Agouti regulation of intracellular calcium: role in the insulin resistance of viable yellow mice.

Several dominant mutations at the agouti locus in the mouse cause a syndrome of marked obesity, hyperinsulinemia, and insulin resistance. Although it is known that the agouti gene is expressed in an ectopic manner in these mutants, the precise mechanism by which the agouti gene product mediates these effects is unclear. Since intracellular Ca2+ is believed to play a role in mediating insulin action and dysregulation of Ca2+ flux is observed in diabetic animals and humans, we examined the status of intracellular Ca2+ in mice carrying the dominant agouti allele, viable yellow (Avy). We show here that in mice carrying this mutation, the intracellular free calcium concentration ([Ca2+]i) is elevated in skeletal muscle, and the degree of elevation is closely correlated with the degree to which the mutant traits are expressed in individual animals. Moreover, we demonstrate that the agouti gene product is capable of inducing increased [Ca2+]i in cultured and freshly isolated skeletal muscle myocytes from wild-type mice. Based on these findings, we present a model in which we propose that the agouti polypeptide promotes insulin resistance in mutant animals through its ability to increase [Ca2+]i.

The subcellular fractionation properties and function of insulin receptor substrate-1 (IRS-1) are independent of cytoskeletal integrity

Efficient insulin action requires spatial and temporal coordination of signaling cascades. The prototypical insulin receptor substrate, IRS-1 plays a central role in insulin signaling. By subcellular fractionation IRS-1 is enriched in a particulate fraction, termed the high speed pellet (HSP), and its redistribution from this fraction is associated with signal attenuation and insulin resistance. Anecdotal evidence suggests the cytoskeleton may underpin the localization of IRS-1 to the HSP. In the present study we have taken a systematic approach to examine whether the cytoskeleton contributes to the subcellular fractionation properties and function of IRS-1. By standard microscopy or immunoprecipitation we were unable to detect evidence to support a specific interaction between IRS-1 and the major cytoskeletal components actin (microfilaments), vimentin (intermediate filaments), and tubulin (microtubules) in 3T3-L1 adipocytes or in CHO.IR.IRS-1 cells. Pharmacological disruption of microfilaments and microtubules, individually or in combination, was without effect on the subcellular distribution of IRS-1 or insulin-stimulated tyrosine phosphorylation in either cell type. Phosphorylation of Akt was modestly reduced (20-35%) in 3T3-L1 adipocytes but not in CHO.IR.IRS-1 cells. In cells lacking intermediate filaments (Vim(-/-)) IRS-1 expression, distribution and insulin-stimulated phosphorylation appeared normal. Even after depolymerisation of microfilaments and microtubules, insulin-stimulated phosphorylation of IRS-1 and Akt were maintained in Vim-/- cells. Taken together these data indicate that the characteristic subcellular fractionation properties and function of IRS-1 are unlikely to be mediated by cytoskeletal networks and that proximal insulin signaling does not require an intact cytoskeleton. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

The role of insulin and the insulin-like growth factors in the proliferation of the rat thymic lymphocyte

Concanavalin A, provoked a 35-fold increase in the rate of proliferation of rat thymocytes. Insulin (10-6M), and insulin-like growth factor I (10-10M) approximately doubled the rate of DNA synthesis. Both of these structurally related molecules acted through the type I insulin-like growth factor receptor. The sequential addition of Concanavalin A and insulin, promoted a much greater proliferative response than to either of the two agonists alone. Insulin also increased the uptake of glucose and amino acids by the cells. Glucose uptake was enhanced at insulin concentrations of 10-6M and 10-10M. Amino acid uptake was more strongly affected at the higher concentration. Insulin-like growth factor I (10-11M) also enhanced amino acid uptake. The effects of insulin on metabolism were mediated by both insulin and type I insulin-like growth factor receptors. These effects were greatly enhanced after a pre-treatment with Concanavalin A. Concanavalin A provided a primary mitogenic signal to the cells. Amongst the responses was an increased expression of insulin and/or type I insulin-like growth factor receptors. The consequent enhanced cellular sensitivity to these agonists, enabled them to facilitate the passage of the cells through the cell cycle by: i) providing a secondary mitogenic signal, and ii) promoting the uptake of raw materials and energy substrates. The initiation of DNA synthesis and passage through the cell cycle was thus punctuated by the sequential expression of various cell surface receptors. This regulated cellular sensitivity, enabling them to react in a precisely orchestrated fashion to hormones and other molecules in their environment. The intracellular mechanism of insulin action remains an enigma. Although the presence of extracellular calcium was essential for insulin stimulation of amino acid uptake and DNA synthesis, the cation did not subserve a direct mediator function. Insulin promoted an increase in intracellular pH, which was mediated by the Na+/H+ antiport. Other mechanisms were probably also involved in mediating the full cellular response to insulin.

Molecular markers of obesity and diabetes

Recently it has been shown that the consumption of a diet high in saturated fat is associated with impaired insulin sensitivity and increased incidence of type 2 diabetes. In contrast, diets that are high in monounsaturated fatty acids (MUFAs) or polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially very long chain n-3 fatty acids (FAs), are protective against disease. However, the molecular mechanisms by which saturated FAs induce the insulin resistance and hyperglycaemia associated with metabolic syndrome and type 2 diabetes are not clearly defined. It is possible that saturated FAs may act through alternative mechanisms compared to MUFA and PUFA to regulate of hepatic gene expression and metabolism. It is proposed that, like MUFA and PUFA, saturated FAs regulate the transcription of target genes. To test this hypothesis, hepatic gene expression analysis was undertaken in a human hepatoma cell line, Huh-7, after exposure to the saturated FA, palmitate. These experiments showed that palmitate is an effective regulator of gene expression for a wide variety of genes. A total of 162 genes were differentially expressed in response to palmitate. These changes not only affected the expression of genes related to nutrient transport and metabolism, they also extend to other cellular functions including, cytoskeletal architecture, cell growth, protein synthesis and oxidative stress response. In addition, this thesis has shown that palmitate exposure altered the expression patterns of several genes that have previously been identified in the literature as markers of risk of disease development, including CVD, hypertension, obesity and type 2 diabetes. The altered gene expression patterns associated with an increased risk of disease include apolipoprotein-B100 (apo-B100), apo-CIII, plasminogen activator inhibitor 1, insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor binding protein 3. This thesis reports the first observation that palmitate directly signals in cultured human hepatocytes to regulate expression of genes involved in energy metabolism as well as other important genes. Prolonged exposure to long-chain saturated FAs reduces glucose phosphorylation and glycogen synthesis in the liver. Decreased glucose metabolism leads to elevated rates of lipolysis, resulting in increased release of free FAs. Free FAs have a negative effect on insulin action on the liver, which in turn results in increased gluconeogenesis and systemic dyslipidaemia. It has been postulated that disruption of glucose transport and insulin secretion by prolonged excessive FA availability might be a non-genetic factor that has contributed to the staggering rise in prevalence of type 2 diabetes. As glucokinase (GK) is a key regulatory enzyme of hepatic glucose metabolism, changes in its activity may alter flux through the glycolytic and de novo lipogenic pathways and result in hyperglycaemia and ultimately insulin resistance. This thesis investigated the effects of saturated FA on the promoter activity of the glycolytic enzyme, GK, and various transcription factors that may influence the regulation of GK gene expression. These experiments have shown that the saturated FA, palmitate, is capable of decreasing GK promoter activity. In addition, quantitative real-time PCR has shown that palmitate incubation may also regulate GK gene expression through a known FA sensitive transcription factor, sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c), which upregulates GK transcription. To parallel the investigations into the mechanisms of FA molecular signalling, further studies of the effect of FAs on metabolic pathway flux were performed. Although certain FAs reduce SREBP-1c transcription in vitro, it is unclear whether this will result in decreased GK activity in vivo where positive effectors of SREBP-1c such as insulin are also present. Under these conditions, it is uncertain if the inhibitory effects of FAs would be overcome by insulin. The effects of a combination of FAs, insulin and glucose on glucose phosphorylation and metabolism in cultured primary rat hepatocytes at concentrations that mimic those in the portal circulation after a meal was examined. It was found that total GK activity was unaffected by an increased concentration of insulin, but palmitate and eicosapentaenoic acid significantly lowered total GK activity in the presence of insulin. Despite the fact that total GK enzyme activity was reduced in response to FA incubation, GK enzyme translocation from the inactive, nuclear bound, to active, cytoplasmic state was unaffected. Interestingly, none of the FAs tested inhibited glucose phosphorylation or the rate of glycolysis when insulin is present. These results suggest that in the presence of insulin the levels of the active, unbound cytoplasmic GK are sufficient to buffer a slight decrease in GK enzyme activity and decreased promoter activity caused by FA exposure. Although a high fat diet has been associated with impaired hepatic glucose metabolism, there is no evidence from this thesis that FAs themselves directly modulate flux through the glycolytic pathway in isolated primary hepatocytes when insulin is also present. Therefore, although FA affected expression of a wide range of genes, including GK, this did not affect glycolytic flux in the presence of insulin. However, it may be possible that a saturated FA-induced decrease in GK enzyme activity when combined with the onset of insulin resistance may promote the dys-regulation of glucose homeostasis and the subsequent development of hyperglycaemia, metabolic syndrome and type 2 diabetes.

mTOR function in skeletal muscle : a focal point for overnutrition and exercise

The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a highly conserved atypical serine-threonine kinase that controls numerous functions essential for cell homeostasis and adaptation in mammalian cells via 2 distinct protein complex formations. Moreover, mTOR is a key regulatory protein in the insulin signalling cascade and has also been characterized as an insulin-independent nutrient sensor that may represent a critical mediator in obesity-related impairments of insulin action in skeletal muscle. Exercise characterizes a remedial modality that enhances mTOR activity and subsequently promotes beneficial metabolic adaptation in skeletal muscle. Thus, the metabolic effects of nutrients and exercise have the capacity to converge at the mTOR protein complexes and subsequently modify mTOR function. Accordingly, the aim of the present review is to highlight the role of mTOR in the regulation of insulin action in response to overnutrition and the capacity for exercise to enhance mTOR activity in skeletal muscle.

Dieta hiperlipídica materna, tecido adiposo, fígado, metabolismo de carboidratos e sinalização central de leptina na prole de camundongos C57BL/6

O consumo materno de dieta hiperlipídica saturada durante a gestação e lactação favorece o desenvolvimento obesidade e anormalidades metabólicas na prole. Este trabalho teve como objetivo testar a hipótese de que a prole proveniente de mães alimentadas com dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação desenvolve obesidade e anormalidades metabólicas e de que essas alterações estão associadas a resistência central a leptina. As ratas grávidas da linhagem C57BL/6 (n=20) foram alimentadas com dieta standard chow (SC; 19% de lipídeos) ou dieta hiperlipídica (HF; 49% de lipídeos) durante todo período de gestação e lactação. Após o desmame, a prole de machos foi dividida em quatro grupos experimentais, de acordo com a dieta das mães e da prole: SC(mães)/SC(prole), SC/HF, HF/SC e HF/HF (n=12/gp). As características metabólicas foram avaliadas pela curva de ganho de peso; medida da pressão arterial; glicose de jejum, área sob a curva no teste oral de tolerância a glicose; concentrações de triglicerídeos hepáticos e estimativa da esteatose hepática; análise plasmática de insulina e leptina e; distribuição e análise morfológica do tecido adiposo. Para analisar a sensibilidade a leptina, os quatro grupos originais foram subdivididos em dois grupos cada (veículo ou leptina-5g) para verificar a resposta alimentar (g) após o tratamento agudo intracerebroventricular (ICV) e a sinalização hipotalâmica de leptina. A dieta HF durante o período pós-desmame (grupo SC/HF), durante gestação e lactação (grupo HF/SC), ou ambos os períodos (grupo HF/HF), promoveu aumento da massa corporal. No que concerne as alterações hepáticas e a ação da insulina, a dieta HF durante o período perinatal favoreceu 25% de esteatose hepática, hiperinsulinemia e hiperleptinemia, enquanto os demais grupos experimentais SC/HF e HF/HF, demonstraram um padrão mais exacerbado. A avaliação da distribuição e morfometria do tecido adiposo demonstra o importante papel da dieta HF perinatal em amplificar a habilidade de estocar gordura visceral na prole. Considerando a ação central da leptina nos grupos tratados, a resposta alimentar mostrou-se atenuada em SC/HF, indicando o efeito determinante da dieta pós-desmame sobre a ação da leptina nesse modelo. Os resultados indicam fortemente que a dieta HF materna afeta a saúde da prole adulta. Especificamente, a prole programada apresenta esteatose hepática, hipertrofia de adipócitos, aumento de gordura visceral, hiperleptinemia e resistência a insulina. Esse fenótipo não está associado a resistência central a leptina na prole aos três meses de idade.

Bloqueadores do sistema renina-angiotensina em ilhotas pancreáticas e fígado na obesidade induzida por dieta em camundongos

As associações entre obesidade, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) são bem estabelecidas, e o sistema renina-angiotensina (SRA) pode proporcionar uma ligação entre eles. O bloqueio do SRA em diferentes níveis pode estar relacionado a respostas na resistência à insulina, remodelagem do pâncreas e do fígado em um modelo de obesidade induzida por dieta. Camundongos C57BL/6 foram alimentados com uma dieta hiperlipídica (HF) durante oito semanas e depois tratados com alisquireno (50 mg/kg/dia), enalapril (30 mg/kg/dia) ou losartana (10 mg/kg/dia) por um período adicional de seis semanas. As drogas foram incorporadas na dieta. Avaliou-se a massa corporal (MC), pressão arterial, consumo e gasto energético (GE), metabolismo da glicose e lipídico, histopatologia pancreática e hepática, análise hormonal, imunohistoquímica, perfil gênico e/ou proteico do SRA no pâncreas, gliconeogênese hepática, sinalização da insulina, oxidação e acúmulo lipídico. Todos os inibidores do SRA reduziram significativamente o aumento da pressão arterial nos camundongos alimentados com dieta HF. O tratamento com enalapril, mas não alisquireno ou losartana, reduziu o ganho de MC e a ingestão alimentar; aumentou o GE; amenizou a intolerância à glicose e resistência à insulina; melhorou a massa de células alfa e beta; impediu a redução da adiponectina plasmática e restaurou a sensibilidade à leptina. Além disso, o tratamento com enalapril melhorou a expressão proteica nas ilhotas pancreáticas de Pdx1, GLUT2, ECA2 e do receptor Mas. O tratamento com losartana apresentou uma elevação na expressão proteica de AT2R no pâncreas. No fígado, a administração de enalapril atenuou a esteatose hepática, o acúmulo de triglicerídeos e preveniu o aumento dos níveis de PEPCK, G6Pase e do GLUT2. Do mesmo modo, o enalapril melhorou a transdução dos sinais da insulina através da via IRS-1/Akt, bem como reduziu os níveis de expressão gênica e/ou proteica de PPAR-gama, SREBP-1c e FAS. Esses resultados sugerem que a inibição da ECA com enalapril atenuou muitos efeitos deletérios provocados pelo consumo da dieta HF, incluindo: normalização da morfologia e função das ilhotas pancreáticas, proteção contra a resistência à insulina e acúmulo de lipídios no fígado. Estes efeitos protetores do enalapril podem ser atribuídos, principalmente, à redução no ganho de MC e ingestão alimentar, aumento do GE, ativação do eixo ECA2/Ang(1-7)/receptor Mas e dos níveis de adiponectina, o que promove uma melhora na ação hepática da insulina e leptina, normalização da gliconeogênese, amenizando a NAFLD.

Effects of naringenin on glucose uptake in L6 skeletal muscle cells

Diabetes mellitus is a disorder of inadequate insulin action and consequent high blood glucose levels. Type 2 diabetes accounts for the majority of cases of the disease and is characterized by insulin resistance and relative insulin deficiency resulting in metabolic deregulation. It is a complex disorder to treat as its pathogenesis is not fully understood and involves a variety of defects including ~-cell failure, insulin resistance in the classic target tissues (adipose, muscle, liver), as well as defects in a-cells and kidney, brain, and gastrointestinal tissue. Present oral treatments, which aim at mimicking the effects of insulin, remain limited in their efficacy and therefore the study of the effects of novel compounds on insulin target tissues is an important area of research both for potentially finding more treatment options as well as for increasing our knowledge of metabolic regulation in health and disease. In recent years the extensively studied polyphenol, resveratrol, has been reported to have antidiabetic effects showing that it increases glucose uptake by skeletal muscle cells and prevents fatty acid-induced insulin resistance in vitro and in vivo. Naringenin, a citrus flavonoid with structural similarities to resveratrol, is reported to have antioxidan.t, antiproliferative, anticancer, and anti-inflammatory properties. Effects on glucose and lipid metabolism have also been reported including blood glucose and lipid lowering effects. However, whether naringenin has insulinlike effects is not clear. In the present study the effects of naringenin on glucose uptake in skeletal muscle cells are examined and compared with those of insulin. Naringenin treatment of L6 myotubes increased glucose uptake in a dose- and time dependent manner and independent of insulin. The effects of naringenin on glucose uptake achieved similar levels as seen with maximum insulin stimulation and its effect was additive with sub-maximal insulin treatment. Like insulin naringenin treatment did not increase glucose uptake in myoblasts. To elucidate the mechanism involved in naringenin action we looked at its effect on phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Akt, two signalling molecules that are involved in the insulin signalling cascade leading to glucose uptake. Naringenin did not stimulate basal or insulinstimulated Akt phosphorylation but inhibition of PI3K by wortmannin partially repressed the naringenin-induced glucose uptake. We also examined naringenin's effect on AMP-activated protein kinase (AMPK), a molecule that is involved in mediating glucose uptake by a variety of stimuli. Naringenin stimulated AMPK phosphorylation and this effect was not inhibited by wortmannin. To deduce the nature of the naringenin-stimulated AMPK phosphorylation and its impact on glucose uptake we examined the role of several molecules implicated in mod.ulating AMPK activity including SIRTl, LKB 1, and ca2+ Icalmodulin-dependent protein kinase kinase (CaMKK). Our results indicate that inhibition of SIRTI did not prevent the naringeninstimulated glucose uptake Of. AMPK phosphorylation; naringenin did not stimulate LKB 1 phosphorylation; and inhibition of CaMKK did not prevent naringeninstimulated glucose uptake. Inhibition of AMPK by compound C also did not prevent naringenin-stimulated glucose uptake but effectively inhibited the phosphorylation of AMPK suggesting that AMPK may not be required for the naringenin-stimulated glucose uptake.

Validation des effets antidiabétiques de Rhododendron groenlandicum, une plante médicinale des Cri de la Baie James, dans le modèle in vitro et in vivo : élucidation des mécanismes d’action et identification des composés actifs

Le diabète est un syndrome métabolique caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion de l’insuline, de l’action de l’insuline (sensibilité), ou une combinaison des deux. Plus d'un million de canadiens vivent actuellement avec le diabète. La prévalence de cette maladie est au moins trois fois plus élevée chez les autochtones que dans la population canadienne en général. Notre équipe vise à étudier les effets potentiellement antidiabétiques de certaines plantes médicinales utilisées par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec) où l’adhérence aux traitements médicamenteux est faible, en partie à cause de la déconnection culturelle de ces derniers. Grâce à une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées par cette population pour traiter des symptômes du diabète. Parmi ces plantes, l’extrait éthanolique de Rhododendron groenlandicum (Thé du Labrador) a montré un fort potentiel antidiabétique chez plusieurs lignées cellulaires, notamment les adipocytes (3T3-L1). Cette plante induit la différenciation adipocytaire probablement par l’activation du peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR γ). Cette stimulation améliore la résistance à l’insuline et constitue un mécanisme privilégié pour une classe de médicaments antidiabétiques, les thiazolidinediones. Le but de la présente étude est de valider l’efficacité et l’innocuité de R. groenlandicum in vivo, dans un modèle animal de résistance à l’insuline, d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets antidiabétiques et d’identifier les principes actifs responsables de son activité. L'isolation et l'identification des constituants actifs ont été réalisées à l’aide d'une approche de fractionnement guidé par bioessai; en l'occurrence, l'adipogénèse. Cette approche, réalisée dans la lignée adipocytaire 3T3-L1, a pour but de mesurer leur teneur en triglycérides. Des études in vivo ont été réalisées sur le modèle de souris DIO (diet induced obesity). L'extrait éthanolique du R. groenlandicum a été incorporé à la nourriture grasse (35% d’apport calorique lipidique) à trois doses différentes (125, 250 et 500 mg / kg) sur une période de 8 semaines. Des tissus cibles de l’insuline (foie, muscle squelettique et tissus adipeux) ont été récoltés afin de faire des analyses d’immunobuvardage de type western. La quercétine, la catéchine et l’épicatéchine ont été identifiées comme étant les composés actifs responsables de l'effet antidiabétique du R. groenlandicum. Seules la catéchine et l’épicatéchine activent l’adipogénèse uniquement à forte concentration (125-150 M), tandis que la quercétine l’inhibe. L’étude in vivo a montré que le traitement avec R. groenlandicum chez les souris DIO réduit le gain de poids de 6%, diminue l'hyperglycémie de 13% et l’insulinémie plasmatique de 65% et prévient l’apparition des stéatoses hépatiques (diminution de 42% de triglycéride dans le foie) sans être toxique. Les analyses d’immunobuvardage ont montré que R. groenlandicum stimule la voie de l’insuline via la phosphorylation de l’Akt et a augmenté le contenu protéique en Glut 4 dans les muscles des souris traitées. Par contre, dans le foie, le R. groenlandicum passerait par deux voies différentes, soit la voie insulino-dépendante par l’activation de l’AKT, soit la voie insulino-indépendante par la stimulation de l’AMPK. L’amélioration observée des stéatoses hépatiques chez les souris DIO traitées, a été confirmée par une baisse du facteur de transcription, SREBP-1, impliqué dans la lipogénèse de novo, ainsi qu’une diminution de l’inflammation hépatique (diminution de l’activité d’IKK α/β). En conclusion, l’ensemble de ces résultats soutiennent le potentiel thérapeutique de Rhododendron groenlandicum et de ses composants actifs dans le traitement et la prévention du diabète de type 2. Nous avons validé l'innocuité et l'efficacité de cette plante issue de la médecine traditionnelle Cri, qui pourrait être un traitement alternatif du diabète de type 2 dans une population ayant une faible adhérence au traitement pharmacologique existant.

Contribution différentielle du tissu adipeux mâle et femelle dans l’établissement du diabète de type 2 et des altérations cardiovasculaires : rôle de l’apport lipidique

Au cours des dernières années, il est devenu évident que les sociétés des pays industrialisés sont à haut risque de maladies métaboliques. Une alimentation riche en énergie (lipide/glucide), combinée à une sédentarité accrue, est un facteur environnemental contribuant à l'augmentation de la prévalence de maladies reliées spécifiquement à des troubles endocriniens comme l'obésité et le diabète. Le traitement de ces désordres métaboliques doit donc passer par la connaissance et la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent ces désordres et le développement de traitements ciblés vers les facteurs responsables. Le tissu adipeux est une glande endocrine qui sécrète des substances, regroupées sous le terme d'adipokines, qui contrôlent l'homéostasie énergétique. L'augmentation de la masse adipeuse est responsable du développement de dérégulation hormonale qui mène à des dysfonctions physiologiques et métaboliques. Pour contrecarrer le développement démesuré du tissu adipeux, la signalisation insulinique ainsi que l’apport énergétique, responsables de la différenciation adipocytaire, doivent être inhibés. In vivo, la leptine, adipokine dont la concentration est corrélée à la masse adipeuse, présente des actions pro ou anti-insuliniques dans l’organisme pour réguler ce phénomène. Elle favorise l’effet inhibiteur de l’insuline sur la synthèse hépatique de glucose alors qu’elle s’oppose à son action sur l’expression des enzymes glucokinase et phosphoénol-pyruvate carboxykinase. La leptine influence aussi le taux circulant de triglycérides en diminuant sa concentration plasmatique. D'autre part, l'adiponectine, adipokine insulino- sensibilisante, voit sa sécrétion diminuée avec la prise de poids. La sensibilité à l'insuline est ainsi diminuée au fur et à mesure que le débalancement de ces deux adipokines s'accentue. La résistance à l'insuline s'installe alors pour s'opposer au stockage énergétique et à la prise illimitée de poids et la glycémie augmente. L'augmentation du glucose sanguin stimule la sécrétion d'insuline au niveau des cellules pancréatiques. C'est le diabète caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l'insuline. Le diabète, une des premières causes de mortalité dans le monde, est plus répandu sous sa forme non insulinodépendante (diabète de type 2, DT2) liée à l'obésité. Récemment, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateurs de l'expression d'une panoplie de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique. Parmi eux, les récepteurs des inducteurs de la prolifération des peroxysomes (PPAR, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Les PPAR ont été démontrés comme ayant un rôle central dans le contrôle de la transcription des gènes codants pour des protéines impliquées dans le métabolisme : les adipokines. PPARg, en plus de son implication dans le contrôle de l'homéostasie glucidique et lipidique, est reconnu comme étant un facteur de transcription pivot régulant l'adipogenèse du fait de son expression majeure dans le tissu adipeux. D'autre part, il est bien établi maintenant que l'obésité et le diabète sont des facteurs contribuant au développement du processus inflammatoire vasculaire caractéristique de l’athérosclérose. En effet, les cellules endothéliales et musculaires lisses, principales composantes de la média de l’artère, sont très sensibles aux altérations métaboliques. Une diminution de la sensibilité à l’insuline entraine une réduction de la disponibilité du glucose et l’utilisation des acides gras comme alternatif par ces cellules. Ceci induit l’accumulation des acides gras oxydés dans l’intima et leur filtration dans la média pour former un core lipidique. Bien que l’induction de la dysfonction endothéliale soit impliquée très précocement, certaines études pointent l’accumulation lipidique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et leur dysfonction comme déclencheurs de l’athérosclérose. Ce travail visait donc, dans un premier temps, à développer un modèle d'altérations métaboliques liées à la modulation de l'activité du tissu adipeux via une alimentation riche en lipides. Dans un second temps, cette étude tentait d'évaluer l’impact des adipocytes de souris sur les CML vasculaires et sur la modulation de leurs fonctions dans ce modèle d'altérations métaboliques et DT2 liés à l'alimentation et à l'obésité. Ainsi, par le biais de deux diètes pauvres en cholestérol à profil lipidique différent, nous avons développé un modèle murin présentant divers stades d'altérations du métabolisme allant jusqu'au DT2 en lien avec l'obésité chez les mâles et chez les femelles. D’autre part, des signes de cardiomyopathie ainsi qu’une modulation du taux des adipokines sont reliés à ces mêmes diètes. Parallèlement, l’activité de PPAR!2 est modulée chez les souris sous diètes enrichies en gras. Ensuite, nous avons démontré que les adipocytes, provenant de souris alimentées avec une diète enrichie en gras, modulaient la migration et la prolifération des CML comparativement au groupe contrôle. Ces modulations dépendaient en grande partie de la nature de la diète consommée, mais également du sexe de la souris. Par ailleurs, les altérations fonctionnelles des CML, couplées à des modulations géniques, sont associées aux changements du profil de sécrétion des adipokines mesurées chez les adipocytes. L’ensemble de ces travaux suggère une action directe de la nature de la stimulation du tissu adipeux blanc dans la modulation du profil de sécrétion des adipokines et l'induction du DT2 in vivo. Ces altérations de la physiologie adipocytaire se reflètent in vitro où le tissu adipeux contribue aux altérations physiopathologiques des CML liées au DT2. Ainsi, cette étude est l'une des premières à établir un lien direct entre les modulations adipocytaires et les effets de leurs sécrétions sur la physiologie des CML. Ces observations peuvent être exploitées cliniquement dans un développement futur d’outils thérapeutiques visant à prévenir et à traiter les troubles métaboliques et le DT2, en ciblant le tissu adipeux comme entité métabolique et endocrine.

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Hypertension et régulation de l'expression moléculaire de l'angiotensinogène par la ribonucléoprotéine hétérogène nucléaire K

Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita.

Investigation on key molecular targets responsible for antidiabetic properties of Symplocos cochinchinensis (Lour.) S. Moore

Diabetes mellitus is a heterogeneous metabolic disorder characterized by hyperglycemia with disturbances in carbohydrate, protein and lipid metabolism resulting from defects in insulin secretion, insulin action or both. Currently there are 387 million people with diabetes worldwide and is expected to affect 592 million people by 2035. Insulin resistance in peripheral tissues and pancreatic beta cell dysfunction are the major challenges in the pathophysiology of diabetes. Diabetic secondary complications (like liver cirrhosis, retinopathy, microvascular and macrovascular complications) arise from persistent hyperglycemia and dyslipidemia can be disabling or even life threatening. Current medications are effective for control and management of hyperglycemia but undesirable effects, inefficiency against secondary complications and high cost are still serious issues in the present prognosis of this disorder. Hence the search for more effective and safer therapeutic agents of natural origin has been found to be highly demanding and attract attention in the present drug discovery research. The data available from Ayurveda on various medicinal plants for treatment of diabetes can efficiently yield potential new lead as antidiabetic agents. For wider acceptability and popularity of herbal remedies available in Ayurveda scientific validation by the elucidation of mechanism of action is very much essential. Modern biological techniques are available now to elucidate the biochemical basis of the effectiveness of these medicinal plants. Keeping this idea the research programme under this thesis has been planned to evaluate the molecular mechanism responsible for the antidiabetic property of Symplocos cochinchinensis, the main ingredient of Nishakathakadi Kashayam, a wellknown Ayurvedic antidiabetic preparation. A general introduction of diabetes, its pathophysiology, secondary complications and current treatment options, innovative solutions based on phytomedicine etc has been described in Chapter 1. The effect of Symplocos cochinchinensis (SC), on various in vitro biochemical targets relevant to diabetes is depicted in Chapter 2 including the preparation of plant extract. Since diabetes is a multifactorial disease, ethanolic extract of the bark of SC (SCE) and its fractions (hexane, dichloromethane, ethyl acetate and 90 % ethanol) were evaluated by in vitro methods against multiple targets such as control of postprandial hyperglycemia, insulin resistance, oxidative stress, pancreatic beta cell proliferation, inhibition of protein glycation, protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) and dipeptidyl peptidase-IV (DPPxxi IV). Among the extracts, SCE exhibited comparatively better activity like alpha glucosidase inhibition, insulin dependent glucose uptake (3 fold increase) in L6 myotubes, pancreatic beta cell regeneration in RIN-m5F and reduced triglyceride accumulation in 3T3-L1 cells, protection from hyperglycemia induced generation of reactive oxygen species in HepG2 cells with moderate antiglycation and PTP-1B inhibition. Chemical characterization by HPLC revealed the superiority of SCE over other extracts due to presence of bioactives (beta-sitosterol, phloretin 2’glucoside, oleanolic acid) in addition to minerals like magnesium, calcium, potassium, sodium, zinc and manganese. So SCE has been subjected to oral sucrose tolerance test (OGTT) to evaluate its antihyperglycemic property in mild diabetic and diabetic animal models. SCE showed significant antihyperglycemic activity in in vivo diabetic models. Chapter 3 highlights the beneficial effects of hydroethanol extract of Symplocos cochinchinensis (SCE) against hyperglycemia associated secondary complications in streptozotocin (60 mg/kg body weight) induced diabetic rat model. Proper sanction had been obtained for all the animal experiments from CSIR-CDRI institutional animal ethics committee. The experimental groups consist of normal control (NC), N + SCE 500 mg/kg bwd, diabetic control (DC), D + metformin 100 mg/kg bwd, D + SCE 250 and D + SCE 500. SCEs and metformin were administered daily for 21 days and sacrificed on day 22. Oral glucose tolerance test, plasma insulin, % HbA1c, urea, creatinine, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin, total protein etc. were analysed. Aldose reductase (AR) activity in the eye lens was also checked. On day 21, DC rats showed significantly abnormal glucose response, HOMA-IR, % HbA1c, decreased activity of antioxidant enzymes and GSH, elevated AR activity, hepatic and renal oxidative stress markers compared to NC. DC rats also exhibited increased level of plasma urea and creatinine. Treatment with SCE protected from the deleterious alterations of biochemical parameters in a dose dependent manner including histopathological alterations in pancreas. SCE 500 exhibited significant glucose lowering effect and decreased HOMA-IR, % HbA1c, lens AR activity, and hepatic, renal oxidative stress and function markers compared to DC group. Considerable amount of liver and muscle glycogen was replenished by SCE treatment in diabetic animals. Although metformin showed better effect, the activity of SCE was very much comparable with this drug. xxii The possible molecular mechanism behind the protective property of S. cochinchinensis against the insulin resistance in peripheral tissue as well as dyslipidemia in in vivo high fructose saturated fat diet model is described in Chapter 4. Initially animal were fed a high fructose saturated fat (HFS) diet for a period of 8 weeks to develop insulin resistance and dyslipidemia. The normal diet control (ND), ND + SCE 500 mg/kg bwd, high fructose saturated fat diet control (HFS), HFS + metformin 100 mg/kg bwd, HFS + SCE 250 and HFS + SCE 500 were the experimental groups. SCEs and metformin were administered daily for the next 3 weeks and sacrificed at the end of 11th week. At the end of week 11, HFS rats showed significantly abnormal glucose and insulin tolerance, HOMA-IR, % HbA1c, adiponectin, lipid profile, liver glycolytic and gluconeogenic enzyme activities, liver and muscle triglyceride accumulation compared to ND. HFS rats also exhibited increased level of plasma inflammatory cytokines, upregulated mRNA level of gluconeogenic and lipogenic genes in liver. HFS exhibited the increased expression of GLUT-2 in liver and decreased expression of GLUT-4 in muscle and adipose. SCE treatment also preserved the architecture of pancreas, liver, and kidney tissues. Treatment with SCE reversed the alterations of biochemical parameters, improved insulin sensitivity by modifying gene expression in liver, muscle and adipose tissues. Overall results suggest that SC mediates the antidiabetic activity mainly via alpha glucosidase inhibition, improved insulin sensitivity, with antiglycation and antioxidant activities.

LIPGENE food-exchange model for alteration of dietary fat quantity and quality in free-living participants from eight European countries

Controlled human intervention trials are required to confirm the hypothesis that dietary fat quality may influence insulin action. The aim was to develop a food-exchange model, suitable for use in free-living volunteers, to investigate the effects of four experimental diets distinct in fat quantity and quality: high SFA (HSFA); high MUFA (HMUFA) and two low-fat (LF) diets, one supplemented with 1.24g EPA and DHA/d (LFn-3). A theoretical food-exchange model was developed. The average quantity of exchangeable fat was calculated as the sum of fat provided by added fats (spreads and oils), milk, cheese, biscuits, cakes, buns and pastries using data from the National Diet and Nutrition Survey of UK adults. Most of the exchangeable fat was replaced by specifically designed study foods. Also critical to the model was the use of carbohydrate exchanges to ensure the diets were isoenergetic. Volunteers from eight centres across Europe completed the dietary intervention. Results indicated that compositional targets were largely achieved with significant differences in fat quantity between the high-fat diets (39.9 (SEM 0.6) and 38.9 (SEM 0.51) percentage energy (%E) from fat for the HSFA and HMUFA diets respectively) and the low-fat diets (29.6 (SEM 0.6) and 29.1 (SEM 0.5) %E from fat for the LF and LFn-3 diets respectively) and fat quality (17.5 (SEM 0.3) and 10.4 (SEM 0.2) %E front SFA and 12.7 (SEM 0.3) and 18.7 (SEM 0.4) %E MUFA for the HSFA and HMUFA diets respectively). In conclusion, a robust, flexible food-exchange model was developed and implemented successfully in the LIPGENE dietary intervention trial.

Dietary PUFA and the metabolic syndrome in Indian Asians living in the UK

Indian Asians living in the UK have a 50% higher CHD mortality rate compared with the indigenous Caucasian population, which cannot be attributed to traditional risk factors. Instead, features of the metabolic syndrome, including raised plasma triacylglycerol, reduced HDL-cholesterol (HDL-C) and an increased proportion of small dense LDL particles, together with insulin resistance and central obesity, are prevalent among this population. The present review examines evidence to support the hypothesis that an imbalance in dietary PUFA intake, specifically a higher intake of n-6 PUFA in combination with a lower intake of the long-chain (LC) n-3 PUFA, plays an important role in the prevalence of the metabolic syndrome observed in Indian Asians. Data are presented to illustrate the impact of manipulation of the background n-6 PUFA intake (moderate or high n-6 PUFA) and the subsequent response to supplementation with LC n-3 PUFA on blood lipids and insulin action in a group of Indian Asian volunteers. The results demonstrate that supplementation with LC n-3 PUFA had no impact on insulin action in those subjects consuming either the moderate-or high-n-6 PUFA diet. In the postprandial phase reductions in plasma triacylglycerol concentrations were greater in those consuming the high-n-6 PUFA background diet subsequent to fish oil supplementation. The present study concludes that, contrary to the central hypothesis, the prevalence of metabolic abnormalities in Indian Asians compared with Caucasians may not be attributable to differences in intakes of n-6 and n-3 PUFA.