Motility tests for drugs preventing PolyQ aggregation in recombinant Caenorhabditis elegans.

The pathological formation of proteinaceous aggregates that accumulate into the brain cells of patients are hallmarks of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis and the heterogeneous group of polyglutamine (polyQ) diseases. In the polyQ diseases, the most upstream events of the pathogenic cascade are the misfolding and aggregation of proteins, such as huntingtin in Huntington's disease, that contain expanded stretch of glutamine residues above 35--‐40 repeats. This expanded polyQ stretch triggers the misfolding and aggregation of cytotoxic polyQ proteins in the neurons that cause cell death through different processes, like apoptosis, excessive inflammation, formation of free radicals, eventually leading to neuronal loss and neurodegeneration. This study focuses on the cellular network of chaperone proteins that can prevent protein aggregation by binding misfolding intermediates and may, as in the case of HSP70, actively unfold misfolded proteins into refoldable non--‐toxic ones (Hinault et al., 2010; Sharma et al., 2011). The chaperones can also collaborate with the proteasome to convert stable harmful proteins into harmless amino acids. Thus, the chaperone proteins that are the most important cellular factors of prevention and curing of protein misfolding, are negatively affected by aging (Morley et al., 2002) and fail to act properly in the neurons of aged persons, which eventually may lead to neurodegenerative pathologies. The general aim of this research was to identify least toxic drugs that can upregulate the expression of chaperone genes in cells suffering from polyQ--‐ mediated protein aggregation and degeneration. The specific aim of this study was to observe the effect of ten drugs on polyQ aggregation in a recombinant nematode Caenorhabditis elegans expressing a chimeric protein containing a sequence of 35 glutamines (Q35) fused to the green fluorescent protein in muscle cells, which causes an age--‐ and temperature--‐ dependent phenotype of accelerated paralysis. The drugs were selected after having proven their causing the overexpression of chaperone proteins in a previous wide screening of 2000 drugs on the moss plant Physcomitrella patens. The screening that we performed in this study was on these ten drugs. It suggested that piroxicam and anisindione were good reducers of polyglutamine disease mediated paralysis. A hypothesis can be made that they may act as good enhancers of the heat shock response, which causes the overexpression of many HSP chaperones and thus reduce motility impairment of polyQ disease expressing nematodes. Piroxicam was found to have the greatest effect on reducing polyQ35 proteins aggregates mediated paralysis in a dose--‐dependent manner but was also found to either have a toxic effect on wild type C.elegans, either to change its natural motility behavior, eventually reducing its motility in both cases. Chloroform should be preferred over DMSO as a drug solvent as it appears to be less toxic to C.elegans.

Functional GacS in Pseudomonas DSS73 prevents digestion by Caenorhabditis elegans and protects the nematode from killer flagellates.

The success of biocontrol bacteria in soil depends in part on their ability to escape predation. We explored the interactions between Pseudomonas strain DSS73 and two predators, the nematode Caenorhabditis elegans and the flagellate Cercomonas sp. Growth of the nematode in liquid culture was arrested when it was feeding on DSS73 or a DSS73 mutant (DSS73-15C2) unable to produce the biosurfactant amphisin, whereas a regulatory gacS mutant (DSS73-12H8) that produces no exoproducts supported fast growth of the nematode. The flagellate Cercomonas sp. was able to grow on all three strains. The biosurfactant-deficient DSS73 mutant caused severe dilation of the nematode gut. In three-species systems (DSS73, Cercomonas and C. elegans), the nematodes fed on the flagellates, which in turn grazed the bacteria and the number of C. elegans increased. The flagellates Cercomonas sp. usually kill C. elegans. However, DSS73 protected the nematodes from flagellate killing. Soil microcosms inoculated with six rhizobacteria and grazed by nematodes were colonized more efficiently by DSS73 than similar systems grazed by flagellates or without grazers. In conclusion, our results suggest that C. elegans and DSS73 mutually increase the survival of one another in complex multispecies systems and that this interaction depends on the GacS regulator.

Biologia reprodutiva de Calibrachoa elegans (Miers) Stehmann & Semir (Solanaceae)

Calibrachoa elegans é uma espécie anual, endêmica da região da canga do quadrilátero ferrífero de Minas Gerais, Brasil. O estudo da sua biologia reprodutiva envolveu experimentos de cruzamentos, teste do sistema de auto-incompatibilidade e observação do processo de polinização. Os experimentos realizados através de polinizações manuais indicam que a população estudada é preferencialmente alógama. A interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete das flores autopolinizadas, verificada através da microscopia de fluorescência, confirmou a ocorrência de reação de auto-incompatibilidade. A polinização é realizada apenas pelas fêmeas de Hexantheda missionica (Colletinae, Apoideae), uma abelha com alta fidelidade de visita às flores de C. elegans. Os machos desta espécie utilizam as flores como fonte de néctar, como local para pouso entre os vôos de patrulhamento a procura de fêmeas para acasalamento e como abrigo noturno. Para se acomodarem na flor, geralmente cortam e removem os estames e o estilete. As populações de Hexantheda missionica encontradas em Minas Gerais são o primeiro registro da espécie para a região sudeste do Brasil e, provavelmente, representam remanescentes que chegaram a esta região no passado e que agora se encontram disjuntas e isoladas das populações da região sul do Brasil.

The in vivo characterization of the DNA repair gene apn-1 in the model organism Caenorhabditis elegans

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.

Measuring and modelling mixture toxicity of imidacloprid and thiacloprid on Caenorhabditis elegans and Eisenia fetida

While the standard models of concentration addition and independent action predict overall toxicity of multicomponent mixtures reasonably, interactions may limit the predictive capability when a few compounds dominate a mixture. This study was conducted to test if statistically significant systematic deviations from concentration addition (i.e. synergism/antagonism, dose ratio- or dose level-dependency) occur when two taxonomically unrelated species, the earthworm Eisenia fetida and the nematode Caenorhabditis elegans were exposed to a full range of mixtures of the similar acting neonicotinoid pesticides imidacloprid and thiacloprid. The effect of the mixtures on C. elegans was described significantly better (p<0.01) by a dose level-dependent deviation from the concentration addition model than by the reference model alone, while the reference model description of the effects on E. fetida could not be significantly improved. These results highlight that deviations from concentration addition are possible even with similar acting compounds, but that the nature of such deviations are species dependent. For improving ecological risk assessment of simple mixtures, this implies that the concentration addition model may need to be used in a probabilistic context, rather than in its traditional deterministic manner. Crown Copyright (C) 2008 Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

The two Caenorhabditis elegans metallothioneins (CeMT-1 and CeMT-2) discriminate between essential zinc and toxic cadmium

The nematode Caenorhabditis elegans expresses two metallothioneins (MTs), CeMT-1 and CeMT-2, that are believed to be key players in the protection against metal toxicity. In this study, both isoforms were expressed in vitro in the presence of either Zn(II) or Cd(II). Metal binding stoichiometries and affinities were determined by ESI-MS and NMR, respectively. Both isoforms had equal zinc binding ability, but differed in their cadmium binding behaviour, with higher affinity found for CeMT-2. In addition, wild-type C. elegans, single MT knockouts and a double MT knockout allele were exposed to zinc (340 μm) or cadmium (25 μm) to investigate effects in vivo. Zinc levels were significantly increased in all knockout strains, but were most pronounced in the CeMT-1 knockout, mtl-1 (tm1770), while cadmium accumulation was highest in the CeMT-2 knockout, mtl-2 (gk125) and the double knockout mtl-1;mtl-2 (zs1). In addition, metal speciation was assessed by X-ray absorption fine-structure spectroscopy. This showed that O-donating, probably phosphate-rich, ligands play a dominant role in maintaining the physiological concentration of zinc, independently of metallothionein status. In contrast, cadmium was shown to coordinate with thiol groups, and the cadmium speciation of the wild-type and the CeMT-2 knockout strain was distinctly different to the CeMT-1 and double knockouts. Taken together, and supported by a simple model calculation, these findings show for the first time that the two MT isoforms have differential affinities towards Cd(II) and Zn(II) at a cellular level, and this is reflected at the protein level. This suggests that the two MT isoforms have distinct in vivo roles.

Caenorhabditis elegans as a model to screen plant extracts and compounds as natural anthelmintics for veterinary use

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Anthelmintic effect of plant extracts containing condensed and hydrolyzable tannins on Caenorhabditis elegans, and their antioxidant capacity

Although tannin-rich forages are known to increase protein uptake and to reduce gastrointestinal nematode infections in grazing ruminants, most published research involves forages with condensed tannins (CT), while published literature lacks information on the anthelmintic capacity, nutritional benefits, and antioxidant capacity of alternative forages containing hydrolyzable tannins (HT). We evaluated the anthelmintic activity and the antioxidant capacity of plant extracts containing either mostly CT, mostly HT, or both CT and HT. Extracts were prepared with 70% acetone, lyophilized, redissolved to doses ranging from 1.0mg/mL to 25mg/mL, and tested against adult Caenorhabditis elegans as a test model. The extract concentrations that killed 50% (LC50) or 90% (LC90) of the nematodes in 24h were determined and compared to the veterinary anthelmintic levamisole (8mg/mL). Extracts were quantified for CT by the acid butanol assay, for HT (based on gallic acid and ellagic acid) by high-performance liquid chromatography (HPLC) and total phenolics, and for their antioxidant activity by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. Extracts with mostly CT were Lespedeza cuneata, Salix X sepulcralis, and Robinia pseudoacacia. Extracts rich in HT were Acer rubrum, Rosa multiflora, and Quercus alba, while Rhus typhina had both HT and CT. The extracts with the lowest LC50 and LC90 concentrations, respectively, in the C. elegans assay were Q. alba (0.75 and 1.06mg/mL), R. typhina collected in 2007 (0.65 and 2.74mg/mL), A. rubrum (1.03 and 5.54mg/mL), and R. multiflora (2.14 and 8.70mg/mL). At the doses of 20 and 25mg/mL, HT-rich, or both CT- and HT-rich, extracts were significantly more lethal to adult C. elegans than extracts containing only CT. All extracts were high in antioxidant capacity, with ORAC values ranging from 1800μmoles to 4651μmoles of trolox equivalents/g, but ORAC did not correlate with anthelmintic activity. The total phenolics test had a positive and highly significant (r=0.826, p≤0.01) correlation with total hydrolyzable tannins. Plants used in this research are naturalized to the Appalachian edaphoclimatic conditions, but occur in temperate climate areas worldwide. They represent a rich, renewable, and unexplored source of tannins and antioxidants for grazing ruminants, whereas conventional CT-rich forages, such as L. cuneata, may be hard to establish and adapt to areas with temperate climate. Due to their high in vitro anthelmintic activity, antioxidant capacity, and their adaptability to non-arable lands, Q. alba, R. typhina, A. rubrum, and R. multiflora have a high potential to improve the health of grazing animals and must have their anthelmintic effects confirmed in vivo in both sheep and goats. © 2012.

Metodologia para quantificar ricina em sementes de mamona com o uso de Caenorhabditis elegans

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

Genetische und funktionelle Analyse von Vesikelmembranprotein-Mutanten in Maus und Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind konservierte, ubiquitär vorkommende Membranproteine synaptischer Vesikel und zytoplasmatischer Transportvesikel. Bei Säugetieren lassen sie sich in die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins) unterteilen, die im Nematoden C. elegans jeweils nur durch ein einzelnes Polypeptid vertreten sind (Synaptophysin-1 [SPH-1], Synaptogyrin-1 [SNG-1] und SCAMP-1 [SCM-1]). Obwohl den TVPs eine Beteiligung bei der Regulation des Vesikelzyklus zugesprochen wurde, sind Synaptophysin-1-Knockout-Mäuse und vollständig TVP-defiziente Würmer gesund und weisen nur geringgradige Veränderungen auf. In dieser Arbeit sollten daher zum einen genomweite komparative Transkriptomanalysen durchgeführt werden, um mögliche Kompensationsmechanismen in der Maus und C. elegans zu finden, zum anderen sollten mit Hilfe pharmakologischer Stressassays und genetischer Verfahren Schwachstellen und Redundanzen identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnten durch Affymetrix GeneChip-Analysen der RNA in der Retina von Synaptophysin-1-/--Mäusen keine differenziell exprimierten Gene gefunden werden. Bei der Untersuchung der C. elegans-TVP-Dreifachmutante wurden hingegen 17 Gene mit erhöhter und 3 mit erniedrigter Transkription identifiziert. Die Befunde für 12 hochregulierte Gene wurden durch quantitative Real-Time RT-PCR bestätigt. Das am stärksten hochregulierte Gen arf-1.1 kodiert für eine GTPase, die vermutlich an der Regulation der Vesikelbildung beteiligt ist. Von den ebenso identifizierten Genen cdr-2, cdr-4 und pgp-9 ist bekannt, dass sie in Stresssituationen, z. B. in Gegenwart von Cadmium, verstärkt transkribiert werden. ugt-62 und ugt-19 kodieren für Glucuronosyltransferasen. Für arf-1.1, cdr-2, ugt-62 sowie für das Gen T16G1.6, das für eine coiled-coil-Domäne kodiert, wurden im Folgenden fluoreszierende Promoterkonstrukte hergestellt, um Koexpressionsmuster mit TVPs zu bestimmen. Es stellte sich heraus, dass alle vier Promoterkonstrukte im Darm zusammen mit SPH-1 und SCM-1 im Darm transkribiert werden. Mit fluoreszierenden Translationschimären konnte weiterhin gezeigt werden, dass ARF-1.1 und CDR-2 mit den Darm-spezifischen TVPs im apikalen Bereich der Darmzellen kolokalisieren. Um mehr über die Funktion von TVPs im Vesikelzyklus zu erfahren, wurden pharmakologische und genetische Analysen von Würmern durchgeführt, in denen die Expression des Neuronen-spezifischen SNG-1 verändert ist. Deletion oder Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber dem Acetylcholinesterase-Inhibitor Aldicarb und zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem GABA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol. Auf genetischer Ebene zeigte sich, dass sng-1 synthetisch mit den Genen für Synaptotagmin-1, Endophilin A sowie Synaptojanin wirkt. Die beobachteten Effekte weisen auf alternative Funktionen in der synaptischen Übertragung hin und unterstützen zugleich die Hypothese, dass SNG-1 im synaptischen Vesikelzyklus eine wichtige Funktion erfüllt, die möglicherweise einem noch unbekannten redundanten Kompartiment-spezifischen Signalweg der synaptischen Transmission zuzuordnen ist.

Identifizierung und Charakterisierung von Intermediärfilament-Organisatoren in Caenorhabditis elegans

Intermediärfilamente (IFs) sind neben Mikrotubuli und Aktinfilamenten die dritte filamentäre Komponente des Zytoskeletts. Sie wirken als mechanische Stabilisatoren, sind außerdem an Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose beteiligt und tragen zu Zellpolarität bei. IFs sind dynamische Strukturen, die zelltypspezifisch in unterschiedlichen Anordnungen und Abundanzen vorkommen und von Signalkaskaden beeinflusst werden. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser fein abgestimmten Prozesse sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deswegen ein Tiermodell entwickelt werden, um Regulatoren der IF-(Netzwerk)-Organisation in vivo zu untersuchen und zu identifizieren. Dazu wurde C. elegans ausgewählt, da es sich hierbei um einen genetisch gut charakterisierten und leicht manipulierbaren Organismus handelt, in dessen Genom elf Gene für zytoplasmatische IFs kodieren. Zunächst wurden stabil transgene C. elegans-Linien generiert, die fluoreszierende IFs exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass das darmspezifische IFB-2::CFP im Bereich des apikalen Junktionskomplex verankert ist und nahezu vollständig im subapikalen Terminalgeflecht der Enterozyten lokalisiert, das als Teil der endotube besonders stabil und widerstandsfähig ist. Wenn diese Tiere mit dsRNA gegen das ebenfalls im Terminalgeflecht exprimierte IF ifc-2 behandelt wurden, entwickelten sich blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens, die auf eine Schwächung der rigiden und formgebenden endotube hinwiesen und damit einen direkten in vivo-Beweis für die stressprotektive Funktion des intestinalen IF-Netzwerks lieferten. Die leichte Detektierbarkeit des IFB-2::CFP-Musters wurde in einem optischen Screen ausgenutzt, bei dem nach chemischer Mutagenese nach Veränderungen im IF-Muster gefahndet wurde. Hierbei wurden drei Mutanten isoliert. In Komplementationsanalysen stellte sich heraus, dass es sich in zwei Fällen um Allele desselben Gens handelt. Die Identifizierung der betroffenen Gene gelang durch eine PCR-basierte Kartierung von single nucleotide polymorphisms nach Verpaarung mit dem Hawaii-Stamm (snp-mapping) und anschließender RNAi-Analyse der Einzelgene in den identifizierten Chromosomenabschnitten. Im einen Fall handelte es sich um das sma-5-Gen, einer Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu den MAP-Kinasen MAPK7/ERK5 der Säuger. Hier wurden, ebenso wie beim ifc-2 (RNAi)-Phänotyp, progressive blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens beobachtet. Die beiden anderen Allele tragen Mutationen in einem bisher nicht näher charakterisierten Gen. In diesen Würmern kommt es zu einem vollständigen Auflösung des IFB-2::CFP-Netzwerks mit prominenten Akkumulationen um die apikalen Junktionen. Das Darmlumen ist stellenweise geweitet und das elektronendichte Terminalgeflecht fehlt fast vollständig, die Integrität des Darmepithels ist jedoch nicht kompromittiert. Die anderen IFs des Terminalgeflechts sind ebenfalls fehlverteilt, und die intestinale Expression von Aktin ist stark reduziert. Expressionskonstrukte des Gens zeigten weiterhin, dass es darmspezifisch synthetisiert wird und mit den IFs im Terminalgeflecht kolokalisiert. Das Protein ist, ähnlich wie das IF-assoziierte Filaggrin der Säuger ausgesprochen histidinreich. Es enthält außerdem eine Prolin-reiche Domäne, die Teil einer potentiellen Aktin-Bindedomäne ist. Auf Grund all dieser Eigenschaften wird die Bezeichnung IFO-1 (intermediate filament organizer) für das neue Protein vorgeschlagen, das möglicherweise als struktureller Zytoskelett-Linker wirkt. Die vorgestellten Ergebnisse untermauern die Bedeutung von C. elegans für die Identifizierung von Faktoren, die IF-Netzwerke regulieren, und die Möglichkeit, Defekte im lebenden Gesamtorganismus zu bestimmen.

Molecular basis of Corynebacterium diphtheriae virulence and infection in the Caenorhabditis elegans model host

Corynebacterium diphtheriae is the causative agent of cutaneous and pharyngeal diphtheria in humans. While lethality is certainly caused by diphtheria toxin, corynebacterial colonization may primarily require proteinaceous fibers called pili, which mediate adherence to specific tissues. The type strain of C. diphtheriae possesses three distinct pilus structures, namely the SpaA, SpaD, and SpaH-type pili, which are encoded by three distinct pilus gene clusters. The pilus is assembled onto the bacterial peptidoglycan by a specific transpeptidase enzyme called sortase. Although the SpaA pili are shown to be specific for pharyngeal cells in vitro, little is known about functions of the three pili in bacterial pathogenesis. This is mainly due to lack of in vivo models of corynebacterial infection. As an alternative to mouse models as mice do not have functional receptors for diphtheria toxin, in this study I use Caenorhabditis elegans as a model host for C. diphtheriae. A simple C. elegans model would be beneficial in determining the specific role of each pilus-type and the literature suggests that C. elegans infection model can be used to study a variety of bacterial species giving insight into bacterial virulence and host-pathogen interactions. My study examines the hypothesis that pili and toxin are major virulent determinants of C. diphtheriae in the C. elegans model host.

Modern tools to study nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in Caenorhabditis elegans.

The nematode Caenorhabditis elegans is characterized by many features that make it highly attractive to study nuclear pore complexes (NPCs) and nucleocytoplasmic transport. NPC composition and structure are highly conserved in nematodes and being amenable to a variety of genetic manipulations, key aspects of nuclear envelope dynamics can be observed in great details during breakdown, reassembly, and interphase. In this chapter, we provide an overview of some of the most relevant modern techniques that allow researchers unfamiliar with C. elegans to embark on studies of nucleoporins in an intact organism through its development from zygote to aging adult. We focus on methods relevant to generate loss-of-function phenotypes and their analysis by advanced microscopy. Extensive references to available reagents, such as mutants, transgenic strains, and antibodies are equally useful to scientists with or without prior C. elegans or nucleoporin experience.

Multi-Environment Model Estimation for Motility Analysis of Caernorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is a well-known model organism used to investigate fundamental questions in biology. Motility assays of this small roundworm are designed to study the relationships between genes and behavior. Commonly, motility analysis is used to classify nematode movements and characterize them quantitatively. Over the past years, C. elegans' motility has been studied across a wide range of environments, including crawling on substrates, swimming in fluids, and locomoting through microfluidic substrates. However, each environment often requires customized image processing tools relying on heuristic parameter tuning. In the present study, we propose a novel Multi-Environment Model Estimation (MEME) framework for automated image segmentation that is versatile across various environments. The MEME platform is constructed around the concept of Mixture of Gaussian (MOG) models, where statistical models for both the background environment and the nematode appearance are explicitly learned and used to accurately segment a target nematode. Our method is designed to simplify the burden often imposed on users; here, only a single image which includes a nematode in its environment must be provided for model learning. In addition, our platform enables the extraction of nematode ‘skeletons’ for straightforward motility quantification. We test our algorithm on various locomotive environments and compare performances with an intensity-based thresholding method. Overall, MEME outperforms the threshold-based approach for the overwhelming majority of cases examined. Ultimately, MEME provides researchers with an attractive platform for C. elegans' segmentation and ‘skeletonizing’ across a wide range of motility assays.