Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign

Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit-Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen.

Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

MODULATION OF HOST INTESTINAL MYOELECTRIC ACTIVITY BY LOCAL ANAPHYLAXIS: A COMPONENT OF PROTECTIVE IMMUNITY TO AN ENTERIC PARASITE (TRICHINELLA SPIRALIS, EIMERIA NIESCHULZI, BOWEL MOTILITY)

The hypothesis tested was that rapid rejection of Trichinella spiralis infective larvae from immunized rats following a challenge infection is associated with a local anaphylactic reaction, and this response should be reflected in altered small intestinal motility. The objective was to determine if altered gut smooth muscle function accompanies worm rejection based on the assumption that anaphylaxis in vivo could be detected by changes in intestinal smooth muscle contractile activity (ie. an equivalent of the Schultz-Dale reaction or in vitro anaphylaxis). The aims were to (1) characterize motility changes by monitoring intestinal myoelectric activity in conscious rats during the enteric phase of T. spiralis infection in immunized hosts, (2) detect the onset and magnitude of myoelectric changes caused by challenge infection in immunized rats, (3) determine the parasite stimulus causing changes, and (4) determine the specificity of host response to stimulation. Electrical slow wave frequency, spiking activity, normal interdigestive migrating myoelectric complexes and abnormal migrating action potential complexes were measured. Changes in myoelectric parameters induced by larvae inoculated into the duodenum of immune hosts differed from those associated with primary infection with respect to time of onset, magnitude and duration. Myoelectric changes elicited by live larvae could not be reproduced by inoculation of hosts with dead larvae, larval excretory-secretory products, or by challenge with a heterologous parasite, Eimeria nieschulzi. These results indicate that (1) local anaphylaxis is a component of the initial response to T. spiralis in immune hosts, since the rapid onset of altered smooth muscle function parallels in time the expression of rapid rejection of infective larvae, and (2) an active mucosal penetration attempt by the worm is necessary to elicit this host response. These findings provide evidence that worm rejection is a consequence of, or sequel to, an immediate hypersensitivity reaction elicited when parasites attempt to invade the gut mucosa of immunized hosts. ^

High-resolution electrophoretic procedures for the identification of five Eimeria species from chickens, and detection of population variation

To overcome limitations of conventional approaches for the identification of Eimeria species of chickens, we have established high resolution electrophoretic procedures using genetic markers in ribosomal DNA. The first and second internal transcribed spacer (ITS-1 and ITS-2) regions of ribosomal DNA were amplified by polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA samples representing five species of Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. necatrix and E. tenella), denatured and then subjected to denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (D-PAGE) or single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Differences in D-PAGE profiles for both the ITS-1 and ITS-2 fragments (combined with an apparent lack of variation within individual species) enabled the unequivocal identification of the five species, and SSCP allowed the detection of population variation between some isolates representing E. acervulina, which remained undetected by D-PAGE. The establishment of these approaches has important implications for controlling the purity of laboratory lines of Eimeria, for diagnosis and for studying the epidemiology of coccidiosis.

Novo registro e novas espécies de Cerambycinae (Coleoptera, Cerambycidae) de Trinidad and Tobago e da Venezuela

Novas espécies descritas de Trinidad and Tobago: Plocaederus dozieri sp. nov. (Cerambycini, Cerambycina), Anelaphus trinidadensis sp. nov. (Elaphidionini), Piezocera rufula sp. nov. (Piezocerini), Assycuera marcelae sp. nov. and Ceralocyna venusta sp. nov. (Trachyderini, Ancylocerina). Neocompsa pallida sp. nov. (Ibidionin) é descrita de Trinidad and Tobago e da Venezuela. Ommata (O.) gallardi Peñaherrera & Tavakilian, 2004 (Rhinotragini), descrita originalmente da Guiana Francesa, é registrada para Trinidad and Tobago.

Resistance to antiparasitic drugs: The role of molecular diagnosis

Chemotherapy is central to the control of many parasite infections of both medical and veterinary importance. However, control has been compromised by the emergence of drug resistance in several important parasite species. Such parasites cover a broad phylogenetic range and include protozoa, helminths and arthropods. In order to achieve effective parasite control in the future, the recognition and diagnosis of resistance will be crucial. This demand for early, accurate diagnosis of resistance to specific drugs in different parasite species can potentially be met by modern molecular techniques. This paper summarises the resistance status of a range of important parasites and reviews the available molecular techniques for resistance diagnosis. Opportunities for applying successes in some species to other species where resistance is less well understood are explored. The practical application of molecular techniques and the impact of the technology on improving parasite control are discussed. (C) 2002 Australian Society for Parasitology Inc. Published by Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

Aspectos ultraestruturais do processo de divisão do Toxoplasma gondii

Neste trabalho é feita uma revisão sobre alguns aspectos biológicos do Toxoplasma gondii, principalmente sobre a ultraestrutura da forma interfásica e as modificações ultraestruturais que ocorrem no parasito durante o seu processo de divisão. Considera-se inicialmente o processo de divisão binária admitindo-se, porém, a possibilidade de que as imagens interpretadas como senão de divisão binária representem estágios da divisão por endodiogenia. Quanto à endodiogenia descrevem-se as alterações que ocorrem na "parasito mãe" durante o processo de formação dos dois "parasitos filhos". Este processo é semelhante no Toxoplasma gondii, Besnoitia jellisoni, Sarcocystis tenella e Frenkelia. Discute-se a possibilidade da formação de mais de dois "parasitos filhos" por um processo de endopoligenia, bem como o processo de esquizogonia. Os resultados mais recentes mostram que não existe esquizogonia nas formas vsgetativas do Toxoplasma gondii, senão que as imagens interpretadas como tal, ao microscópio ótico, são o resultado de endodiogenias sucessivas em que os endozoitas formados permanecem ligados entre si pela região posterior. A esquizogonia é, no entanto, encontrada nas formas que se desenvolvem no interior de células epiteliais do intestino do gato, que é o hospedeiro definitivo do Toxoplasma gondii. Discute-se o conceito de esquizogonia, comparando-o em três protozoários: Eimeria bovis, E. callospermophili e Plasmodium juxtanucleare, que apresentam diferenças entre si quanto ao processo de iniciação da individualização dos "parasitos filhos". Refere-se à recente hipótese que considera a endodiogenia como o processo fundamental de divisão dos esporozoárlos, ocorrendo na fase final da esquizogonia. Finalmente é acentuado o papel que a microscopia eletrônica aliada às modernas técnicas de citoquímica e imunocitoquimica poderá desempenhar no sentido de um melhor conhecimento da biologia do Toxoplasma gondii e da fisiopatogenia da Toxoplasmose.

Epidemiologia de um caso de doença de Chagas na Ilha do Mosqueiro - Pará

Os autores apresentam os resultados do estudo epidemiológico de um caso autóctone da fase aguda da doença de Chagas na ilha do Mosqueiro, Estado do Pará, aproximadamente 75km da capital, Belém. 0 caso já havia sido objeto de uma publicação anterior. Agora são apresentadas informações epidemiológicas. Nas proximidades da casa do paciente foram capturados em duas palmeiras de Inajá ('Maximilian regi ay e em uma de Mucajá (Acrocomia sclerocarpia) 114 triatomíneos: Rhodnius pictipes, R. robustus, Panstrongylus lignarius, P. geniculatus e Microtriatoma trinidadensis, com tripanossomas em 31 deles. Na casa do paciente foram encontrados exemplares de Rhodnius pictipes, infectados com formas metacíclicas do Trypanosoma cruzi. Em 14 marsupiais, capturados na localidade, haviam 3 infectados com organismos semelhantes ao T. cruzi. A eletroforese dos isoenzimas nos tripanossomas isolados do paciente, de R. pictipes e de Didelphis marsupialis os classificou como zimodema 1. Os autores concluem que a doença de Chagas do paciente teve origem silvestre.