Valutazione della risposta immunitaria cellulare e fenotipizzazione linfocitaria nel suino in corso di infezione naturale da virus della PRRS (“Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome”) e dopo stimolazione di PBMC (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”) in vitro con Peptide Killer (KP)

SUMMARY The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus is one of the most spread pathogens in swine herds all over the world and responsible for a reproductive and respiratory syndrome that causes severe heath and economical problems. This virus emerged in late 1980’s but although about 30 years have passed by, the knowledge about some essential facets related to the features of the virus (pathogenesis, immune response, and epidemiology) seems to be still incomplete. Taking into account that the development of modern vaccines is based on how innate and acquire immunity react, a more and more thorough knowledge on the immune system is needed, in terms of molecular modulation/regulation of the inflammatory and immune response upon PRRSV infection. The present doctoral thesis, which is divided into 3 different studies, is aimed to increase the knowledge about the interaction between the immune system and the PRRS virus upon natural infection. The objective of the first study entitled “Coordinated immune response of memory and cytotoxic T cells together with IFN-γ secreting cells after porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) natural infection in conventional pigs” was to evaluate the activation and modulation of the immune response in pigs naturally infected by PRRSV compared to an uninfected control group. The course of viremia was evaluated by PCR, the antibody titres by ELISA, the number of IFN-γ secreting cells (IFN- SC) by an ELISPOT assay and the immunophenotyping of some lymphocyte subsets (cytotoxic cells, memory T lymphocytes and cytotoxic T lymphocytes) by flow cytometry. The results showed that the activation of the cell-mediated immune response against PRRSV is delayed upon infection and that however the levels of IFN-γ SC and lymphocyte subsets subsequently increase over time. Furthermore, it was observed that the course of the different immune cell subsets is time-associated with the levels of PRRSV-specific IFN-γ SC and this can be interpreted based on the functional role that such lymphocyte subsets could have in the specific production/secretion of the immunostimulatory cytokine IFN-γ. In addition, these data support the hypothesis that the age of the animals upon the onset of infection or the diverse immunobiological features of the field isolate, as typically hypothesized during PRRSV infection, are critical conditions able to influence the qualitative and quantitative course of the cell-mediated immune response during PRRSV natural infection. The second study entitled “Immune response to PCV2 vaccination in PRRSV viremic piglets” was aimed to evaluate whether PRRSV could interfere with the activation of the immune response to PCV2 vaccination in pigs. In this trial, 200 pigs were divided into 2 groups: PCV2-vaccinated (at 4 weeks of age) and PCV2-unvaccinated (control group). Some piglets of both groups got infected by PRRSV, as determined by PRRSV viremia detection, so that 4 groups were defined as follows: PCV2 vaccinated - PRRSV viremic PCV2 vaccinated - PRRSV non viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV non viremic The following parameters were evaluated in the 4 groups: number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells, antibody titres by ELISA and IPMA. Based on the immunological data analysis, it can be deduced that: 1) The low levels of antibodies against PCV2 in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group at vaccination (4 weeks of age) could be related to a reduced colostrum intake influenced by PRRSV viremia. 2) Independently of the viremia status, serological data of the PCV2-vaccinated group by ELISA and IPMA does not show statistically different differences. Consequently, it can be be stated that, under the conditions of the study, PRRSV does not interfere with the antibody response induced by the PCV2 vaccine. 3) The cell-mediated immune response in terms of number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group seems to be compromised, as demonstrated by the reduction of the number of IFN-γ secreting cells after PCV2 vaccination, compared to the PCV2-vaccinated – PRRSV-non-viremic group. The data highlight and further support the inhibitory role of PRRSV on the development and activation of the immune response and highlight how a natural infection at early age can negatively influence the immune response to other pathogens/antigens. The third study entitled “Phenotypic modulation of porcine CD14+ monocytes, natural killer/natural killer T cells and CD8αβ+ T cell subsets by an antibody-derived killer peptide (KP)” was aimed to determine whether and how the killer peptide (KP) could modulate the immune response in terms of activation of specific lymphocyte subsets. This is a preliminary approach also aimed to subsequently evaluate such KP with a potential antivural role or as adjuvant. In this work, pig peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with three KP concentrations (10, 20 and 40 g/ml) for three time points (24, 48 and 72 hours). TIME POINTS (hours) KP CONCENTRATIONS (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 By using flow cytometry, the qualitative and quantitative modulation of the following immune subsets was evaluated upon KP stimulation: monocytes, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and CD4+ and CD8α/β+ T lymphocyte subsets. Based on the data, it can be deduced that: 1) KP promotes a dose-dependent activation of monocytes, particularly after 24 hours of stimulation, by inducing a monocyte phenotypic and maturation shift mainly involved in sustaining the innate/inflammatory response. 2) KP induces a strong dose-dependent modulation of NK and NKT cells, characterized by an intense increase of the NKT cell fraction compared to NK cells, both subsets involved in the antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC). The increase is observed especially after 24 hours of stimulation. 3) KP promotes a significant activation of the cytotoxic T lymphocyte subset (CTL). 4) KP can modulate both the T helper and T cytotoxic phenotype, by inducing T helper cells to acquire the CD8α thus becoming doube positive cells (CD4+CD8+) and by inducing CTL (CD4-CD8+high) to acquire the double positive phenotype (CD4+CD8α+high). Therefore, KP may induce several effects on different immune cell subsets. For this reason, further research is needed aimed at characterizing each “effect” of KP and thus identifying the best use of the decapeptide for vaccination practice, therapeutic purposes or as vaccine adjuvant. RIASSUNTO Il virus della PRRS (Porcine Reproductive Respiratory Syndrome) è uno dei più diffusi agenti patogeni negli allevamenti suini di tutto il mondo, responsabile di una sindrome riproduttiva e respiratoria causa di gravi danni ad impatto sanitario ed economico. Questo virus è emerso attorno alla fine degli anni ’80 ma nonostante siano passati circa una trentina di anni, le conoscenze su alcuni punti essenziali che riguardano le caratteristiche del virus (patogenesi, risposta immunitaria, epidemiologia) appaiono ancora spesso incomplete. Considerando che lo sviluppo dei vaccini moderni è basato sui principi dell’immunità innata e acquisita è essenziale una sempre più completa conoscenza del sistema immunitario inteso come modulazione/regolazione molecolare della risposta infiammatoria e immunitaria in corso di tale infezione. Questo lavoro di tesi, suddiviso in tre diversi studi, ha l’intento di contribuire all’aumento delle informazioni riguardo l’interazione del sistema immunitario, con il virus della PRRS in condizioni di infezione naturale. L’obbiettivo del primo studio, intitolato “Associazione di cellule memoria, cellule citotossiche e cellule secernenti IFN- nella risposta immunitaria in corso di infezione naturale da Virus della Sindrome Riproduttiva e Respiratoria del Suino (PRRSV)” è stato di valutare l’attivazione e la modulazione della risposta immunitaria in suini naturalmente infetti da PRRSV rispetto ad un gruppo controllo non infetto. I parametri valutati sono stati la viremia mediante PCR, il titolo anticorpale mediante ELISA, il numero di cellule secernenti IFN- (IFN- SC) mediante tecnica ELISPOT e la fenotipizzazione di alcune sottopopolazioni linfocitarie (Cellule citotossiche, linfociti T memoria e linfociti T citotossici) mediante citofluorimetria a flusso. Dai risultati ottenuti è stato possibile osservare che l’attivazione della risposta immunitaria cellulo-mediata verso PRRSV appare ritardata durante l’infezione e che l’andamento, in termini di IFN- SC e dei cambiamenti delle sottopopolazioni linfocitarie, mostra comunque degli incrementi seppur successivi nel tempo. E’ stato inoltre osservato che gli andamenti delle diverse sottopopolazioni immunitarie cellulari appaiono temporalmente associati ai livelli di IFN- SC PRRSV-specifiche e ciò potrebbe essere interpretato sulla base del ruolo funzionale che tali sottopopolazioni linfocitarie potrebbero avere nella produzione/secrezione specifica della citochina immunoattivatrice IFN-. Questi dati inoltre supportano l’ipotesi che l’età degli animali alla comparsa dell’infezione o, come tipicamente ipotizzato nell’infezione da PRRSV, le differenti caratteristiche immunobiologiche dell’isolato di campo, sia condizioni critiche nell’ influenzare l’andamento qualitativo e quantitativo della risposta cellulo-mediata durante l’infezione naturale da PRRSV. Il secondo studio, dal titolo “Valutazione della risposta immunitaria nei confronti di una vaccinazione contro PCV2 in suini riscontrati PRRSV viremici e non viremici alla vaccinazione” ha avuto lo scopo di valutare se il virus della PRRS potesse andare ad interferire sull’attivazione della risposta immunitaria indotta da vaccinazione contro PCV2 nel suino. In questo lavoro sono stati arruolati 200 animali divisi in due gruppi, PCV2 Vaccinato (a 4 settimane di età) e PCV2 Non Vaccinato (controllo negativo). Alcuni suinetti di entrambi i gruppi, si sono naturalmente infettati con PRRSV, come determinato con l’analisi della viremia da PRRSV, per cui è stato possibile creare quattro sottogruppi, rispettivamente: PCV2 vaccinato - PRRSV viremico PCV2 vaccinato - PRRSV non viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV non viremico Su questi quattro sottogruppi sono stati valutati i seguenti parametri: numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche, ed i titoli anticorpali mediante tecniche ELISA ed IPMA. Dall’analisi dei dati immunologici derivati dalle suddette tecniche è stato possibile dedurre che:  I bassi valori anticorpali nei confronti di PCV2 del gruppo Vaccinato PCV2-PRRSV viremico già al periodo della vaccinazione (4 settimane di età) potrebbero essere messi in relazione ad una ridotta assunzione di colostro legata allo stato di viremia da PRRSV  Indipendentemente dallo stato viremico, i dati sierologici del gruppo vaccinato PCV2 provenienti sia da ELISA sia da IPMA non mostrano differenze statisticamente significative. Di conseguenza è possibile affermare che in questo caso PRRSV non interferisce con la risposta anticorpale promossa dal vaccino PCV2.  La risposta immunitaria cellulo-mediata, intesa come numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche nel gruppo PCV2 vaccinato PRRS viremico sembra essere compromessa, come viene infatti dimostrato dalla diminuzione del numero di cellule secernenti IFN- dopo la vaccinazione contro PCV2, comparata con il gruppo PCV2 vaccinato- non viremico. I dati evidenziano ed ulteriormente sostengono il ruolo inibitorio del virus della PRRSV sullo sviluppo ed attivazione della risposta immunitaria e come un infezione naturale ad età precoci possa influenzare negativamente la risposta immunitaria ad altri patogeni/antigeni. Il terzo studio, intitolato “Modulazione fenotipica di: monociti CD14+, cellule natural killer (NK), T natural killer (NKT) e sottopopolazioni linfocitarie T CD4+ e CD8+ durante stimolazione con killer peptide (KP) nella specie suina” ha avuto come scopo quello di stabilire se e come il Peptide Killer (KP) potesse modulare la risposta immunitaria in termini di attivazione di specifiche sottopopolazioni linfocitarie. Si tratta di un approccio preliminare anche ai fini di successivamente valutare tale KP in un potenziale ruolo antivirale o come adiuvante. In questo lavoro, periferal blood mononuclear cells (PBMC) suine sono state stimolate con KP a tre diverse concentrazioni (10, 20 e 40 g/ml) per tre diversi tempi (24, 48 e 72 ore). TEMPI DI STIMOLAZIONE (ore) CONCENTRAZIONE DI KP (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 Mediante la citometria a flusso è stato dunque possibile analizzare il comportamento qualitativo e quantitativo di alcune sottopopolazioni linfocitarie sotto lo stimolo del KP, tra cui: monociti, cellule Natural Killer (NK), cellule T Natural Killer (NKT) e linfociti T CD4 e CD8+. Dai dati ottenuti è stato possibile dedurre che: 1) KP promuove un’attivazione dei monociti dose-dipendente in particolare dopo 24 ore di stimolazione, inducendo uno “shift” fenotipico e di maturazione monocitaria maggiormente coinvolto nel sostegno della risposta innata/infiammatoria. 2) KP induce una forte modulazione dose-dipendente di cellule NK e NKT con un forte aumento della frazione delle cellule NKT rispetto alle NK, sottopopolazioni entrambe coinvolte nella citotossicità cellulare mediata da anticorpi (ADCC). L’aumento è riscontrabile soprattutto dopo 24 ore di stimolazione. 3) KP promuove una significativa attivazione della sottopopolazione del linfociti T citotossici (CTL). 4) Per quanto riguarda la marcatura CD4+/CD8+ è stato dimostrato che KP ha la capacità di modulare sia il fenotipo T helper che T citotossico, inducendo le cellule T helper ad acquisire CD8 diventando quindi doppio positive (CD4+CD8+) ed inducendo il fenotipo CTL (CD4-CD8+high) ad acquisire il fenotipo doppio positivo (CD4+CD8α+high). Molti dunque potrebbero essere gli effetti che il decapeptide KP potrebbe esercitare sulle diverse sottopopolazioni del sistema immunitario, per questo motivo va evidenziata la necessità di impostare e attuare nuove ricerche che portino alla caratterizzazione di ciascuna “abilità” di KP e che conducano successivamente alla scoperta del migliore utilizzo che si possa fare del decapeptide sia dal punto di vista vaccinale, terapeutico oppure sotto forma di adiuvante vaccinale.

Analisi tecnico-economica di interventi di riqualificazione energetica in un plesso scolastico

Gli interventi di riqualificazione energetica di un edificio risultano necessari per rispondere alle leggi europee e nazionali che impongono misure sempre più stringenti per limitare le dispersioni termiche degli edifici e per ridurre i consumi energetici. L’utilizzo del software Edilclima ha permesso lo studio e l’analisi delle condizioni pre e post-interventi dell’edificio scolastico G. Marconi sito in Castelfranco Emilia (MO). Per mezzo del modello creato nel software, sono state determinate le dispersioni termiche dell’edificio, sulla base delle quali è stato possibile definire alcuni interventi di efficientamento energetico. Gli interventi considerati sono stati: isolamento delle pareti perimetrali verso l’esterno e verso il terreno, isolamento del sottotetto, sostituzione degli infissi. Gli interventi sono necessari per ottenere un edificio che presenti caratteristiche conformi alle leggi; hanno lo scopo di ridurre l’indice di Prestazione Energetica e i costi per il riscaldamento dell’edificio. Gli indici su cui si è valutata la convenienza degli interventi sono stati: il risparmio in termini di costo annuo per il riscaldamento e il tempo di ritorno dell’investimento (payback time). Sono stati presi in considerazione i casi di interventi singoli e di interventi combinati, il confronto tra essi, in questo caso, definisce gli interventi combinati come maggiormente convenienti rispetto ai parametri presi in considerazione per la valutazione della convenienza. Le valutazioni, inoltre, sono state effettuate in due diversi condizioni: impianto con accensione continua (sul modello delle valutazioni per la Certificazione Energetica) e impianto con accensione intermittente (sul modello delle valutazioni per la Diagnosi energetica). Le due condizioni di prova hanno messo in luce l’importanza della valutazione con impianto intermittente poiché questa rappresenta una condizione più realistica e fornisce una stima più attendibile della convenienza degli interventi.

Trattamenti mediante tecnologie basate sul plasma di carote julienne

Prodotti di IV gamma a base di frutta e verdura minimamente trattati o pronti all'uso non possono essere considerati sicuri da un punto di vista microbiologico e sono stati spesso associati a casi di tossinfezione. Per tali episodi è stato evidenziato che la qualità dell'acqua utilizzata per il lavaggio è una fase critica. D'altra parte è noto che la disinfezione è una delle fasi di lavorazione più importanti per i prodotti minimamente trattati in quanto ha effetti diretti sulla qualità dei prodotti finiti, sulla sicurezza e la loro shelf-life. Tradizionalmente, l'industria di IV gamma ha impiegato i composti derivati del cloro per la fase di disinfezione in virtù della loro efficacia, semplicità d'uso e basso costo. Tuttavia vi è una diffusa tendenza ad eliminare i prodotti a base di cloro a causa soprattutto della preoccupazione in relazione ai rischi ambientali e sanitari per il consumatore associati alla formazione di sottoprodotti alogenati cancerogeni. Tra le varie tecnologie emergenti, proposte come alternative al cloro, il plasma ha presentato buone potenzialità in virtù delle specie chimiche che lo compongono, principalmente specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto, che sembrano essere responsabili di stress ossidativo alle cellule microbiche, con conseguenti danni per DNA, proteine e lipidi. L’obiettivo generale di questo elaborato finale è stato quello di valutare la possibilità di utilizzare la tecnologia del plasma per la decontaminazione superficiale di carote julienne. In particolare si sono presi in considerazione trattamenti diretti in cui il vegetale è stato esposto al plasma per differenti tempi compresi tra 5 e 40 minuti. Inoltre, si è utilizzo il plasma per il trattamento di acqua che è stata successivamente impiegata per il lavaggio delle carote julienne. L'efficacia di entrambe le modalità di trattamento è stata verificata nei confronti sia della microflora naturalmente contaminante le carote, sia di alcuni microrganismi patogeni che possono essere associati a tale vegetale: Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis ed Escherichia coli.

Le neoplasie del gatto. Ricerche istologiche e immunoistochimiche

Il contributo di ricerca di questo lavoro è consistito nel rivalutare da un punto di vista diagnostico, classificativo e statistico, una casistica di neoplasie del gatto archiviate in 23 anni (1984-2006). Nei primi 20 anni sono state diagnosticate 1696 neoplasie su un totale di 3682 campioni prevenuti nello stesso periodo, con una prevalenza delle patologie di tipo neoplastico del 46,06%. Nei tre anni successivi sono state individuate 382 neoplasie su un totale di 601 campioni archiviati, con una prevalenza del 61,02%. Le neoplasie avevano per l'81,8% un comportamento maligno, e questo dato risulta coerente con il dato più recente sulla malignità (85,6%) e con quello fornito da altri autori. L'età dei soggetti affetti era simile nei due studi, compresa fra pochi mesi e 22 anni, con il maggior numero di casi fra 9 e 13 anni. Le due casistiche presentano inoltre dati simili riguardo gli organi coinvolti anche se i tumori della mammella sono notevolmente diminuiti negli ultimi anni, con un aumento corrispondente di neoplasie cutanee. I fibrosarcomi, che hanno subito un drastico aumento tra il 1993 e il 1994 si sono mantenuti costanti in tutti gli anni successivi, dato ancora oggi quasi certamente correlabile alle pratiche vaccinali. I linfomi sono risultati piuttosto infrequenti in entrambe le casistiche, comparate con i dati della letteratura in cui vengono riportate percentuali nettamente maggiori. I tumori del cavo orale e dell'intestino hanno mantenuto circa le stesse percentuali di insorgenza nel corso degli anni. Tra i tumori presenti in questo studio, sono stati approfonditi i tumori a carico delle sierose (mesoteliomi) e del polmone attraverso metodiche immunoistochimiche e ultrastrutturali. Nei 23 anni sono stati diagnosticati 10 casi di mesotelioma, di cui 8 coinvolgenti la pleura e due il peritoneo. Su questi casi è stata applicata una metodica immunoistochimica con un pannello anticorpale utilizzato di routine in patologia umana per la diagnosi di mesotelioma e per la diagnosi differenziale con i carcinomi polmonari. Tutti i casi presentavano una doppia positività per vimentina e citocheratine ad ampio spettro; anticorpi specifici come CK5/6 e HBME-1 hanno presentato una buona specificità. Anche la microscopia elettronica si è rivelata di ausilio, mettendo in evidenza la presenza di tonofilamenti citoplasmatici e di microvilli, tipici delle cellule mesoteliali. Le neoplasie polmonari, analogamente a quelle umane hanno, sono notevolmente aumentate negli ultimi anni. Dei 24 casi raccolti tra il materiale di archivio, 14 sono stati diagnosticati negli ultimi 5 anni. Si è rilevata una significativa predisposizione nei gatti di razza Persiana, e le metastasi più frequenti sono state a carico dei linfonodi, del miocardio e dei cuscinetti plantari, analogamente a quanto segnalato in letteratura. L’istotipo più rappresentato è stato il carcinoma squamoso, seguito da adenocarcinomi papillari e bronchioloalveolari. Il pannello immunoistochimico applicato, finalizzato a individuare l’origine broncogena o ghiandolare della neoplasia, è risultato utile per la diagnosi delle forme squamose poco differenziate (CK 5/6 e CK 14). Infine è stato testato l’anticorpo di elezione nella diagnosi differenziale fra le neoplasie primitive e secondarie del polmone, il TTF-1, che però non ha cross-reagito con tessuti di gatto; la diagnosi di neoplasia primitiva polmonare si è dunque basata sull’assenza, anche nei dati anamnestici, di masse in altri distretti corporei.

Isotiocianati come potenziali farmaci antileucemici: identificazione in vitro ed ex vivo del profilo molecolare e cellulare

Il presente studio ha come obbiettivo lo sviluppo di composti di origine naturale come potenziali farmaci antitumorali, attraverso la definizione dei loro specifici target cellulari e molecolari su diversi modelli cellulari ad alta predittività. Gli isotiocianati, contenuti nei vegetali appartenenti alla famiglia delle Crucifereae, sono dotati di una comprovata capacità di inibire la formazione di tumori in modelli animali preventivamente trattati con cancerogeni. Questa attività è riconducibile principalmente alla modulazione degli enzimi coinvolti nell’attivazione/detossificazione di xenobiotici e ad effetti citostatici e citossici, osservati su numerose linee cellulari. Un isotiocianato particolarmente promettente è il sulforafane (SFN). La ricerca condotta durante il periodo di dottorato si è, quindi, focalizzata sull’isotiocianato SFN e in particolare sulla sua capacità di modulare specifici eventi cellulari e molecolari coinvolti nel processo di leucemogenesi. Inizialmente è stato indagato il potenziale citostatico e citotossico del SFN su una linea cellulare T linfoblastoide (cellule Jurkat), con particolare attenzione agli effetti sulla proliferazione cellulare, all’induzione di apoptosi/necrosi e all’analisi di alcuni dei meccanismi molecolari coinvolti negli effetti citostatici e citotossici dell’isotiocianato ( livelli proteici di p53, bax e bcl-2). Successivamente, poiché requisiti fondamentali di un antitumorale sono selettività d’azione e scarsa tossicità, è stato indagato il potenziale citostatico e citotossico dell’isotiocianato SFN sulla controparte non trasformata delle cellule leucemiche T linfoblastoidi, analizzando gli stessi eventi studiati su cellule tumorali e alcuni dei meccanismi molecolari coinvolti (livelli proteici di ciclina D2, ciclina D3, chinasi ciclina dipendente (CDK) 4 e CDK6 ). Il SFN si è dimostrato in grado di indurre apoptosi sulle cellule Jurkat e di inibirne la proliferazione, mediante un blocco in fase G2/M del ciclo cellulare e un incremento dei livelli di p53 e bax. Il SFN è in grado di indurre effetti citostatici e citotossici anche su linfociti T non trasformati. Tuttavia, le dosi necessarie per esibire tali effetti sono ben più elevate di quelle attive su cellule leucemiche. Una tappa importante nello sviluppo di un farmaco antitumorale è, la definizione, dove possibile, dei suoi effetti in un modello ex vivo, altamente predittivo di quella che sarà la risposta farmacologica in vivo. Sono stati quindi valutati gli effetti del SFN su colture primarie di blasti provenienti da pazienti affetti da diversi tipi di leucemia , sia mieloide che linfoblastica. Il SFN non sembra possedere alcuna attività su campioni da pazienti affetti da LLC, mentre un importante attività proapoptotica si registra nei campioni da pazienti affetti da LMA, dove l’effetto del SFN è sorprendentemente marcato anche su campioni da pazienti multiresistenti. L’attività dell’isotiocianato sui campioni da pazienti affetti da LLA è decisamente più marcata sul campione da paziente affetto da LLA a cellule B, mentre sul campione di Leucemia Acuta Bifenotipica l’effetto proapoptotico del SFN si registra dopo tempi di trattamento brevi piuttosto che dopo tempi di trattamento più lunghi. In conclusione, i risultati ottenuti evidenziano che il SFN possiede un’interessante attività antileucemica in vitro e, dato di particolare rilevanza, anche ex vivo.

Riparazione del danno ischemico ostruttivo del miocardio mediante cellule staminali mesenchimali sottoposte a stimolazione elettromeccanica in bioreattore

Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

I linfociti T regolatori nella patologia epatica da HCV: dall'epatite cronica al trapianto

La storia naturale dell’epatopatia HCV-relata passa dall’epatite cronica alla cirrosi ed eventualmente all’epatocarcinoma fino ad arrivare alla possibile necessità del trapianto di fegato. HCV non esercita citolisi diretta, pertanto i fattori immunologici giocano il duplice ruolo di determinare l’evoluzione dell’infezione e il danno epatico. All’interno del sistema immunitario esistono linfociti in grado di inibire l’attivazione delle cellule effettrici modulando la risposta immunitaria; la popolazione regolatoria meglio conosciuta è costituita dai cosiddetti T-reg caratterizzati dal fenotipo CD4+CD35hiFoxp3+. Scopo di questo studio è stato determinare fenotipo e funzione dei T-reg, valutandone le correlazioni con caratteristiche cliniche e parametri biochimici e virologici, nelle diverse fasi della malattia epatica da HCV, a partire dall’epatite cronica, passando per la cirrosi, l’epatocarcinoma e terminando con il follow-up post-trapianto di fegato. Sono stati reclutati 80 pazienti con infezione cronica da HCV non in trattamento antivirale, di cui 52 con epatite cronica, 12 con cirrosi e 16 con epatocarcinoma. Di questi, 11 sono andati incontro a trapianto di fegato e sono stati poi seguiti fino a 36 mesi di follow up. Ventinove soggetti avevano transaminasi persistentemente nella norma e 28 mostravano ALT costantemente oltre 2.5x i valori normali. Quaranta donatori di sangue sono stati utilizzati come controlli sani. Marcatori di superficie (CD4, CD25) ed intracellulari (Foxp3) sono stati valutati in citofluorimetria su sangue intero periferico per tutti i soggetti al basale ed ogni 2-4 settimane dopo trapianto. In una quota di pazienti i T-reg sono stati estratti dai linfociti del sangue periferico con metodi immunomagnetici e la loro funzione valutata come percentuale di inibizione di proliferazione e produzione di IFN-γ da parte delle cellule bersaglio CD4+CD25- in esperimenti di co-coltura effettuati al basale e dopo 24-36 settimane dal trapianto. La percentuale di T-reg e l’espressione del Foxp3 sono risultate aumentate nei soggetti con HCV rispetto ai controlli sani, in particolare in coloro con cirrosi, HCC e nei pazienti con transaminasi normali indipendentemente dallo stadio di malattia, correlando inversamente con i livelli di transaminasi e direttamente con il punteggio MELD. La produzione di IFN-γ è incrementata in tutti i pazienti HCV ma efficacemente controllata solamente dai T-reg dei pazienti con transaminasi normali. Dopo il trapianto di fegato, si verifica una precoce e reversibile riduzione delle T-reg circolanti. Alla 24ma e 36ma settimana dal trapianto la percentuale dei T-reg circolanti è sovrapponibile al basale e i loro effetti, sia in termini di proliferazione che di produzione di IFN-γ, sulle cellule bersaglio, già dotate di una ridotta attività intrinseca, appaiono particolarmente incisivi. In conclusione, l’epatopatia cronica da HCV è caratterizzata da una popolazione di T-reg espansa che però, con l’eccezione dei soggetti con transaminasi normali, non appare in grado di limitare il danno epatico immuno-mediato e potrebbe favorire lo sviluppo e la crescita di lesioni tumorali nei pazienti con malattia avanzata. Il trapianto di fegato, probabilmente a causa della terapia immunosoppressiva, si associa ad un marcato e transitorio declino dei T-reg le cui numerosità e funzione vengono completamente recuperate a sei mesi dall’intervento. La migliore conoscenza dei meccanismi alla base delle cinetica e della funzione delle cellule regolatorie potrà fornire utili strumenti per il loro utilizzo come adiuvanti nella terapia dell’epatopatia cronica HCV relata.

Cellule staminali mesenchimali umane da molteplici tessuti adulti: caratteristiche condivise e tessuto-specificità

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

L'espressione dell'enzima Indoleamina 2,3-Diossigenasi come meccanismo immunoregolatore in cellule dentritiche normali e leucemiche

L’enzima indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) catalizza la conversione dell’aminoacido essenziale triptofano in chinurenine. Questa proprietà conferisce a IDO la capacità di inibire la risposta immunitaria sia causando la deplezione dal microambiente di triptofano, che è necessario ai linfociti T per proliferare ed espandersi, sia producendo metaboliti che possono causare l’apoptosi dei linfociti T. Nel presente studio è stata indagata la funzione di IDO in cellule dendritiche normali e leucemiche. Lo studio dell’espressione di IDO in cellule dendritiche normali ha permesso di osservare che, quando immature, IDO è poco espresso, mentre durante la maturazione IDO viene up-regolato. In particolare, l’incremento nell’espressione di IDO non è strettamente legato al livello di maturazione, ma alla qualità dello stimolo maturativo. Infatti uno stimolo endogeno come il ligando di CD40 ha una scarsa efficacia nell’up-regolazione di IDO, uno stimolo batterico come l’LPS ha un’efficacia intermedia, mentre uno stimolo rappresentato da citochine pro-infiammatorie ha un’efficacia massima. L’espressione di IDO risulta direttamente propozionale alla produzione di chinurenine, all’inibizione della proliferazione dei linfociti T e all’induzione di una popolazione di linfociti T regolatori. Lo studio dell’espressione di IDO in cellule dendritiche leucemiche ha permesso di osservare che IDO è espresso a un livello intermedio nelle cellule dendritiche leucemiche immature e viene up-regolato durante la maturazione. La conseguenza principale dell’espressione di IDO in cellule dendritiche leucemiche è l’induzione di una popolazione di linfociti T regolatori fortemente in grado di limitare sia la risposta CD4+ che la risposta CD8+ anti-leucemica e capaci di inibire la maturazione di altre cellule dendritiche. Nel complesso, i dati emersi da questo studio hanno permesso di concludere che, in cellule dendritiche normali, IDO rappresenta un meccanismo tollerogenico la cui intensità di espressione è correlata all’intensità dello stimolo attivatorio da controbilanciare, a cui è sottoposta la cellula dendritica. Nelle cellule dendritiche leucemiche IDO rappresenta un meccanismo di tumor-escape in grado di inibire l’attivazione di cellule dendritiche, linfociti CD4+ e linfociti CD8+.

Analisi molecolare dei linfomi cutanei aggressivi

I linfomi primitivi cutanei riconosciuti nella classificazione della WHO/EORTC si presentano come “entità cliniche distinte” su base clinica, morfologica, immunofenotipica e molecolare. Il fenotipo linfocitario T helper CD4+ caratterizza i CTCL, ma alcune entità a prognosi aggressiva presentano un immunofenotipo citotossico CD8+. Numerosi studi di citogenetica (CGH) e gene-expression profiling (GEP) sono stati condotti negli ultimi anni sui CTCL e sono state riscontrate numerose aberrazioni cromosomiche correlate ai meccanismi di controllo del ciclo cellulare. Scopo del nostro studio è la valutazione delle alterazioni genomiche coinvolte nella tumorigenesi di alcuni CTCL aggressivi: il linfoma extranodale NK/T nasal-type, il linfoma primitivo cutaneo aggressivo epidermotropo (AECTCL) e il gruppo dei PTCL/NOS pleomorfo CD8+. Il materiale bioptico dei pazienti è stato sottoposto alla metodica dell’array-CGH per identificare le anomalie cromosomiche; in alcuni casi di AECTCL è stata applicata la GEP, che evidenzia il profilo di espressione genica delle cellule neoplastiche. I dati ottenuti sono stati valutati in modo statistico, evidenziando le alterazioni cromosomiche comuni significative di ogni entità. In CGH, sono state evidenziate alcune aberrazioni comuni fra le entità studiate, la delezione di 9p21.3, l’amplificazione di 17q, 19p13, 19q13.11-q13.32 , 12q13 e 16p13.3, che determinano la delezione dei geni CDKN2A e CDKN2B e l’attivazione del JAK/STAT signaling pathway. Altre alterazioni definiscono l’amplificazione di c-MYC (8q24) e CCND1/CDK4-6 (11q13). In particolare, sono state evidenziate numerose anomalie genomiche comuni in casi di AECTCL e PTCL/NOS pleomorfo. L’applicazione della GEP in 5 casi di AECTCL ha confermato l’alterata espressione dei geni CDKN2A, JAK3 e STAT6, che potrebbero avere un ruolo diretto nella linfomagenesi. Lo studio di un numero maggiore di casi in GEP e l’introduzione delle nuove indagini molecolari come l’analisi dei miRNA, della whole-exome e whole genome sequences consentiranno di evidenziare alterazioni molecolari correlate con la prognosi, definendo anche nuovi target terapeutici.

Cell-free cryopreserved arterial allografts from multiorgan donors: a new strategy to fabricate artificial blood vessels suited for peripheral vascular surgery

Critical lower limb ischemia is a severe disease. A common approach is infrainguinal bypass. Synthetic vascular prosthesis, are good conduits in high-flow low-resistance conditions but have difficulty in their performance as small diameter vessel grafts. A new approach is the use of native decellularized vascular tissues. Cell-free vessels are expected to have improved biocompatibility when compared to synthetic and are optimal natural 3D matrix templates for driving stem cell growth and tissue assembly in vivo. Decellularization of tissues represent a promising field for regenerative medicine, with the aim to develop a methodology to obtain small-diameter allografts to be used as a natural scaffold suited for in vivo cell growth and pseudo-tissue assembly, eliminating failure caused from immune response activation. Material and methods. Umbilical cord-derived mesenchymal cells isolated from human umbilical cord tissue were expanded in advanced DMEM. Immunofluorescence and molecular characterization revealed a stem cell profile. A non-enzymatic protocol, that associate hypotonic shock and low-concentration ionic detergent, was used to decellularize vessel segments. Cells were seeded cell-free scaffolds using a compound of fibrin and thrombin and incubated in DMEM, after 4 days of static culture they were placed for 2 weeks in a flow-bioreactor, mimicking the cardiovascular pulsatile flow. After dynamic culture, samples were processed for histological, biochemical and ultrastructural analysis. Discussion. Histology showed that the dynamic culture cells initiate to penetrate the extracellular matrix scaffold and to produce components of the ECM, as collagen fibres. Sirius Red staining showed layers of immature collagen type III and ultrastructural analysis revealed 30 nm thick collagen fibres, presumably corresponding to the immature collagen. These data confirm the ability of cord-derived cells to adhere and penetrate a natural decellularized tissue and to start to assembly into new tissue. This achievement makes natural 3D matrix templates prospectively valuable candidates for clinical bypass procedures

Caratterizzazione Citogenetico-Molecolare delle alterazioni cromosomiche 3q26 e 1p36 nelle Sindromi Mieloproliferative

L’overespressione dei geni EVI1(3q26) e PRDM16(1p36), è descritta sia in presenza che in assenza di riarrangiamenti 3q26 e 1p36 in specifici sottogruppi citogenetici di LAM, ed è associata ad una prognosi sfavorevole. Lo scopo principale del nostro studio è stato identificare e caratterizzare tramite FISH e RQ-PCR, alterazioni di EVI1 e PRDM16 in pazienti con alterazioni cromosomiche 3q e 1p.Riarrangiamenti di EVI1 si associavano ad alterazioni cromosomiche 3q26, ma, in 6 casi (6/35;17,1%) erano presenti in assenza di coinvolgimenti, in citogenetica convenzionale, della regione 3q26, a causa di meccanismi complessi e/o alterazioni ‘criptiche’. Inoltre, abbiamo identificato quattro nuovi riarrangiamenti di EVI1, tra cui due nuove traslocazioni simili presenti in due fratelli. Riarrangiamenti e/o amplificazioni di PRDM16 erano spesso associate ad alterazioni 1p36 (7/14;50%). L’analisi di EVI1 e PRDM16 è stata estesa ad altri casi con alterazioni -7/7q-, con cariotipo normale, con alterazioni 3q per PRDM16 e con alterazioni 1p per EVI1. L’overespressione di EVI1 era presente solo nel gruppo -7/7q- (10/58;17.2%) ed in un caso si associava ad amplificazione genica, mentre PRDM16 era overespresso in casi di tutti i gruppi analizzati,sia con cariotipi complessi, dove si associava in alcuni casi ad amplificazione genica, sia con cariotipi normali o con singole alterazioni. Il nostro studio dimostra come la FISH permetta di identificare alterazioni dei geni EVI1 e PRDM16, anche in assenza di coinvolgimenti delle regioni 3q26 e 1p36. Riarrangiamenti complessi e/o una scarsa qualità dei preparati citogenetici sono le cause principali per la mancata identificazione di queste alterazioni. La RQ-PCR permette di identificare l’overespressione anche nei casi in cui non sia dovuta ad alterazioni citogenetiche. È importante confermare con FISH e/o RQ-PCR il coinvolgimento di questi due geni, per individuare alla diagnosi pazienti con prognosi sfavorevole e che potranno beneficiare di terapie maggiormente aggressive e/o di trapianto allogenico di cellule staminali.