Efeitos da dupla transgenia do eixo somatotrópico (GH/GHR) sobre aspectos estruturais e moleculares do sistema imunológico do peixe-zebra (Danio rerio)

O desenvolvimento de organismos transgênicos para o hormônio do crescimento (GH) tem sido considerado uma importante alternativa para o aumento nas taxas de crescimento animal. Entretanto, os efeitos do excesso do GH não se limitam aos processos do crescimento. Sistemas fisiológicos como o sistema imunológico, já demonstraram ser prejudicados pelo desbalanço dos níveis do GH. Tendo em vista a importância da geração de organismos transgênicos para o GH no âmbito da aquicultura, esforços se fazem necessários na elaboração de estratégias com o intuito de reduzir ou compensar os efeitos adicionais do excesso de GH. Nos hipotetizamos que a geração de peixes duplo transgênicos os quais superexpressem GH e GHR apenas no músculo esquelético, poderia ser uma possível alternativa para compensar os efeitos prejudiciais ocasionados pelo excesso de GH sobre os sistemas fisiológicos mantendo, ao mesmo tempo, as altas taxas de crescimento. Afim de testar esta hipótese, nós avaliamos a morfometria de órgãos imunes, como o timo, o rim cefálico e o baço; os conteúdos de células T CD3+ e CD4+ no timo e no rim anterior e a expressão de genes relacionados à imunidade. Contrariando as expectativas iniciais, os resultados revelaram que a superexpressão do GHR no músculo esquelético não é capaz de diminuir os efeitos danosos causados pelo GH no tamanho do timo e rim anterior e no conteúdo de células T CD3+ e CD4+ nestes órgãos. Inesperadamente, zebrafish transgênicos somente para o GHR revelaram prejuízos nos aspectos imunes similares aos observados aos transgênicos para GH. De forma geral, estes resultados indicam que a dupla transgenia para o GH/GHR não é capaz de atenuar os efeitos negativos causados pelo excess de GH sobre o sistema imunológico de zebrafish transgênicos. Além disso, a transgenia para genes componentes do eixo somatotrófico pode ainda reforçar os danos as funções imunes em transgênicos, não recuperando os danos causados pelo excesso de GH.

Efeito da exposição ao herbicida glifosato sobre parâmetros bioquímicos, moleculares e espermáticos do peixe Danio rerio

Agroquímicos são amplamente utilizados na atividade agrícola com o objetivo de aumentar a produção e melhorar a qualidade dos alimentos, no entanto podem vir a gerar danos ao meio ambiente e a organismos não-alvo. Dentre esses pesticidas encontra-se o herbicida glifosato, o qual vem sendo mais utilizado mundialmente. Seu mecanismo de ação se dá através da inibição da enzima 5-enolpiruvilshikimato-3- fosfatosintase, intermediária da síntese de aminoácidos aromáticos essenciais em plantas. Pouco se sabe sobre os efeitos da substância glifosato em animais, pois os estudos realizados visam principalmente os efeitos da formulação comercial, a qual contém surfactantes e outras substâncias inertes. Tendo isso em vista, esse estudo avaliou o efeito do glifosato no teleósteo Danio rerio considerando parâmetros de estresse oxidativo, atividade e expressão da acetilcolinesterase e parâmetros reprodutivos. Foram feitas exposições a 5 mg/L e 10 mg/L de glifosato, mais um grupo controle por 24 e 96 horas, somente com peixes machos. Para análise bioquímica foram retirados cérebro, brânquias e músculo; para análise molecular, cérebro e músculo; e para análise na qualidade espermática dos peixes, os testículos. Quanto às análises bioquímicas houve um aumento na capacidade antioxidante contra radicais peroxil nas brânquias na concentração de 5 mg/L após 24 horas de exposição; uma redução na peroxidação lipídica no cérebro na maior concentração (10 mg/L) após 24h e um aumento da mesma em músculo, também em 10 mg/L, após 96 horas. Não foi observada alteração na geração de espécies reativas de oxigênio decorrente da exposição ao glifosato, assim como na atividade da enzima acetilcolinesterase; já na expressão gênica desta enzima houve uma diminuição no cérebro após 24 horas de exposição e um aumento no cérebro e no músculo após 96 horas. Quanto à qualidade espermática dos peixes, houve uma redução na motilidade e período de motilidade dos espermatozóides nas concentrações de 5 mg/L e 10 mg/L em ambos tempos de exposição; na concentração de 10 mg/L ainda houve uma redução da funcionalidade mitocondrial, integridade de membrana do espermatozóide e integridade de DNA após 24 e 96 horas. Sendo assim, o glifosato se mostrou capaz de alterar o balanço oxidativo dos tecidos do peixe Danio rerio bem como alterar significativamente a expressão gênica da enzima acetilcolinesterase. Além disso, nossos resultados demonstram que o glifosato pode interferir na reprodução deste animal, através da redução de sua qualidade espermática.

Avaliação transcricional de Glutationas -transferases em PEIXE-ZEBRA (Danio rerio) e alterações causadas pela exposição á Microcistina-LR

As Microcistinas são heptapeptídios cíclicos produzidos como metabólitos secundários por diferentes espécies de cianobactérias, sendo relevantes pelo seu potencial hepatotóxico. Peixes apresentam estratégias bioquímicas para detoxificar contaminantes ambientais, incluindo a ativação de enzimas de fase II de biotransformação, que incluem as isoformas de glutationa S-transferase (GST). As GST catalizam a conjugação de glutationa reduzida (GSH) com uma variedade de xenobióticos, incluindo as microcistinas. O presente estudo avaliou os níveis transcricionais de quinze isoformas de GST a fim de identificar isoformas possivelmente envolvidas na detoxificação de contaminantes ambientais como a microcistina-LR (MC-LR) em Danio rerio. A técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR) foi utilizada para avaliação dos níveis transcricionais, permitindo análise das GST em diferentes órgãos, abundância e a ativação/repressão das isoformas de GST pela exposição à MC-LR. Foram avaliados os possíveis efeitos causados em brânquia e fígado após exposição por 24 hs às concentrações de 5 µg.L-1 e 50 µg.L-1 de MC-LR. Baseado nos scores de estabilidade para oito genes normalizadores, foram selecionados glicose-6-fosfato desidrogenase (g6pdh), β-actina1 e beta-2-microglobulina (b2m); b2m, alfa-tubulina 1 (tuba) e β- actin1; e tuba, b2m e g6pdh, para normalização dos níveis trancricionais de GST para distribuição órgão-específica, abundância e efeito da MC-LR em brânquia e fígado, respectivamente. A avaliação transcricional da distribuição órgão-específica revelou níveis significativos de gstal e gstk1.1 no fígado; gstp1 e gstp2 em brânquia; mgst3a, gstr1, gstm2, gstm33, gstp1, gstp2 e gstk1.1 no intestino; gstm2, gstm3 e gstal no olho e gstt1a e gsta2.1 no cérebro. Considerando os níveis de transcritos para um dado órgão, gstk1.1, gstal, gstp1 e gstt2 foram mais abundantes nos órgãos de detoxificação, tais como o fígado, brânquias e intestino, enquanto gstt1a e gsta2.1 foram mais abundantes no rim. Em brânquia, gsta2.1 e gstt1b foram reprimidas por 5 µg.L-1 de MC-LR e mgst1.1 foi reprimida em 50 µg.L-1 de MC-LR. No fígado, as isoformas gst2.2 e gstp2 foram reprimidas em ambas as concentrações, gstal foi reprimida em 5 µg.L-1, e gstt1a e gstk1.1 foram reprimidas em 50 µg.L-1 de MC-LR. As isoformas gstal, gstr1, gstp1, mgst3a, gstm1, gstm2 e gstm3 não foram alteradas pela exposição a MC-LR. Os resultados obtidos fornecem informações para a escolha de isoformas específicas de GST possivelmente envolvidas na detoxificação/toxicidade de MC-LR, a serem melhores caracterizadas ao nível protéico e também contribui para a escolha de genes normalizadores a serem utilizados em outros estudos da mesma natureza

Toxicidad aguda y efecto bioacumulativo del fungicida Tebucconazol en el pez cebra (Danio rerio).

2009

Whole-body cortisol increases after direct and visual contact with a predator in zebrafish, Danio rerio

Ornamental fish may be severely affected by a stressful environment. Stressors impair the immune response, reproduction and growth rate; thus, the identification of possible stressors will aid to improve the overall quality of ornamental fish. The aim of this study was to determine whole-body cortisol of adult zebrafish, Danio rerio, following visual or direct contact with a predator species. Zebrafish were distributed in three groups: the first group, which consisted of zebrafish reared completely isolated of the predator, was considered the negative control; the second group, in which the predator, Parachromis managuensis was stocked together with zebrafish, was considered the positive control; the third group consisted of zebrafish stocked in a glass aquarium, with direct visual contact with the predator. The mean whole-body cortisol concentration in zebrafish from the negative control was 6.78 +/- 1.12 ng g(-1), a concentration statistically lower than that found in zebrafish having visual contact with the predator (9.26 +/- 0.88 ng g(-1)) which, in turn, was statistically lower than the mean whole-body cortisol of the positive control group (12.35 +/- 1.59 ng g(-1)). The higher whole-body cortisol concentration found in fish from the positive control can be attributed to the detection, by the zebrafish, of relevant risk situations that may involve a combination of chemical, olfactory and visual cues. One of the functions of elevated cortisol is to mobilize energy from body resources to cope with stress. The elevation of whole-body cortisol in fish subjected to visual contact with the predator involves only the visual cue in the recognition of predation risk. We hypothesized that the zebrafish could recognize predator characteristics in P managuensis, such as length, shape, color and behavior. Nonetheless, the elevation of whole-body cortisol in zebrafish suggested that the visual contact of the predator may elicit a stress response in prey fish. This assertion has a strong practical application concerning the species distribution in ornamental fish markets in which prey species should not be allowed to see predator species. Minimizing visual contact between prey and predator fish may improve the quality, viability and welfare of small fish in ornamental fish markets. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Avaliação ecotoxicológica de efluentes industriais utilizando Danio rerio Hamilton-Buchanan, 1822 (TELEOSTEI, CYPRINIDAE)

The industrial effluents are one of the main sources of water pollution. For an appropriate characterization and control of their discharges, the most efficient strategy is the integrated use of chemical, physical and ecotoxicological analyses. The aims of this study were to asses the efficiency of the treatment plant of a textile industry performing acute toxicity tests and physical-chemical analyses of the effluents before and after the treatment, besides evaluate the toxicity of the effluents of the Treatment System of Liquids Effluents (Sistema de Tratamento de Efluentes Líquidos - SITEL) of Distrito Industrial de Natal (DIN) and some of their physical-chemical variables. The species used in the ecotoxicological tests was the fish Danio rerio. The results showed that the treatment plant reduced significantly (around 50%) the toxicity of the raw textile effluent in only three of the seven tests but, in general, it promoted the reduction of the physical-chemical parameters analyzed. The toxicity and the physical-chemical factors of the effluents of SITEL of DIN varied among the tests and show the importance of monitoring their discharges in the Potengi river, one of the most important rivers of the Rio Grande do Norte state

Investigação e avaliação da toxicidade aguda dos agrotóxicos mais utilizados no cinturão verde da Grande Natal (RN, Brasil) para o peixe-zebra (Danio rerio Hamilton Buchanan, 1822, Teleostei, Cyprinidae

The objectives of this research were to investigate the agrotoxic most used in the Gramorezinho region in the green belt of Natal, and to evaluate the acute toxicity of these, based on the LC50-48h values estimated in tests for Danio rerio, internationally used as test organism. The acute toxicity tests were performed under laboratory conditions, according to standardized methods (ABNT/NBR/15088/04) for this species. The LC50-48h estimated to Tamaron BR was 352.89 mg.L-1, which characterizes that as practically non-toxic, according to toxicological classes cited by Zucker. For Decis 25EC, the LC50-48h estimated was 0.0004156 mg.L-1 (4.156 X 10-4 mg.L-1), which classifies it as highly toxic to this species

Avaliação da toxicidade aguda do inseticida metomil e o seu efeito sobre a atividade da acetilcolinesterase do peixe Danio rerio

Methomyl (Lannate®) is an insecticide from the carbamate group, frequently used in pest control in various types of crops. This compound works inhibiting the activity of the enzyme acetylcholinesterase. The use of physicochemical and ecotoxicological analysis is the most efficient strategy for the correct characterization and control of residues of metomil. The main objectives of this study were to evaluate the acute toxicity of methomyl in 96 hours of exposure and, through a sublethal assay of 5 hours, to assess its effect on the activity of acetylcholinesterase present in brain and squeletic dorsal muscle of the Danio rerio fish. The results showed that the LC50-96 found to D. rerio was 3.4 mg/L and it was found through the average of four definitive tests. In vitro assays were used to test the inhibitory action of methomyl directly over soluble AChE, extracted from the squeletic dorsal muscle, with maximum inhibition of 68.57% to the insecticide concentrations of 0.2 mg/L. In sublethal tests with D. rerio, inhibitory effect of methomyl was found over the soluble form of AChE in the squeletic dorsal muscle, both in one and five hours of fish exposure to the insecticide. In both period, the average values of inhibition were around 61%. In the same condition, no significant inhibitory effect of methomyl soluble and membrane AChE of the D. rerio was observed in the 0.42, 0.85, 1.70 and 2.50 mg/L concentrations and in both times of fish exposure

Bioconcentration of tebuconazole fungicide in zebrafish (Danio rerio).

2008

Ruolo del gene umano CYYR1: dallo studio funzionale dell'ortologo in Danio rerio alla potenziale implicazione in processi tumorigenici

Il locus CYYR1 identificato e clonato sul cromosoma 21 umano è stato caratterizzato dal punto di vista molecolare come un sistema multitrascritto, esclusivo dei vertebrati che ad oggi è orfano di una funzione specifica. Dati presenti in lettura e rintracciati mostrano una possibile relazione tra il gene CYYR1 e il pathway di Sonic Hedgehog (SHH). In questo progetto di tesi è stato utilizzato il modello animale Danio rerio per indagare il ruolo funzionale dell’ortologo (cyyr1), attraverso esperimenti di gain e loss of function che hanno permesso di dimostrare un suo coinvolgimento nello sviluppo del sistema nervoso centrale, del cuore e del tessuto muscolare. Lo studio dell’ortologo in zebrafish è stato associato all’utilizzo di linee cellulari di rabdomiosarcoma umano. I risultati ottenuti dall’induzione al differenziamento miogenico di queste linee, insieme ai dati ottenuti in Danio rerio, confermano il possibile coinvolgimento del gene CYYR1 nella miogenesi. Lo studio delle relazione tra il pathway di SHH e l’espressione del gene CYYR1 è stato condotto in entrambi i modelli con l’utilizzo di differenti inibitori della via di segnalazione. I risultati ottenuti mostrano che sistemi inibitori agenti direttamente sul recettore SMO riducono l’espressione del gene. Un dato inaspettato in Danio rerio ottenuto durante questi esperimenti di inibizione, ha aperto una nuova linea di ricerca in collaborazione con l’Università di Warwick tesa a verificare la relazione tra il gene cyyr1 e il gene lefty1. Gli esperimenti condotti presso il laboratorio della Prof.ssa Sampath hanno dimostrato la localizzazione del prodotto proteico cyyr1 in Danio rerio e indagato co-localizzazioni con la proteina lefty1. Infine, in collaborazione con Dr. Deflorian e della Prof.ssa Pistocchi, è stato generato un mutante di Danio rerio deleto per il gene cyyr1 con la tecnica CRISPR/Cas9. La caratterizzazione del mutante cyyr1 -/- ha confermato alcuni dei dati ottenuti attraverso esperimenti di loss of function.

Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis

Scototaxis, the preference for dark environments in detriment of bright ones, is an index of anxiety in zebrafish. In this work, we analyzed avoidance of the white compartment by analysis of the spatiotemporal pattern of exploratory behavior (time spent in the white compartment of the apparatus and shuttle frequency between compartments) and swimming ethogram (thigmotaxis, freezing and burst swimming in the white compartment) in four experiments. In Experiment 1, we demonstrate that spatiotemporal measures of white avoidance and locomotion do not habituate during a single 15-min session. In Experiments 2 and 3, we demonstrate that locomotor activity habituates to repeated exposures to the apparatus, regardless of whether inter-trial interval is 15-min or 24-h; however, no habituation of white avoidance was observed in either experiment. In Experiment 4, we confined animals for three 15-min sessions in the white compartment prior to recording spatiotemporal and ethogram measures in a standard preference test. After these forced exposures, white avoidance and locomotor activity showed no differences in relation to non-confined animals, but burst swimming, thigmotaxis and freezing in the white compartment were all decreased. These results suggest that neither avoidance of the white compartment nor approach to the black compartment account for the behavior of zebrafish in the scototaxis test. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Conspecific and heterospecific alarm substance induces behavioral responses in piau fish Leporinus piau

In ostariophysan fish, the detection of alarm substance released from the skin of a conspecific or a sympatric heterospecific may elicit alarm reactions or antipredator behavioral responses. In this study, experiments were performed to characterize and quantify the behavioral response threshold of Leporinus piau, both individually and in schools, to growing dilutions of conspecific (CAS) and heterospecific skin extract (HAS). The predominant behavioral response to CAS stock stimulation was biphasic for fish held individually, with a brief initial period of rapid swimming followed by a longer period of immobility or reduced swimming activity. As the dilution of skin extract was increased, the occurrence and magnitude of the biphasic alarm response tended to decrease, replaced by a slowing of locomotion. Slowing was the most common antipredator behavior, observed in 62.5% of animals submitted to HAS stimulation. School cohesion, measured as proximity of fish to the center of the school, and swimming activity near the water surface significantly increased after exposure to CAS when compared with the control group exposed to distilled water. Histological analysis of the epidermis revealed the presence of Ostariophysi-like club cells. The presence of these cells and the behavioral responses to conspecific and heterospecific skin extract stimulation suggest the existence of a pheromone alarm system in L. piau similar to that in Ostariophysi, lending further support for the neural processing of chemosensory information in tropical freshwater fish.

Contribuição para o estudo dos efeitos de descargas orgânicas em peixes

O principal objectivo deste trabalho foi avaliar os efeitos resultantes de diferentes tipos de descargas orgânicas, em frentes de descarga e instantâneas, na espécie Danio rerio, um peixe de água doce geralmente utilizado para avaliações de toxicidade. Para a simulação das descargas, utilizou-se um efluente sintético, que reproduz, aproximadamente, a composição de uma água residual doméstica, e um canal hidráulico laboratorial. Determinou-se a CL50, através de testes semi-estáticos, sob condições laboratoriais controladas, ao longo de 96 horas, tendo-se obtido o valor de 309 mg O2.L-1 (CQO). Para além de ensaios de dispersão de um corante no canal hidráulico, para melhor percepção do avanço de uma descarga, efectuaram-se ensaios simulando frentes de descarga e descargas instantâneas. Estes ensaios foram realizados com o efluente sintético, em diferentes condições, observando-se a evolução de concentrações no canal e relacionando-as com o comportamento do peixe referido na presença do agente poluente. Os resultados permitem concluir, através do comportamento observado dos peixes, que a intensidade de resposta, por afastamento ao contacto com a descarga orgânica, varia directamente com a concentração desta no meio, tendo sido possível obter curvas aproximadas para descrição daquela resposta. Assim, tendo-se constatado que para baixas concentrações a resposta é pouco acentuada, pode inferir-se do risco que lhe poderá estar associado, levando os peixes a permanecerem em situações de contaminação potencial com eventuais efeitos acumulativos.

Implementation of a zebrafish health program in a research facility : A 4-year retrospective study

In the past two decades, zebrafish (Danio rerio)-based research has contributed to significant scientific advances. Still, husbandry and health programs did not evolve at the same pace, as evidenced by the absence of general guidelines. Health monitoring is essential to animal welfare, to permit animal exchanges across facilities, to contribute to robust experimental results, and for data reproducibility. In this study, we report a health program implemented in a zebrafish research facility to prevent, monitor, and control pathogen, and disease dissemination. This program includes quarantine, routine health screening of sentinels, and nonroutine screenings of retired animals and sick/moribund individuals. An extensive list of clinical signs, lesions, and pathogens was monitored based on: daily observation of fish, necropsy, histology, and bacterial culture. The results indicate that the combined analysis of sentinels with the evaluation of sick/moribund animals enables a comprehensive description not only of pathogen prevalence but also of clinical and histopathologic lesions of resident animals. The establishment of a quarantine program revealed to be effective in the reduction of Pseudoloma neurophilia frequency in the main aquaria room. Finally, characterization of the colony health status based on this multiapproach program shows a low prevalence of lesions and pathogens in the facility.

Usefulness of zebrafish model to assess glomerular and tubular alterations induced by tenofovir

Tenofovir (TFV) is one of the most used antiretroviral drugs. However, it is associated with tubular damage with mitochondria as a possible target. Tubulopathy precedes glomerular dysfunction, thus classic markers of renal function like the glomerular filtration rate (GFR) do not detect early TFV damage. Prediction and management of drug induced renal injury (DIRI) rely on the mechanisms of the drug insult and in optimal animal models to explore it. Zebrafish (Danio rerio) offers unique advantages for assessing DIRI, since the pronephros is structurally very similar to its human counterpart and is fully developed at 3.5 days postfertilization. The main aim of the present work was to evaluate the effects of TFV, as well as its pro-drug, tenofovir disoproxil fumarate (TDF), on the GFR and in mitochondria morphology in tubular cells of zebrafish larvae. Lethality curves were performed to understand the relationship between drug concentration and lethality. LC10 was selected to explore the renal function using the FITC-inulin assay and to analyze the mitochondrial toxicity by electron microscopy on larvae exposed to TDF, TFV, paracetamol and gentamicin (positive controls) or water (negative control). Lethality curves showed that gentamicin was the most lethal drug, followed by TDF, TFV and paracetamol. Gentamicin and paracetamol decreased the GFR, but no differences were found for either TDF or TFV, when compared to controls (%FITC Control = 33±8; %FITC TDF = 35±10; %FITC TFV = 30±10; %FITC Gentamicin = 46±17; %FITC Paracetamol = 83±14). Tubular mitochondria from treated larvae were notably different from non-treated larvae, showing swelling, irregular shapes, decreased mitochondria network, cristae disruption and loss of matrix granules. These results are in agreement with the effects of these drugs in humans and thus, demonstrate that zebrafish larvae can be a good model to assess the functional and structural damage associated with DIRI.