos de producción. Se realizó un e studio entre los meses de octubre del 2014 y enero del 2015 en la finca el plantel de la Universidad Nacional Agraria, con el propósito de encontrar alternativas que den solución al problema. Se utilizó un diseño bifactorial en parcelas divididas con un arreglo en BCA. El factor cobertura plástica mulch con dos niveles (con y sin cobert ura) y el factor tipo de manejo con cuatro niveles (Químico sintético, Entomopatógenos , Químico sintético + Entomopatógenos y testigo) para un total de ocho tratamientos con tres repeticiones. Se evaluó el uso de plástico mulch en la parcela grande y el tipo de manejo en la parcela pequeña. El tipo de manejo Químico sintético (Spiromesifen, Imidacloprid, Spinosad, Muralla delt a y Abamectina), manejo Entomopatógenos ( Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae ) y un manejo con productos Químico sintético + Entomopatógenos . Los resultados demostraron diferencias significativas en la interacción de los tratamientos para la variab le número de ácaros por planta . De acuerdo a la prueba de Tuckey aplicada para el factor manejo , los tratamientos evaluados se ubican en la misma categoría estadística a excepción del testigo . Los mismos factores y sus respectivos niveles evaluados , no t uvieron efecto sobre la variable número de Trips por planta. En el análisis de rendimiento mostró diferencias significativas en el factor cobertura ( α= 0.00013336 ) ; el uso de plástico mulch obtuvo mayor rendimiento con 7,405 kg/ha . Segú n la tasa de retorno marginal , el tratamiento más rentable fue con cobertura testigo ya que presentó una ta sa de retorno marginal de 743.82 %