1003-001 Williamson Pond Final Report

Williamson Pond is a 26-acre publicly owned lake located about 2 miles east of the town of Williamson, in Lucas County. It has a watershed area of 1,499 acres. It has been managed since 1976 by the Lucas County Conservation Board (while still under state ownership) for fishing, boating, hunting, picnicking and other passive uses. Designated uses are Class AI, primary contact, and Class B (LW) aquatic life. Williamson Pond is on the 2004 EPA 303(d) List of Impaired Waters. A Total Maximum Daily Load (TMDL) for turbidity and nutrients at Williamson Pond was prepared by IDNR in 2005 and approved by EPA in 2006. The TMDL set reduction targets for both suspended sediment and phosphorus. The Williamson Pond Watershed Management Plan has provided the local work group and partners with information to develop and implement strategies to improve and protect water quality. These strategies are based on a three phase approach that will ultimately lead the removal of Williamson Pond from the Impaired Waters List. The goals identified in this proposal (Phase I) will reduce sediment and phosphorus delivery by 453 tons and 589 pounds annually. The Lucas County SWCD has and will continue to provide leadership on the Williamson Pond Project and has secured the partnerships necessary to address water quality problems and hired a part-time project coordinator to manage, implement, and oversee all activities pertaining to this proposal.

09006-003 Bear Creek Watershed Final Report

Bear Creek is an impaired warm water fishery designated as class B(LR) by the Iowa DNR and is on 303 impaired waters list for fish kills and ammonia. Bear Creek is located in eastern Delaware County. This project is designed to improve the water quality of Bear Creek by educating the landowners, operators and watershed community about the importance of this water resource. The goal of the Bear Creek Watershed Project is to improve the water quality of Bear Creek by reducing the amounts of ammoniated manure discharge, fecal coliform bacteria, sediment, nitrogen, and phosphorous. The Bear Creek Watershed Project has been a watershed project since July 2004, first as a Demo project FY 2004-2005 and then full time WSPF/319 project FY06-09. Fish kills have not occurred in 2008-2009. Sediment delivery has decreased in the Bear Creek Watershed by 5,328 tons per year. The objectives of this watershed project will be to improve Livestock Waste Storage, to improve Livestock Waste Usage, to decrease Sediment Losses, and to improve Education & Area Outreach. This project will install 2 manure storage structures (EQIP/project funded), 19 ac of CRP waterways, 12 ac of project waterways, 17 ac of CRP filter strips along stream, 12 water and sediment control basins, 18,000 ft of terraces, 350 ac of new notill planting, and 3,700 ft of streambank protection.

06003-002 Upper Catfish Creek Watershed Final Report

Upper Catfish Creek is located in a 9,300-acre watershed that flows through two significant natural resources, Swiss Valley Park and Swiss Valley Nature Preserves, one of the largest nature preserves in the Midwest. According to DNR’s 2002 305(d) report, that portion of the creek within the park and preserve is classified as a Class B(CW) cold water stream of which a portion has naturally reproducing trout (one of only 30 in the state of Iowa with this capability). Urban sprawl is a real threat to the Upper Catfish Creek Watershed. Currently, 10% of the watershed is residential, but 27% is zoned residential or commercial. The watershed is near Dubuque city limits but the jurisdiction is in the county. Differing criteria for land development between city and county jurisdictions further entices developers to build in outlying areas. County leaders agree there is more that needs to be done and will work with municipalities on uniformity of regulations and follow-up measures. We propose to set up key urban conservation practice models that will address storm water runoff and water quality which can be learned about and viewed by city and county officials, engineers, developers, etc. This would be part of a larger initiative including an educational campaign, inter-jurisdictional planning, the development of a land use GIS database, and agricultural conservation practices. The successes coming out of and learned about this watershed will serve as a model to spread county-wide.

Laser-MAG-hybridihitsauksen käyttöönotto laivan rungon valmistuksessa

Perinteisten kaarihitsausmenetelmien suhteellisen suuri lämmöntuonti aiheuttaa huomattavia muodonmuutoksia laivan rungon valmistusprosessin alkuvaiheessa. Muodonmuutosten seurauksena rakenteiden mitta- ja muototarkkuus heikkenee, mikä lisää oikaisu- ja sovitustyötä myöhemmissä työvaiheissa. Hitsausmuodonmuutoksia voidaan vähentää siirtymällä käyttämään laser-MAG-hybridihitsausta, jossa lämmöntuonti on merkittävästi pienempi kuin kaarihitsauksessa. Näin kyetään oleellisesti leikkaamaan oikaisu- ja sovitustyöstä syntyviä kustannuksia. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää tuotantovalmiiksi kuitulaser- ja MAG-hitsauksen yhdistelmäprosessi Aker Yards Oy:n Turun telakalla loppuvuoden 2006 aikana. Hitsauslaitteiston asennus oli valmistunut kesäkuussa 2006, minkä jälkeen aloitettiin luokituslaitoksen hyväksymän koeohjelman hitsaukset. Käyttöönotto suunnitelmaan sisältyvä koehitsausohjelma oli laadittu Det Norske Veritaksen julkaisemaa ohjetta (Guidelines no. 19) mukaillen. Ensimmäiseksi määritettiin hitsauskokeiden avulla prosessille laadun ja tehokkuuden suhteen optimaalinen railogeometria. Seuraavaksi optimoitiin prosessin hitsausparametrit 6 mm:n aineenpaksuudelle hyödyntäen Taguchi-koesuunnittelumenetelmää. Tämän jälkeen optimiparametreilla hitsattiin koekappale väsytyskokeisiin, jotka suoritettiin Teknillisen korkeakoulun laivalaboratoriossa. Väsytyskoetulokset täyttivät luokituslaitoksen vaatimukset. Myös hitsauksen menetelmäkoe suoritettiin hyväksytetysti. Viimeinen koeohjelman mukainen hitsauskoesarja tehtiin prosessiparametrien sallittujen vaihtelurajojen määrittämiseksi. Diplomityön tavoite täyttyi joulukuussa 2006, jolloin 'laivan kansipaneeli hitsattiin ensimmäistä kertaa uudella hitsausprosessilla. Hitsauksen laatu korreloi hyvin menetelmäkokeen tulosten kanssa ¿ hitsit olivat tasalaatuisia ja ne täyttivät B-luokan vaatimukset.

Surgery for unruptured arteriovenous malformations of the brain is better than conservative management for selected cases : a prospective cohort study

Object. The aim of this study was to identify patients who are likely to benefit from surgery for unruptured brain arterriovenous malformations (ubAVMs). Methods. The authors' database was interrogated for the risk and outcome of hemorrhage after referral and the out- come from surgery. Furthermore, the outcome from surgery incorporated those cases excluded from surgery because of perceived greater risk (sensitivity analysis). Finally, a comparison was made for the authors' patients between the natural history and surgery. Data were collected for 427 consecutively enrolled patients with ubAVMs in a database that in- cluded patients who were conservatively managed. Kaplan-Meier analysis was performed on patients observed for more than 1 day to determine the risk of hemorrhage. Variables that may influence the risk of first hemorrhage were assessed using Cox proportional hazard regression models and Kaplan-Meier life table analyses from referral until the first occur- rence of the following: hemorrhage, treatment, or last review. The outcome from surgery (leading to a new permanent neurological deficit with last review modified Rankin Scale [mRS] score > 1) was determined. Further sensitivity analy- sis was made to predict risk from surgery for the total ubAVM cohort by incorporating outcomes of surgical cases as well as cases excluded from surgery because of perceived risk, and assuming an adverse outcome for these excluded cases. Results. A total of 377 patients with a ubAVM were included in the analysis of the risk of hemorrhage. The 5-year risk of hemorrhage for ubAVM was 11.5%. Hemorrhage resulted in an mRS score > 1 in 14 cases (88% [95% CI 63%-98%]). Patients with Spetzler-Ponce Class A ubAVMs treated by surgery (n = 190) had a risk from surgery of 1.6% (95% CI 0.3%-4.8%) for a permanent neurological deficit leading to an mRS score > 1 and 0.5% (95% CI< 0.1%-3.2%) for a permanent neurological deficit leading to an mRS score > 2. Patients with Spetzler-Ponce Class B ubAVMs treated by surgery (n = 107) had a risk from surgery of 14.0% (95% CI 8.6%-22.0%) for a permanent neurological deficit leading to an mRS score > 1. Sensitivity analysis of Spetzler-Ponce Class B ubAVMs, including those in patients excluded from surgery, showed that the true risk for surgically eligible patients may have been as high as 15.6% (95% CI 9.9%-23.7%) for mRS score > 1, had all patients who were perceived to have a greater risk experienced an adverse outcome. Patients with Spetzler-Ponce Class C ubAVMs treated by surgery (n = 44) had a risk from surgery of 38.6% (95% CI 25.7%-53.4%) for a permanent neurological deficit leading to an mRS score >1. Sensitivity analysis of Class C ubAVMs, including those harbored by patients excluded from surgery, showed that the true risk for surgically eligible patients may have been as high as 60.9% (95% CI 49.2%-71.5%) for mRS score > 1, had all patients who were perceived to have a greater risk experienced an adverse outcome. Conclusion. Surgical outcomes for Spetzler-Ponce Class ubAVMs are better than those for conservative management.

Mir-21-Sox2 Axis Delineates Glioblastoma Subtypes with Prognostic Impact.

UNLABELLED: Glioblastoma (GBM) is the most aggressive human brain tumor. Although several molecular subtypes of GBM are recognized, a robust molecular prognostic marker has yet to be identified. Here, we report that the stemness regulator Sox2 is a new, clinically important target of microRNA-21 (miR-21) in GBM, with implications for prognosis. Using the MiR-21-Sox2 regulatory axis, approximately half of all GBM tumors present in the Cancer Genome Atlas (TCGA) and in-house patient databases can be mathematically classified into high miR-21/low Sox2 (Class A) or low miR-21/high Sox2 (Class B) subtypes. This classification reflects phenotypically and molecularly distinct characteristics and is not captured by existing classifications. Supporting the distinct nature of the subtypes, gene set enrichment analysis of the TCGA dataset predicted that Class A and Class B tumors were significantly involved in immune/inflammatory response and in chromosome organization and nervous system development, respectively. Patients with Class B tumors had longer overall survival than those with Class A tumors. Analysis of both databases indicated that the Class A/Class B classification is a better predictor of patient survival than currently used parameters. Further, manipulation of MiR-21-Sox2 levels in orthotopic mouse models supported the longer survival of the Class B subtype. The MiR-21-Sox2 association was also found in mouse neural stem cells and in the mouse brain at different developmental stages, suggesting a role in normal development. Therefore, this mechanism-based classification suggests the presence of two distinct populations of GBM patients with distinguishable phenotypic characteristics and clinical outcomes. SIGNIFICANCE STATEMENT: Molecular profiling-based classification of glioblastoma (GBM) into four subtypes has substantially increased our understanding of the biology of the disease and has pointed to the heterogeneous nature of GBM. However, this classification is not mechanism based and its prognostic value is limited. Here, we identify a new mechanism in GBM (the miR-21-Sox2 axis) that can classify ∼50% of patients into two subtypes with distinct molecular, radiological, and pathological characteristics. Importantly, this classification can predict patient survival better than the currently used parameters. Further, analysis of the miR-21-Sox2 relationship in mouse neural stem cells and in the mouse brain at different developmental stages indicates that miR-21 and Sox2 are predominantly expressed in mutually exclusive patterns, suggesting a role in normal neural development.

D-luokan audiovahvistimen modulointimenetelmien vertailu ja valinta

Tässä työssä esitellään kaksi D-luokan audiovahvistimissa käytettyä modulointimenetelmää ja vertaillaan niiden välisiä ominaisuuksia. Esitellyt menetelmät ovat pulssinleveysmodulaatio sekä sigma-deltamodulaatio. Lisäksi työssä esitellään signaalin käsittelyssä muodostuvan kohinan ja särön syntyä ja menetelmiä niiden välttämiseksi. Menetelmien ominaisuuksien vertailuun muodostetaan simulointimallit Simulink-ohjelmalla. Simulointitulosten perusteella valitaan käytettävä modulointimenetelmä audiovahvistinsovellukseen huomioon ottaen asetetut vaatimukset ja tavoitteet. Lopuksi valitun modulointimenetelmän suunnittelun pääkohtiin kiinnitetään huomiota.

Käyttövarmuusanalyysin tuottama tärkeysjärjestys elintarviketeollisuuden prosessilaitteille – Suuntaviivat kustannustietoisen kunnossapitostrategian luomiselle

Hallitsematon ja reaktiivinen kunnossapito on eräs tuotannon suurimpia kustannustekijöistä. Suunnitelmallisesti ja systemaattisesti johdettuna kunnossapito on tuotantotehokkuuden suurin vaikuttaja. Merkittävä osa tuotannon tehokkuuden ylläpidosta saavutetaan laitteiden käyttövarmuudella. Käyttövarmuuden saaminen hallintaan perustuu ennakoivan kunnossapidon määrän kasvattamiseen. Samalla korjaavan kunnossapidon kustannusriski laskee ja siihen käytetty panos vähenee. Huonolla kunnossapidon suunnitelmallisuudella on päinvastaiset vaikutukset. Tavoitteena on määritellä prosessilaitteiden käyttövarmuuksiin perustuva laitekriittisyys. Tutkimuksessa yhdistetään riskien arviointimenetelmiä, joilla keskimääräiset vikavälit ja seuraukset valmistukseen mallinnetaan. Kriittisyystekijöitä ovat käytettävyys, luotettavuus, kustannustekijät, turvallisuus ja ympäristövaikutukset. Tekijöiden arvottamiseen kehitettiin riksianalyysitaulukko. Kriittisyysluokat jaettiin kolmeen kategoriaan, joista A on kriittisin, B keskinkertainen ja C on matalin luokka. Lähtötietojen keräys toteutettiin triangulaatiomenetelmää soveltaen. Empiirisessä osassa HKScan Oy:n lihanjalostustehtaan jauheliha- ja kestomakkaraosastojen laitteet jaettiin A-, B- ja C-luokkiin. Kriittisimpiä laitteita oli 20 prosenttia analysoidusta laitemäärästä. Nämä A-luokkaan sijoitetut laitteet aiheuttavat 80 prosenttia kustannusriskeistä. B-luokkaan kuuluu 50 prosenttia ja C-luokkaan 30 prosenttia laitteista. Luokittelusta erotettiin havaitut turvallisuusriskit riskienhallinnan toimenpiteitä varten. Kustannustietoinen kriittisyysluokittelu on pohja kunnossapitostrategian rakentamiselle. Tämän avuksi esitettiin taulukot huolto-ohjelman luomiseen ja luokituksien hyödyntämiseen päivittäisessä toiminnassa.

Case: Kitaravahvistimen AB-luokan tehovahvistimen päivittäminen D-luokkaan

D-luokan vahvistimien etu perinteisiin A- tai AB-luokan vahvistimiin nähden on niitten korkea hyötysuhde ja pieni koko. Lisäksi ne ovat edullisia ja niihin voidaan asentaa pienemmät jäähdytyslevyt kuin perinteisiin vahvistimiin korkean hyötysuhteen ansiosta. Tässä tutkimuksessa asennetaan Peavey Solo –kitaravahvistimen pääteasteena toimivan AB-luokan päätevahvistimen tilalle tehokkaampi ja uudempaa vahvistinluokkaa edustava D-luokan vahvistin. Tutkimuksessa selvitetään, miten D-luokan vahvistimella toteutettu kytkentä toimii verrattuna alkuperäiseen kytkentään tutkimalla kitaravahvistimelle tyypillisiä sähköisiä ominaisuuksia. Työ toteutetaan mittauksin. Koska työssä olevissa kytkennöissä on jännitteisiä osia, on siinä perehdyttävä sähköturvallisuuteen. D-luokan vahvistin asettaa tietyt sähkötekniset kestävyysvaatimukset kytkennän teholähteelle ja kaiutinelementille, jolloin työssä paneudutaan myös niiden valintaan. D-luokan vahvistimeen päivitetyn kytkennän tuottamat äänenpainetasot olivat valtaosassa mittauksia suuremmat kuin alkuperäisellä kytkennällä. Äänenpainetasojen mittaustilanteissa myös kuormalle syötetyt tehot olivat suuremmat päivitetyllä kytkennällä verrattuna alkuperäiseen. Suurin päivitetyn kytkennän kuorman teho 72,72 W saavutettiin, kun kaiutinelementin yli oli 24,12 V:n jännitteen tehollisarvo ja kuorman teho oli noin 36 kertaa suurempi kuin alkuperäisellä kytkennällä. D-luokan vahvistimen mitatut harmonisen särön arvot ovat huomattavasti pienempiä kuin alkuperäisellä vahvistimella. Muokkaamattoman vahvistimen mitatusta sähköisestä taajuusvasteeesta nähdään, että alkuperäinen vahvistin korostaa tiettyjä taajuuksia, kun D-luokan vahvistimen taajuusvaste on sen sijaan likimain tasainen. Akustinen taajuusvaste ei ole niin tasainen D-luokan vahvistimeen päivitetyllä kytkennällä kuin alkuperäisellä kytkennällä ja sillä on myös kapeampi taajuusalue. Jos päivitetyn kytkennän sointia haluttaisiin parantaa, pitäisi tutkia lisää akustiseen taajuusvasteeseen vaikuttavia asioita.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.

Le récepteur CD36 : implication dans le développement de l'athérosclérose et dans le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires

Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës.

Application du SPR dans le criblage des ligands synthétiques du CD36 et sa validation

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Dietary, physiological, genetic and pathological influences on postprandial lipid metabolism

Most of diurnal time is spent in a postprandial state due to successive meal intakes during the day. As long as the meals contain enough fat, a transient increase in triacylglycerolaemia and a change in lipoprotein pattern occurs. The extent and kinetics of such postprandial changes are highly variable and are modulated by numerous factors. This review focuses on factors affecting postprandial lipoprotein metabolism and genes, their variability and their relationship with intermediate phenotypes and risk of CHD. Postprandial lipoprotein metabolism is modulated by background dietary pattern as well as meal composition (fat amount and type, carbohydrate, protein, fibre, alcohol) and several lifestyle conditions (physical activity, tobacco use), physiological factors (age, gender, menopausal status) and pathological conditions (obesity, insulin resistance, diabetes mellitus). The roles of many genes have been explored in order to establish the possible implications of their variability in lipid metabolism and CHD risk. The postprandial lipid response has been shown to be modified by polymorphisms within the genes for apo A-I, A-IV, AN, E, B, C-I and C-III, lipoprotein lipase, hepatic lipase, fatty acid binding and transport proteins, microsomal trigyceride transfer protein and scavenger receptor class B type I. Overall, the variability in postprandial response is important and complex, and the interactions between nutrients or dietary or meal compositions and gene variants need further investigation. The extent of present knowledge and needs for future studies are discussed in light of ongoing developments in nutrigenetics.

Agonist-selective, receptor-specific interaction of human P-2Y receptors with beta-arrestin-1 and-2

Interaction of G-protein-coupled receptors with beta-arrestins is an important step in receptor desensitization and in triggering "alternative" signals. By means of confocal microscopy and fluorescence resonance energy transfer, we have investigated the internalization of the human P2Y receptors 1, 2, 4, 6, 11, and 12 and their interaction with beta-arrestin-1 and -2. Co-transfection of each individual P2Y receptor with beta-arrestin-1-GFP or beta-arrestin-2-YFP into HEK-293 cells and stimulation with the corresponding agonists resulted in a receptor-specific interaction pattern. The P2Y(1) receptor stimulated with ADP strongly translocated beta-arrestin-2-YFP, whereas only a slight translocation was observed for beta-arrestin-1-GFP. The P2Y(4) receptor exhibited equally strong translocation for beta-arrestin-1-GFP and beta-arrestin-2YFP when stimulated with UTP. The P2Y(6), P2Y(11), and P2Y(12) receptor internalized only when GRK2 was additionally cotransfected, but beta-arrestin translocation was only visible for the P2Y(6) and P2Y(11) receptor. The P2Y(2) receptor showed a beta-arrestin translocation pattern that was dependent on the agonist used for stimulation. UTP translocated beta-arrestin-1-GFP and beta-arrestin-2-YFP equally well, whereas ATP translocated beta-arrestin-1-GFP to a much lower extent than beta-arrestin2- YFP. The same agonist-dependent pattern was seen in fluorescence resonance energy transfer experiments between the fluorescently labeled P2Y(2) receptor and beta-arrestins. Thus, the P2Y(2) receptor would be classified as a class A receptor when stimulated with ATP or as a class B receptor when stimulated with UTP. The ligand-specific recruitment of beta-arrestins by ATP and UTP stimulation of P2Y(2) receptors was further found to result in differential stimulation of ERK phosphorylation. This suggests that the two different agonists induce distinct active states of this receptor that show differential interactions with beta-arrestins.