Estudo da imunopatogenia das les��es no sistema nervoso central de c��es naturalmente acometidos por leishmaniose visceral

Visceral leishmaniasis in dogs is described as a chronic disease whose main symptoms are progressive weigth loss, cachexy and dermatologic lesions. Recently, the disease has been associated to neurologic disorders. A total of 40 dogs with visceral leishmaniasis were divided into two groups. The first composed of dogs without neurological signs (n=30) and the second by dogs with neurological disorders (n=10). Brain samples were collected, stored in 10% buffered formalin and subjected to immunohistochemical examination for amastigotes forms of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, CD3+, CD4+ and CD8+ T lymphocytes and macrophages. Imunnohistochemistry evaluation revealed no amastigote forms of the parasite. CD3+ T lymphocytes were present in 24/30 (80%) dogs without neurological signs and in all dogs from the second group (p=0.0011). CD4+ and CD8+ were rarely observed, with CD4+ immunostaining in 10/40 (25%) dogs, from which half of them had neurological disease (p=0.0090). The presence of CD8+ was detected only in 4/10 (40%) dogs from neurological group (p=0.0021). Macrophages were detected in 38/40 (95%) dogs, without significant differences between groups (p=0.7664).

Estudo da influ��ncia da infec����o pelo Mycobacterium tuberculosis sobre a replica����o do HIV e a imunidade celular em associa����o com os polimorfismos dos genes tlr2 e tlr4

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

Contribui����o ao estudo da patogenia das les��es no enc��falo de c��es naturalmente acometidos por Leishmaniose visceral

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

Avalia����o da resposta imune celular de sangue perif��rico e medula ��ssea pela t��cnica de imunocitoqu��mica em c��es vacinados para Leishmaniose visceral canina

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

Estudo imunoistoqu��mico da queilite act��nica, carcinoma epiderm��ide de l��bio e carcinoma epiderm��ide intrabucal

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

Caracteriza����o molecular e imunol��gica da infec����o pelo V��rus linfotr��pico de c��lulas T humanas

O presente estudo teve como objetivos efetuar a caracteriza����o molecular e imunol��gica da infec����o pelo HTLV em 42 portadores assintom��ticos da infec����o pelo HTLV; e 19 portadores com sintomas neurol��gicos associados �� infec����o (16 com PET/MAH e outros tr��s com neuropatia perif��rica). Outro grupo de 100 indiv��duos soronegativos para HTLV procedentes de Bel��m-PA tamb��m foi analisado. As amostras de sangue foram processadas para realiza����o da sorologia para HTLV, para contagem de linf��citos T CD4+ e T CD8+ (incluindo os soronegativos), para as t��cnicas de quantifica����o da carga proviral do HTLV e caracteriza����o dos tipos e subtipos de HTLV circulantes nos infectados. Entre os 42 assintom��ticos, foi positiva para o HTLV-1 35 amostras (83.3%), e para o HTLV-2 07 amostras (16.7%) (p < 0.0001). Entre os 19 sintom��ticos, foi positiva para o HTLV-1 18 amostras (94.7%), e para o HTLV-2 01 amostra (5.3%) (p = 0.0002), onde as 16 amostras que tiveram diagn��stico de PET/MAH foram positivas HTLV-1. As an��lises filogen��ticas das regi��es 5���LTR agruparam 34 amostras (60%) de HTLV-1 no Subgrupo Transcontinental do Subtipo Cosmopolita; e 05 amostras (72.2%) de HTLV-2, no subtipo HTLV-2c. As m��dias de distribui����o dos n��veis de linf��citos T CD4+ e T CD8+ foi maior entre os sintom��ticos, por��m n��o havendo diferen��as significantes quando comparados com os assintom��ticos e controles soronegativos. Foi observada uma maior m��dia de carga proviral entre os portadores sintom��ticos quando comparados aos assintom��ticos (p = 0.0123). Os resultados obtidos confirmam a ocorr��ncia de PET/MAH associada �� infec����o pelo HTLV-1 na regi��o de Bel��m-PA. A predomin��ncia do subtipo A de HTLV-1 corrobora outros resultados que demonstram a presen��a deste subtipo como o mais prevalente em ��reas urbanas do Brasil, assim como a predomin��ncia de HTLV-2c entre as infectadas pelo HTLV-2 confirma a maior frequ��ncia deste subtipo na Amaz��nia brasileira, ressaltando que dentre as amostras de HTLV-2 est�� a de um paciente sintom��tico (neuropatia perif��rica). A maior m��dia de carga proviral entre sintom��ticos corrobora resultados de achados que associam esta vari��vel ao desenvolvimento de PET/MAH entre os infectados pelo HTLV. Sendo assim, estes resultados indicam ainda a necessidade do monitoramento da descri����o de casos de infec����o pelo HTLV com diagn��stico cl��nicolaboratorial adequado.

Induction of immune response in broiler chickens immunized with recombinant FliC and challenged by Salmonella Typhimurium

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Immune response of broiler chickens immunized orally with the recombinant proteins flagellin and the subunit B of cholera toxin associated with Lactobacillus spp.

Processo FAPESP: 09/53570-3

Estudo das c��lulas mononucleares e polimorfonucleares no intestino de c��es naturalmente infectados por leishmania infantum

P��s-gradua����o em Ci��ncia e Tecnologia Animal - FEIS

Trypanosoma cruzi Adjuvants Potentiate T Cell-Mediated Immunity Induced by a NY-ESO-1 Based Antitumor Vaccine

Immunological adjuvants that induce T cell-mediate immunity (TCMI) with the least side effects are needed for the development of human vaccines. Glycoinositolphospholipids (GIPL) and CpGs oligodeoxynucleotides (CpG ODNs) derived from the protozoa parasite Trypanosoma cruzi induce potent pro-inflammatory reaction through activation of Toll-Like Receptor (TLR) 4 and TLR9, respectively. Here, using mouse models, we tested the T. cruzi derived TLR agonists as immunological adjuvants in an antitumor vaccine. For comparison, we used well-established TLR agonists, such as the bacterial derived monophosphoryl lipid A (MPL), lipopeptide (Pam3Cys), and CpG ODN. All tested TLR agonists were comparable to induce antibody responses, whereas significant differences were noticed in their ability to elicit CD4(+) T and CD8(+) T cell responses. In particular, both GIPLs (GTH, and GY) and CpG ODNs (B344, B297 and B128) derived from T. cruzi elicited interferon-gamma (IFN-gamma) production by CD4(+) T cells. On the other hand, the parasite derived CpG ODNs, but not GIPLs, elicited a potent IFN-gamma response by CD8(+) T lymphocytes. The side effects were also evaluated by local pain (hypernociception). The intensity of hypernociception induced by vaccination was alleviated by administration of an analgesic drug without affecting protective immunity. Finally, the level of protective immunity against the NY-ESO-1 expressing melanoma was associated with the magnitude of both CD4+ T and CD8+ T cell responses elicited by a specific immunological adjuvant.

Proteins of Leishmania (Viannia) shawi confer protection associated with Th1 immune response and memory generation

Background: Leishmania (Viannia) shawi parasite was first characterized in 1989. Recently the protective effects of soluble leishmanial antigen (SLA) from L. (V.) shawi promastigotes were demonstrated using BALB/c mice, the susceptibility model for this parasite. In order to identify protective fractions, SLA was fractionated by reverse phase HPLC and five antigenic fractions were obtained. Methods: F1 fraction was purified from L. (V.) shawi parasite extract by reverse phase HPLC. BALB/c mice were immunized once a week for two consecutive weeks by subcutaneous routes in the rump, using 25 mu g of F1. After 1 and 16 weeks of last immunization, groups were challenged in the footpad with L. (V.) shawi promastigotes. After 2 months, those same mice were sacrificed and parasite burden, cellular and humoral immune responses were evaluated. Results: The F1 fraction induced a high degree of protection associated with an increase in IFN-gamma, a decrease in IL-4, increased cell proliferation and activation of CD8(+)T lymphocytes. Long-term protection was acquired in F1-immunized mice, associated with increased CD4(+) central memory T lymphocytes and activation of both CD4+ and CD8(+) T cells. In addition, F1-immunized groups showed an increase in IgG2a levels. Conclusions: The inductor capability of antigens to generate memory lymphocytes that can proliferate and secrete beneficial cytokines upon infection could be an important factor in the development of vaccine candidates against American Tegumentary Leishmaniasis.

Zinco, invecchiamento e sistema immunitario: effetti sull'apoptosi e sulla proliferazione dei linfociti

Immunosenescence is characterized by a complex remodelling of the immune system, mainly driven by lifelong antigenic burden. Cells of the immune system are constantly exposed to a variety of stressors capable of inducing apoptosis, including antigens and reactive oxygen species continuously produced during immune response and metabolic pathways. The overall homeostasis of the immune system is based on the balance between antigenic load, oxidative stress, and apoptotic processes on one side, and the regenerative potential and renewal of the immune system on the other. Zinc is an essential trace element playing a central role on the immune function, being involved in many cellular processes, such as cell death and proliferation, as cofactor of enzymes, nuclear factors and hormones. In this context, the age associated changes in the immune system may be in part due to zinc deficiency, often observed in aged subjects and able to induce impairment of several immune functions. Thus, the aim of this work was to investigate the role of zinc in two essential events for immunity during aging, i.e. apoptosis and cell proliferation. Spontaneous and oxidative stress-induced apoptosis were evaluated by flow cytometry in presence of a physiological concentration of zinc in vitro on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy subjects of different age: a group of young subjects, a group of old subjects and a group of nonagenarians. In addition, cell cycle phases were analyzed by flow cytometry in PBMCs, obtained from the subjects of the same groups in presence of different concentration of zinc. We also analyzed the influence of zinc in these processes in relation to p53 codon 72 polymorphism, known to affect apoptosis and cell cycle in age-dependent manner. Zinc significantly reduces spontaneous apoptosis in all age-groups; while it significantly increases oxidative stress-induced late apoptosis/necrosis in old and nonagenarians subjects. Some factors involved in the apoptotic pathway were studied and a zinc effect on mitochondrial membrane depolarization, cytochrome C release, caspase-3 activation, PARP cleavage and Bcl-2 expression was found. In conclusion, zinc inhibits spontaneous apoptosis in PBMCs contrasting the harmful effects due to the cellular culture conditions. On the other hand, zinc is able to increase toxicity and induce cell death in PBMCs from aged subjects when cells are exposed to stressing agents that compromise antioxidant cellular systems. Concerning the relationship between the susceptibility to apoptosis and p53 codon 72 genotype, zinc seems to affect apoptosis only in PBMCs from Pro- people suggesting a role of this ion in strengthening the mechanism responsible of the higher propensity of Pro- towards apoptosis. Regarding cell cycle, high doses of zinc could have a role in the progression of cells from G1 to S phase and from S to G2/M phase. These effect seems depend on the age of the donor but seems to be unrelated to p53 codon 72 genotype. In order to investigate the effect of an in vivo zinc supplementation on apoptosis and cell cycle, PBMCs from a group of aged subjects were studied before and after six weeks of oral zinc supplementation. Zinc supplementation reduces spontaneous apoptosis and it strongly reduces oxidative stress-induced apoptosis. On the contrary, no effect of zinc was observed on cell cycle. Therefore, it���s clear that in vitro and in vivo zinc supplementation have different effects on apoptosis and cell cycle in PBMCs from aged subjects. Further experiments and clinical trials are necessary to clarify the real effect of an in vivo zinc supplementation because this preliminary data could encourage the of this element in all that disease with oxidative stress pathogenesis. Moreover, the expression of metallothioneins (MTs), proteins well known for their zinc-binding ability and involved in many cellular processes, i.e. apoptosis, metal ions detoxification, oxidative stress, differentiation, was evaluated in total lymphocytes, in CD4+ and in CD8+ T lymphocytes from young and old healthy subjects in presence of different concentration of zinc in vitro. Literature data reported that during ageing the levels of these proteins increase and concomitantly they lose the ability to release zinc. This fact induce a down-regulation of many biological functions related to zinc, such as metabolism, gene expression and signal transduction. Therefore, these proteins may turn from protective in young-adult age to harmful agents for the immune function in ageing following the concept that several genes/proteins that increase fitness early in life may have negative effects later in life: named ���Antagonistic Pleyotropy Theory of Ageing���. Data obtained in this work indicate an higher and faster expression of MTs with lower doses of zinc in total lymphocytes, in CD4+ and in CD8+ T lymphocytes from old subjects supporting the antagonistic pleiotropic role of these proteins.

Analyse molekularer Mechanismen der Immundominanz MHC Klasse I-pr��sentierter Antigene bei Humaner Cytomegalovirus-Infektion

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von gro��er klinischer Relevanz. Die HCMV-Infektion, die insbesondere bei immunsupprimierten Patienten mit hoher Morbidit��t und Mortalit��t assoziiert ist, wird vorwiegend durch CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) kontrolliert. Das Tegumentprotein pp65 und das immediate early 1-Protein (IE1) waren als die dominanten CTL-Antigene bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die zur Immundominanz des pp65 f��hrenden molekularen Mechanismen aufzukl��ren und die Grundlagen f��r die Analyse der IE1-spezifischen Immunantwort zu erarbeiten. Durch Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener M��use wurden hochaffine pp65-spezifische CTL-Klone generiert. F��r die Generierung ��hnlicher CTL-Klone gegen IE1 konnte erstmals ein konserviertes HLA-A2-bindendes Peptid identifiziert werden. Mit Hilfe der pp65-spezifischen CTL-Klone konnte gezeigt werden, dass das durch Viruspartikel in die Zelle eingebrachte pp65 die Erkennung infizierter Zellen durch CD8+-CTL vermittelt. Durch den Nachweis der au��ergew��hnlichen Stabilit��t von pp65 in der Zelle gelang es, eine hohe metabolische Umsatzrate als eine Ursache von Immundominanz auszuschlie��en. Dagegen hob die Blockierung des CRM1-vermittelten nukle��ren Exportweges durch Zugabe von Hemmstoffen oder Zutransfektion kompetitiver Inhibitoren die Erkennung des pp65 nahezu auf. Hiermit wurde erstmalig eine Abh��ngigkeit der Pr��sentation eines immundominanten nukle��ren Proteins vom nukleozytoplasmatischen Transport nachgewiesen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage f��r die detaillierte Analyse der Zusammenh��nge zwischen nukle��rem Export und Antigenpr��sentation dar.

Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Pr��sentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine gro��e Bedrohung f��r Patienten mit geschw��chtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Pr��sentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Pr��sentation durch infizierte Zellen behindern. ��ber die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion f��r die Pr��sentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Pr��sentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Erg��nzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden ��ber Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener M��use CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifit��t und Sensitivit��t erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Pr��sentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Pr��sentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen k��nnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Pr��sentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeintr��chtigt wird. Dabei war die Pr��sentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollst��ndig unterdr��ckt. Die Pr��sentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Pr��sentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfl��che transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeintr��chtigen, jedoch nicht vollst��ndig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Pr��sentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schlie��lich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Pr��sentation vollst��ndig zu unterdr��cken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Pr��sentation von pp65 aus��bt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage f��r weiterf��hrende Untersuchungen zur Aufkl��rung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene f��r die Pr��sentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung f��r die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschlie��end ph��notypisch mittels Durchflu��zytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antik��rper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivit��tstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, da�� aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden k��nnen, welche Reaktivit��t gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und ��ber verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquit��re (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der nat��rlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antik��rpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach S��ureeluation und Filtration abgespalten und ��ber eine ���reverse phase���-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die ��berpr��fung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivit��t erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizit��tstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 ausl��sen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Fl��ssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexit��t aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivit��t dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung nat��rlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht m��glich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt m��glicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begr��ndet. In Folgearbeiten soll nun mit erh��hter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, er��ffnet neue therapeutische M��glichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabsto��ungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.