Molecular genetics of narcolepsy

1 Abstract Sleep is a vital necessity, yet its basic physiological function is still unknown, despite numerous studies both in healthy humans and animal models. The study of patients with sleep disorders may help uncover major biological pathways in sleep regulation and thus shed light on the actual function of sleep. Narcolepsy is a well defined but rare sleep disorder characterized by excessive daytime sleepiness and cataplexy, thought to be caused by a combination of genetic and environmental factors. The aim of this work was to identify genes or genetic variants, which contribute to the pathogenesis of sporadic and familial narcolepsy. Sporadic narcolepsy is the disorder with the strongest human leukocyte antigen (HLA) association ever reported. Since the associated HLA-DRB1 *1501-DQB1 *0602 haplotype is common in the general population (15-25%), it has been suggested that it is necessary but not sufficient for developing narcolepsy. To further define the genetic basis of narcolepsy risk, we performed a genome-wide association study (GWAS) in 562 European individuals with narcolepsy (cases) and 702 ethnically matched controls, with independent replication in 370 cases and 495 controls, all heterozygous for DRB1*1501-DQB1*0602. We found association with a protective variant near HLA-DQA2. Further analysis revealed that the identified SNP is strongly linked to DRB1*03-DQB1*02 and DRBΠ 301-DQB1*0603. Cases almost never carried a trans DRB1*1301-DQB1*0603 haplotype. This unexpected protective HLA haplotype suggests a causal involvement of the HLA region in narcolepsy susceptibility. Familial cases of narcolepsy account for 10% of all narcolepsy cases. However, due to low number of affected family members, narcolepsy families are usually not eligible for genetic linkage studies. We identified and characterized a large Spanish family with 11 affected family members representing the largest ever reported narcolepsy family. We ran a genetic linkage analysis using DNA of 11 affected and 15 unaffected family members and hereby identified a chromosomal candidate region on chromosome 6 encompassing 163 kb with a maximum multipoint LOD score of 5.02. The coding sequences of 4 genes within this haplotype block as well as 2 neighboring genes were screened for pathogenetic mutations in 2 affected and 1 healthy family members. So far no pathogenic mutation could be identified. Further in-depth sequencing of our candidate region as well as whole genome exome sequencing are underway to identify the pathogenic mutation(s) in this family and will further improve our understanding of the genetic basis of narcolepsy. 2 Résumé Le sommeil est un processus vital, dont la fonction physiologique est encore inconnue, malgré de nombreuses études chez des sujets humains sains ainsi que dans des modèles animaux. L'étude de patients souffrant de troubles du sommeil peut permettre la découverte de voies biologiques jouant un rôle majeur dans la régulation du sommeil. L'un de ces troubles, la narcolepsie, est une maladie rare mais néanmoins bien définie, caractérisée par une somnolence diurne excessive accompagnée de cataplexies. Les connaissances actuelles suggèrent qu'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux en est à l'origine. Le but du présent travail était d'identifier !e(s) gène(s) ou les polymorphismes constituant des facteurs de risque dans les formes sporadique et familiale de narcolepsie. La narcolepsie sporadique est la maladie possédant la plus forte association avec le complexe majeur d'histocompatibilité humain (HLA) jamais reportée. La fréquence au sein de la population générale de l'haplotype associé HLA-DRB1*1501- DQB1*0602 (15-25%) suggère que ce dernier est nécessaire, mais pas suffisant, pour (e développement de la maladie. Nous avons voulu approfondir la recherche de facteurs génétiques augmentant le risque de la narcolepsie. A cette fin, nous avons entrepris une étude d'association à l'échelle du génome (genome-wide association study, GWAS) parmi 562 sujets narcoleptiques européens (cas) et 702 individus contrôle de même origine ethnique et nous avons trouvé une association avec un variant protecteur près du gène HLA- DQA2. Ce résultat a été répliqué indépendamment dans 370 cas et 495 contrôles, tous hétérozygotes au locus DRB1*1501-DQB1*0602. Une analyse plus fine montre que le polymorphisme identifié est fortement lié aux allèles DRB1*03-DQB1*02 et DRB1*1301-DQB1*0603. Nous notons que seul un cas était porteur d'un haplotype en trans DRB1*1301-DQBr0603. La découverte de cet allele HLA protecteur suggère que la région HLA joue un rôle causal dans la susceptibilité à la narcolepsie. Dix pourcents des cas de narcolepsie sont familiaux. Cependant, le faible nombre de membres affectés rend ces familles inéligibles pour des études de liaison génétique. Nous avons identifié et caractérisé une grande famille espagnole, dont 11 membres sont atteints par la maladie, ce qui représente la plus grande famille narcoleptique rapportée jusqu'à ce jour. A partir de l'ADN de 11 membres atteints et 15 non- atteints, nous avons identifié par étude de liaison une région candidate de 163 kîlobases (kb) sur le chromosome 6, correspondant à un LOD score multipoints de 5.02. Nous avons cherché, sans succès, des mutations pathogéniques dans la séquence codante de deux gènes situés à l'intérieur de ce segment, ainsi que 4 gènes adjacents. Un séquençage plus approfondi de la région ainsi que le séquençage des exons de tout le génome est en cours et doit s'avérer plus fructueux et révéler la ou tes mutation(s) pathogénique(s) dans cette famille, ce qui contribuerait à une meilleure compréhension des causes génétiques de la narcolepsie. 3 Résumé pour un large public Le sommeil est une nécessité vitale, dont le rôle physiologique exact reste inconnu malgré de nombreuses études sur des sujets humains sains ainsi que sur des modèles animaux. C'est pourquoi les troubles du sommeil intéressent les chercheurs, car l'élucidation des mécanismes responsables peut permettre de mieux comprendre le fonctionnement du sommeil normal. La narcolepsie est une maladie du sommeil caractérisée par une somnolence diurne excessive. Les personnes atteintes peuvent s'endormir involontairement à tout moment de la journée, et souffrent également de pertes du tonus musculaire (cataplexie) lors de fortes émotions, par exemple un fou rire. La narcolepsie est une maladie rare, apparaissant dans 1 personne sur 2000. Les connaissances actuelles suggèrent qu'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux en est à l'origine. Nous avons voulu identifier les facteurs génétiques influençant le déclenchement de la maladie, d'abord dans sa forme sporadique, puis dans une famille comptant de nombreux membres atteints. En comparant les variations génétiques de près de 1000 sujets narcoleptiques européens avec ceux de 1200 individus sains, nous avons trouvé chez 30% de ces derniers un variant protecteur, qui diminue de 50 fois le risque de développer la maladie, ce qui constitue le plus puissant facteur génétique protecteur décrit à ce jour. Nous avons ensuite étudié une grande famille espagnole comptant une trentaine de membres, dont 11 sont atteints de narcolepsie. De nouveau, nous avons comparé les variations génétiques des membres atteints avec ceux des membres sains. Nous avons ainsi pu identifier une région dans le génome où se trouverait le(s) gène(s) impliqué(s) dans la maladie dans cette famille, mais n'avons pas encore trouvé le(s) variant(s) exact(s). Une étude plus approfondie devrait permettre de P(les) identifier et ainsi contribuer à l'élucidation des mécanismes menant au développement de la narcolepsie.

Control of gene expression in melanocytes and RPE by conserved distal regulatory elements

Résumé Durant le développement embryonnaire, les cellules pigmentaires des mammifères se développent à partir de deux origines différentes : les melanocytes se développent à partir de la crête neurale alors que les cellules de la rétine pigmentaire (RP) ont une origine neuronale. Un grand nombre de gènes sont impliqués dans la pigmentation dont les gènes de la famille tyrosinase à savoir Tyr, Tyrp1 et Dct. Certaines études ont suggéré que les gènes de la pigmentation sont régulés de manière différentielle dans les mélanocytes et dans la RP. Dans ce travail, les gènes de la famille tyrosinase ont été étudiés comme modèle de la régulation des gènes de la pigmentation par des éléments régulateurs agissant à distance. II a été montré que le promoteur du gène Tyrp1pouvait induire l'expression d'un transgène uniquement dans la RP alors que ce gène est aussi exprimé dans les mélanocytes comme le montre le phénotype des souris mutantes pour Tyrp1. Ce résultat suggère que les éléments régulateurs du promoteur sont suffisants pour l'expression dans la RP mais pas pour l'expression dans les mélanocytes. J'ai donc cherché à identifier la séquence qui régule l'expression dans les mélanocytes. Un chromosome artificiel bactérien (CAB) contenant le gène Tyrp1 s'est avéré suffisant pour induire l'expression dans les mélanocytes, comme démontré par la correction du phénotype mutant. La séquence de ce CAB contient plusieurs régions très conservées qui pourraient représenter de nouveaux éléments régulateurs. Par la suite, j'ai focalisé mon analyse sur une séquence située à -I5 kb qui s'est révélée être un amplificateur spécifique aux mélanocytes comme démontré par des expériences de cultures cellulaire et de transgenèse. De plus, une analyse poussée de cet élément a révélé que le facteur de transcription Sox 10 représentait un transactivateur de cet amplificateur. Comme pour Tyrp1, la régulation du gène tyrosinase est contrôlée par différents éléments régulateurs dans les mélanocytes et la RP. Il a été montré que le promoteur de tyrosinase n'était pas suffisant pour une forte expression dans les mélanocytes et la RP. De plus, l'analyse de la région située en amont a révélé la présence d'un amplificateur nécessaire à l'expression dans les mélanocytes à la position -15 kb. Cet amplificateur n'est toutefois pas actif dans la RP mais agit comme un répresseur dans ces cellules. Ces résultats indiquent que certains éléments nécessaires à l'expression dans les deux types de cellules pigmentaires sont absents de ces constructions. Comme pour Tyrp1, j'ai en premier lieu démontré qu'un CAB était capable de corriger le phénotype albinique, puis ai inséré un gène reporter (lacZ) dans le CAB par recombinaison homologue et ai finalement analysé l'expression du reporter en transgenèse. Ces souris ont montré une expression forte du lacZ dans les mélanocytes et la RP, ce qui indique que le CAB contient les séquences régulatrices nécessaires à l'expression correcte de tyrosinase. Afin de localiser plus précisément les éléments régulateurs, j'ai ensuite généré des délétions dans le CAB et analysé l'expression du lacZ en transgenèse. La comparaison de séquences génomiques provenant de différentes espèces a permis par la suite d'identifier des régions représentant de nouveaux éléments régulateurs potentiels. En utilisant cette approche, j'ai identifié une région qui se comporte comme un amplificateur dans la RP et qui est nécessaire à l'expression de tyrosinase dans ce tissu. De plus, j'ai identifié les facteurs de transcription Mitf et Sox10 comme transactivateurs de l'amplificateur spécifique aux mélanocytes situé à -15 kb. L'identification et la caractérisation des ces éléments régulateurs des gènes tyrosinase et Tyrp1confirme donc que la régulation différentielle des gènes dans les mélanocytes et la RP est liée à des éléments régulateurs séparés. Summary Pigment cells of mammals originate from two different lineages: melanocytes arise from the neural crest, whereas cells of the retinal pigment epithelium (RPE) originate from the optic cup of the developing forebrain. A large set of genes are involved in pigmentation, including the members of the tyrosinase gene family, namely tyrosinase, Tyrp1 and Dct. Previous studies have suggested that pigmentation genes are differentially regulated in melanocytes and RPE. In this work, the tyrosinase gene family was used as a model for studying the involvement of distal regulatory elements in pigment cell-specific gene expression. The promoter of the Tyrp1 gene has been shown to drive detectable transgene expression only to the RPE, even though the gene is also expressed in melanocytes as evident from Tyrp1-mutant mice. This indicates that the regulatory elements responsible for Tyrp1 gene expression in the RPE are not sufficient for expression in melanocytes. I thus searched for a putative melanocyte-specific regulatory sequence and demonstrate that a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the Tyrp1 gene and surrounding sequences is able to target transgenic expression to melanocytes and to rescue the Tyrp1 b (brown) phenotype. This BAC contains several highly conserved non-coding sequences that might represent novel regulatory elements. I further focused on a sequence located at -15 kb which I identified as amelanocyte-specific enhancer as shown by cell culture and transgenic mice. In addition, further functional analysis identified the transcription factor Sox10 as being able to bind and transactivate this enhancer. As for Tyrp1, tyrosinase gene regulation is mediated by different cis-regulatory elements in melanocytes and RPE. It was shown that the tyrosinase promoter was not sufficient to confer strong and specific expression in melanocytes and RPE. Moreover, analysis of tyrosinase upstream sequence, revealed the presence of a specific enhancer at position -15 kb which was necessary to confer strong expression in melanocytes. This enhancer element however failed to act as an enhancer in the RPE, but rather repressed expression. This indicates that some regulatory elements required for tyrosinase expression in both RPE and melanocytes are still missing from these constructs. As for Tyrp1, I first demonstrated that a BAC containing the Tyr gene is able to rescue the Tyr c (albino) phenotype in mice, then I inserted a lacZ reporter gene in the BAC by homologous recombination, and finally analysed the pattern of lacZ expression in transgenic mice. These mice showed strong lacZ expression in both RPE and melanocytes, indicating that the BAC contains the regulatory sequences required for proper tyrosinase expression. In order to localize more precisely these regulatory elements, I have then generated several deletions in the BAC and analysed lacZ expression in transgenic mice. Multi-species comparative genomic analysis then allowed identifying conserved sequences that potentially represent novel regulatory elements. Using this experimental approach, I identified a region that behaves as a RPE-specific enhancer and that is required for tyrosinase expression in the retina] pigment epithelium. In addition, I identified the transcription factors Mitf and Sox l0 as being transactivators of the melanocyte-specific enhancer located at -l5 kb. The identification and characterization of these tyrosinase and Tyrp1 distal regulatory element supports the idea that separate regulatory sequences mediate differential gene expression in melanocytes and RPE.

Targeting Enterococcus faecalis Biofilms with Phage Therapy.

Phage therapy has been proven to be more effective, in some cases, than conventional antibiotics, especially regarding multidrug-resistant biofilm infections. The objective here was to isolate an anti-Enterococcus faecalis bacteriophage and to evaluate its efficacy against planktonic and biofilm cultures. E. faecalis is an important pathogen found in many infections, including endocarditis and persistent infections associated with root canal treatment failure. The difficulty in E. faecalis treatment has been attributed to the lack of anti-infective strategies to eradicate its biofilm and to the frequent emergence of multidrug-resistant strains. To this end, an anti-E. faecalis and E. faecium phage, termed EFDG1, was isolated from sewage effluents. The phage was visualized by electron microscopy. EFDG1 coding sequences and phylogeny were determined by whole genome sequencing (GenBank accession number KP339049), revealing it belongs to the Spounavirinae subfamily of the Myoviridae phages, which includes promising candidates for therapy against Gram-positive pathogens. This analysis also showed that the EFDG1 genome does not contain apparent harmful genes. EFDG1 antibacterial efficacy was evaluated in vitro against planktonic and biofilm cultures, showing effective lytic activity against various E. faecalis and E. faecium isolates, regardless of their antibiotic resistance profile. In addition, EFDG1 efficiently prevented ex vivo E. faecalis root canal infection. These findings suggest that phage therapy using EFDG1 might be efficacious to prevent E. faecalis infection after root canal treatment.

Genomic analysis of the blood attributed to Louis XVI (1754-1793), king of France.

A pyrographically decorated gourd, dated to the French Revolution period, has been alleged to contain a handkerchief dipped into the blood of the French king Louis XVI (1754-1793) after his beheading but recent analyses of living males from two Bourbon branches cast doubts on its authenticity. We sequenced the complete genome of the DNA contained in the gourd at low coverage (similar to 2.5x) with coding sequences enriched at a higher similar to 7.3x coverage. We found that the ancestry of the gourd's genome does not seem compatible with Louis XVI's known ancestry. From a functional perspective, we did not find an excess of alleles contributing to height despite being described as the tallest person in Court. In addition, the eye colour prediction supported brown eyes, while Louis XVI had blue eyes. This is the first draft genome generated from a person who lived in a recent historical period; however, our results suggest that this sample may not correspond to the alleged king.

Hunting for differentially expressed genes

Differentially expressed genes are usually identified by comparing steady-state mRNA concentrations. Several methods have been used for this purpose, including differential hybridization, cDNA subtraction, differential display and, more recently, DNA chips. Subtractive hybridization has significantly improved after the polymerase chain reaction was incorporated into the original method and many new protocols have been established. Recently, the availability of the well-known coding sequences for some organisms has greatly facilitated gene expression analysis using high-density microarrays. Here, we describe some of these modifications and discuss the benefits and drawbacks of the various methods corresponding to the main advances in this field.

Normal expression of IFN-gammaR in four patients with uncommon mycobacterial infection phenotypes

Several primary immunodeficiency diseases affecting the interleukin 12/interferon gamma (IFN-gamma) pathway have been identified, most of them characterized by recurrent and protracted infections produced by intracellular microorganisms, particularly by several species of mycobacteria. In the present study we analyzed the expression of IFN-gamma receptor (IFN-gammaR) and signal transducer and activator of transcription 1 (STAT-1) in 4 children with Mycobacterium tuberculosis infection of uncommon clinical presentation. These molecules were evaluated by flow cytometry and Western blotting in B cells transformed with Epstein-Barr virus and mutations were scanned by single-strand conformational polymorphisms and DNA sequencing. The expression of IFN-gammaR1 was normal in all 4 patients. The genetic analysis of IFN-gammaR1 and IFN-gammaR2 coding sequences did not reveal any mutation. The expression of the STAT-1 molecule was similar in patients and healthy controls; however, when the phosphorylation of this transcription factor in response to IFN-gamma activation was evaluated by Western blot, a significant lower signal was evident in one patient. These data indicate that there are no alterations in the expression or function of the IFN-gammaR chains in these patients. However, the low level of STAT-1 phosphorylation found in one of these patients might be explained by a defect in one of the molecules involved in the signal transduction pathway after IFN-gamma interacts with its receptor. In the other three patients the inability to eliminate the mycobacteria may be due to a defect in another effector mechanism of the mononuclear phagocytes.

Caractérisation et étude d'un élément régulateur du gène codant pour le récepteur à la vasopressine de type 2

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris VI, France

Étude du polymorphisme du gène majeur d’histocompatibilité de classe IIb (MHIIb) chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis)

Les molécules classiques du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) sont des glycoprotéines de surface spécialisées dans la présentation de peptides, principalement dérivés de pathogènes extracellulaires, aux récepteurs des lymphocytes T CD4+ afin d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sont encodées, avec celles du CMH de classe I, par les gènes les plus polymorphiques identifiés jusqu’à maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversité allélique à chacun d’eux. De plus, le polymorphisme des gènes du CMHII n’est pas limité qu’aux séquences codantes. Il est également observé dans les promoteurs où on a démontré ses effets sur le niveau d’expression des gènes. La variation de la régulation d’un gène est considérée comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observées chez tous les organismes. Des séquences d’ADN répétées impliquées dans cette régulation ont été identifiées dans les régions non-codantes des génomes. D’un autre côté, la sélection par les pathogènes permettrait l’évolution et le maintien du polymorphisme des gènes du CMH chez les vertébrés. À ce sujet, plusieurs études ont montré l’implication de différents allèles du CMH dans la résistance ou la susceptibilité aux maladies. Cette étude avait pour objectifs de caractériser le polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie conférée par des allèles et/ou génotypes particuliers lors d’une infection, ainsi que sur la variation du niveau d’expression du gène dans différentes conditions. Dans une première partie, nous avons identifié un total de 6 allèles du gène MHIIb, désignés Safo-DAB*0101 à Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarité avec les séquences codantes provenant de poissons téléostéens et de l’humain. L’analyse des séquences du domaine b1 a permis de détecter l’effet d’une pression sélective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette région de la molécule. Quatre de ces allèles ont été testés lors d’une expérience d’infection avec le pathogène Aeromonas salmonicida afin d’évaluer l’effet qu’ils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouvé que l’allèle DAB*0101 était significativement associé à la résistance à la furonculose. En plus d’avoir été identifié chez les individus homozygotes pour cet allèle, l’effet a également été remarqué au niveau de la survie les poissons de génotype DAB*0101/*0201. À l’opposé, les facteurs de risque élevé obtenus pour les génotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggèrent plutôt une association à la susceptibilité. Étant donné la faible fréquence à laquelle l’allèle DAB*0101 a été retrouvé dans la population, le modèle de la sélection dépendante de la fréquence pourrait expliquer l’avantage conféré par ce dernier et souligne l’importance de ce mécanisme pour le maintien du polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine. Dans une seconde partie, nous avons rapporté la présence d’un minisatellite polymorphique formé d’un motif de 32 nucléotides dans le second intron du gène MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de répétitions du motif a été associé à chaque allèle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 répétitions pour les allèles DAB*0101 à DAB*0601 respectivement). L’expression relative de quatre allèles a été évaluée dans des poissons hétérozygotes aux températures de 6 ºC et 18 ºC. Les résultats indiquent que les allèles possédant un long minisatellite montrent une réduction de l’expression du gène d’un facteur 1,67 à 2,56 par rapport aux allèles qui en contiennent un court. De même, des allèles qui incluent des minisatellites de tailles similaires n’affichent pas de différence significative au niveau de l’abondance du transcrit aux deux températures. De plus, l’effet répressif associé aux longs minisatellites est amplifié à la température de 18 ºC dans des poissons de trois génotypes différents. Nous avons finalement observé une augmentation significative par un facteur 2,08 de l’expression totale du gène MHIIb à la température de 6 ºC. Ces résultats appuient l’implication des séquences d’ADN répétées dans la régulation de l’activité transcriptionnelle d’un gène et suggèrent qu’un minisatellite sensible aux différences de températures pourrait être soumis aux forces sélectives et jouer un rôle important dans l’expression de gènes et l’évolution des organismes poïkilothermes.

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

DNA Sequence Representation methods

DNA sequence representation methods are used to denote a gene structure effectively and help in similarities/dissimilarities analysis of coding sequences. Many different kinds of representations have been proposed in the literature. They can be broadly classified into Numerical, Graphical, Geometrical and Hybrid representation methods. DNA structure and function analysis are made easy with graphical and geometrical representation methods since it gives visual representation of a DNA structure. In numerical method, numerical values are assigned to a sequence and digital signal processing methods are used to analyze the sequence. Hybrid approaches are also reported in the literature to analyze DNA sequences. This paper reviews the latest developments in DNA Sequence representation methods. We also present a taxonomy of various methods. A comparison of these methods where ever possible is also done

Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae

Der Wechsel von Tag und Nacht erzeugt einen regelmäßigen Rhythmus von verschiedenen Umweltreizen, allen voran Licht und Temperatur. Fast jedes bis zum heutigen Tage untersuchte Lebewesen besitzt einen endogenen Mechanismus zur Zeitwahrnehmung, und diese "innere Uhr" befähigt Lebewesen dazu, sich vorausschauend an rhythmische Umwelt-Änderungen anzupassen. Circadiane Rhythmen bestehen auch ohne jegliche äußere Reize und basieren auf einem molekularen Rückkopplungs-Mechanismus, der Rhythmen in Genexpression und Proteinkonzentration von etwa 24 Stunden erzeugt. Obwohl sich die grundsätzlichen Mechanismen und Komponenten dieses molekularen Uhrwerks in allen Insekten ähneln, zeigte sich jedoch immer mehr, dass es im Detail doch wesentliche Unterschiede zwischen verschiedenen Insektengruppen gibt. Während das molekulare Uhrwerk der Fruchtfliege Drosophila melanogaster inzwischen sehr gut untersucht ist, fehlen bei den meisten Insektengruppen immernoch eingehende Untersuchungen. Fast nichts ist über die molekulare Basis von circadianen Rhythmen bei der Schabe Rhyparobia maderae bekannt, obwohl diese Art bereits seit Langem als Modellorganismus in der Chronobiologie dient. Um mit der Forschung am molekularen, circadianen System von R. maderae zu beginnen, wurde die Struktur und das Expressionsprofil der core feedback loop Gene per, tim1 und cry2 analysiert. Mittels degenerierten Primern und RACE konnte das vollständige offene Leseraster (OLR) von rmPer und rmCry2, und ein Teil des rmTim1 OLR kloniert werden. Eine phylogenetische Analyse gruppierte rmPER und rmCRY2 gemeinsam mit den Orthologa hemimetaboler Insekten. Viele bei D. melanogaster funktionell charakterisierte Domänen sind bei diesen Proteinen konserviert, was auf eine ähnliche Funktion in der inneren Uhr von R. maderae hinweist. Mittels quantitativer PCR konnte gezeigt werden, dass die mRNA von rmPer, rmTim1 und rmCry2 in verschiedenen Lichtregimen in der gleichen Phasenlage Tageszeit-abhängig schwankt. Die Phasenlage stellte sich bei unterschiedlichen Photoperioden jeweils relativ zum Beginn der Skotophase ein, mit Maxima in der ersten Hälfte der Nacht. Auch im Dauerdunkel zeigen sich Rhythmen in der rmTim1 und rmCry2 Expression. Die Amplitude der rmPer Expressionsrhythmen war jedoch so gering, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitgeberzeiten (ZT) festgestellt werden konnten. Mittels Laufrad-Assays wurde untersucht wie Kurz- und Langtag Lichtregime die Verhaltensrhythmen beeinflussen. Es konnten nur Unterschiede in der Periodenlänge unter freilaufenden Bedingungen festgestellt werden, wenn höhere Lichtintensitäten (1000lx) zur Synchronisation (entrainment) genutzt wurden. Die Periode des freilaufenden Rhythmus war bei Tieren aus dem Kurztag länger. Die photoperiodische Plastizität zeigte sich also auch auf Verhaltensebene, obwohl höhere Lichtintensitäten notwendig waren um einen Effekt zu beobachten. Basierend auf den Sequenzen der zuvor klonierten OLR wurden gegen rmPER, rmTIM1 und rmCRY2 gerichtete Antikörper hergestellt. Die Antikörper gegen rmPER und rmTIM1 erkannten in western blots sehr wahrscheinlich spezifisch das jeweilige Protein. Zeitreihen von Gehirngewebe-Homogenisaten zeigten keinen offensichtlichen circadianen Rhythmus in der Proteinkonzentration, wahrscheinlich auf Grund einer Oszillation mit niedriger Amplitude. In Immunhistochemischen Färbungen konnte nur mit dem gegen rmPER gerichteten Antikörper aus Kaninchen ein Signal beobachtet werden. Beinahe jede Zelle des Zentralnervensystems war rmPER-immunreaktiv im Zellkern. Es konnten keine Unterschiede zwischen den untersuchten ZTs festgestellt werden, ähnlich wie bei den western blot Zeitreihen. In dieser Studie konnten erstmals molekulare Daten der circadianen Uhr von R. maderae erfasst und dargestellt werden. Die Uhrgene per, tim1 und cry2 werden in dieser Schabenart exprimiert und ihre Domänenstruktur sowie das circadiane Expressionsmuster ähneln dem hypothetischen ursprünglichen Insektenuhrwerk, welches der circadianen Uhr von Vertebraten nahesteht. Das molekulare Uhrwerk von R. maderae kann sich an unterschiedliche Photoperioden anpassen, und diese Anpassungen manifestieren sich im Expressionsprofil der untersuchten Uhrgene ebenso wie im Verhalten.

Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: new insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy

Here, we analyze the complete coding sequences of all recognized tick-borne flavivirus species, including Gadgets Gully, Royal Farm and Karshi virus, seabird-associated flaviviruses, Kadam virus and previously uncharacterized isolates of Kyasanur Forest disease virus and Omsk hemorrhagic fever virus. Significant taxonomic improvements are proposed, e.g. the identification of three major groups (mammalian, seabird and Kadam tick-borne flavivirus groups), the creation of a new species (Karshi virus) and the assignment of Tick-borne encephalitis and Louping ill viruses to a unique species (Tick-borne encephalitis virus) including four viral types (i.e. Western Tick-borne encephalitis virus, Eastern Tick-borne encephalitis virus, Turkish sheep Tick-borne encephalitis virus and Louping ill Tick-borne encephalitis virus). The analyses also suggest a complex relationship between viruses infecting birds and those infecting mammals. Ticks that feed on both categories of vertebrates may constitute the evolutionary bridge between the three distinct identified lineages.

Stops making sense: translational trade-offs and stop codon reassignment

Background Efficient gene expression involves a trade-off between (i) premature termination of protein synthesis; and (ii) readthrough, where the ribosome fails to dissociate at the terminal stop. Sense codons that are similar in sequence to stop codons are more susceptible to nonsense mutation, and are also likely to be more susceptible to transcriptional or translational errors causing premature termination. We therefore expect this trade-off to be influenced by the number of stop codons in the genetic code. Although genetic codes are highly constrained, stop codon number appears to be their most volatile feature. Results In the human genome, codons readily mutable to stops are underrepresented in coding sequences. We construct a simple mathematical model based on the relative likelihoods of premature termination and readthrough. When readthrough occurs, the resultant protein has a tail of amino acid residues incorrectly added to the C-terminus. Our results depend strongly on the number of stop codons in the genetic code. When the code has more stop codons, premature termination is relatively more likely, particularly for longer genes. When the code has fewer stop codons, the length of the tail added by readthrough will, on average, be longer, and thus more deleterious. Comparative analysis of taxa with a range of stop codon numbers suggests that genomes whose code includes more stop codons have shorter coding sequences. Conclusions We suggest that the differing trade-offs presented by alternative genetic codes may result in differences in genome structure. More speculatively, multiple stop codons may mitigate readthrough, counteracting the disadvantage of a higher rate of nonsense mutation. This could help explain the puzzling overrepresentation of stop codons in the canonical genetic code and most variants.

Oscheius tipulae as an example of eEF1A gene diversity in nematodes

We characterized four eEF1A genes in the alternative rhabditid nematode model organism Oscheius tipulae. This is twice the copy number of eEF1A genes in C. elegans, C. briggsae, and, probably, many other free-living and parasitic nematodes. The introns show features remarkably different from those of other metazoan eEF1A genes. Most of the introns in the eEF1A genes are specific to O. tipulae and are not shared with any of the other genes described in metazoans. Most of the introns are phase 0 (inserted between two codons), and few are inserted in protosplice sites (introns inserted between the nucleotide sequence A/CAG and G/A). Two of these phase 0 introns are conserved in sequence in two or more of the four eEF1A gene copies, and are inserted in the same position in the genes. Neither of these characteristics has been detected in any of the nematode eEF1A genes characterized to date. The coding sequences were also compared with other eEF1A cDNAs from 11 different nematodes to determine the variability of these genes within the phylum Nematoda. Parsimony and distance trees yielded similar topologies, which were similar to those created using other molecular markers. The presence of more than one copy of the eEF1A gene with nearly identical coding regions makes it difficult to define the orthologous cDNAs. As shown by our data on O. tipulae, careful and extensive examination of intron positions in the eEF1A gene across the phylum is necessary to define their potential for use as valid phylogenetic markers.

Putative outer membrane proteins of Leptospira interrogans stimulate human umbilical vein endothelial cells (HUVECS) and express during infection

Cell adhesion molecules (CAMs) are surface receptors present in eukaryotic cells that mediate cell-cell or cell-extracellular matrix interactions. Vascular endothelium stimulation in vitro that lead to the upregulation of CAMs was reported for the pathogenic spirochaetes, including rLIC10365 of Leptospira interrogans. In this study, we report the cloning of LIC10507, LIC10508, LIC10509 genes of L interrogans using Escherichia coli as a host system. The rational for selecting these sequences is due to their location in L. interrogans serovar Copenhageni genome that has a potential involvement in pathogenesis. The genes encode for predicted lipoproteins with no assigned functions. The purified recombinant proteins were capable to promote the upregulation of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin on monolayers of human umbilical vein endothelial cells (HUVECS). In addition, the coding sequences are expressed in the renal tubules of animal during bacterial experimental infection. The proteins are probably located at the outer membrane of the bacteria since they are detected in detergent-phase of L interrogans Triton X-114 extract. Altogether our data suggest a possible involvement of these proteins during bacterial infection and provide new insights into the role of this region in the pathogenesis of Leptospira. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.