Functional studies of {\it twist\/} during mouse embryogenesis

A fundamental task in developmental biology is to understand the molecular mechanisms governing early embryogenesis. The aim of this study was to understand the developmental role of a putative basic helix-loop-helix (b-HLH) transcription factor, twist, during mouse embryogenesis.^ twist was originally identified in Drosophila as one of the zygotic genes, including snail, that were required for dorsal-ventral patterning. In Drosophila embryogenesis, twist is expressed in the cells of the ventral midline destined to form mesoderm. In embryos lacking twist expression, their ventral cells fail to form a ventral furrow and subsequently no mesoderm is formed.^ During mouse embryogenesis, twist is expressed after initial mesoderm formation in both mesoderm and cranial neural crest cell derivatives. To study the role of twist in vivo, twist-null embryos were generated by gene targeting. Embryos homozygous for the twist mutation die at midgestation. The most prominent phenotype in the present study was a failure of the cranial neural tube to close (exencephaly). twist-null embryos also showed defects in head mesenchyme, branchial arches, somites, and limb buds.^ To understand whether twist functions cell-autonomously and to investigate how twist-null cells interact with wild-type cells in vivo, twist chimeras composed of both twist-null and wild-type cells marked by the expression of the lacZgene were generated. Chimeric analysis revealed a correlation between the incidence of exencephaly and the contribution of the underlying twist-null head mesenchyme, thus strongly suggesting that twist-expressing head mesenchyme is required for the closure of the cranial neural tube. These studies have identified twist as a critical regulator for the mesenchymal fate determination within the cranial neural crest lineage. Most strikingly, twist-null head mesenchyme cells were always segregated from wild-type cells, indicating that the twist mutation altered the adhesive specificity of these cells. Furthermore, these results also indicated that twist functions cell-autonomously in the head, arch, and limb mesenchyme but non-cell-autonomously in the somites. Taken together, these studies have established the essential role of twist during mouse embryogenesis. ^

Calcium-dependent mechanisms and long-term potentiation: Role of NMDA receptors, voltage -dependent calcium channels and persistent protein kinase activity

Long-term potentiation (LTP) is a rapidly induced and long lasting increase in synaptic strength and is the leading cellular model for learning and memory in the mammalian brain. LTP was first identified in the hippocampus, a structure implicated in memory formation. LTP induction is dependent on postsynaptic Ca2+ increases mediated by N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Activation of other postsynaptic routes of Ca2+ entry, such as voltage-dependent Ca2+ channels (VDCCs) have subsequently been shown to induce a long-lasting increase in synaptic strength. However, it is unknown if VDCC-induced LTP utilized similar cellular mechanisms as the classical NMDA receptor-dependent LTP and if these two forms of LTP display similar properties. This dissertation determines the similarities and differences in VDCC and NMDA receptor-dependent LTP in area CA1 of hippocampal slices and demonstrates that VDCCs and NMDA receptors activate similar cellular mechanisms, such as protein kinases, to induce LTP. However, VDCC and NMDA receptor activated LTP induction mechanisms are compartmentalized in the postsynaptic neuron, such that they do not interact. Consistent with activation properties of NMDA receptors and VDCCs, NMDA receptor and VDCC-dependent LTP have different induction properties. In contrast to NMDA-dependent LTP, VDCC-induced potentiation does not require evoked presynaptic stimulation or display input specificity. These results indicate that there are two different routes of postsynaptic Ca2+ which can induce LTP and the compartmentation of VDCCs and NMDA receptors and/or their resulting Ca2+ increases may account for the distinction between these LTP induction mechanisms.^ One of the molecular targets for postsynaptic Ca2+ that is required for the induction of LTP is protein kinases. Evidence for the role of protein kinase activity in LTP expression is either correlational or controversial. We have utilized a broad range and potent inhibitors of protein kinases to systematically examine the temporal requirement for protein kinases in the induction and expression of LTP. Our results indicate that there is a critical period of persistent protein kinase activity required for LTP induction activated by tetanic stimulation and extending until 20 min after HFS. In addition, our results suggest that protein kinase activity during and immediately after HFS is not sufficient for LTP induction. These results provide evidence for persistent and/or Ca2+ independent protein kinase activity involvement in LTP induction. ^

Specificity of somatostatin receptor and G -protein interactions as characterized by somatostatin receptor subtype specific antibodies

The neuropeptide somatostatin is a widely distributed general inhibitor of endocrine, exocrine, gastrointestinal and neural functions. The biological actions of somatostatin are initiated by interaction with high affinity, plasma membrane somatostatin receptors (sst receptors). Five sst receptor subtypes have been cloned and sequence analysis shows they are all members of the G protein coupled receptor superfamily. The G proteins play a pivotal role in sst receptor signal transduction and the specificity of somatostatin receptor-G protein coupling defines the possible range of cellular responses. However, the data for endogenous sst receptor and G protein coupling is very limited, and even when it is available, the sst receptor subtypes involved in G protein coupling and signal transduction are unknown due to the expression of multiple sst receptor subtypes in target cell lines or tissues of somatostatin.^ In an effort to characterize each individual sst receptor subtypes, antisera against unique C-terminal regions of different sst receptor subtypes have been developed in our lab. In this report, antisera made against the sst1, sst2A and sst4 receptors are characterized. They are highly specific to their corresponding receptors and efficiently immunoprecipitate the sst receptors. Using these antibodies, the cell lines expressing these sst receptor subtypes were identified with both immunoprecipitation and Western blot methods. The development of sst receptor subtype specific antibodies make it possible to determine the specificity of the sst receptor subtype and G protein coupling in target cells or tissues expressing multiple sst receptors, two questions were addressed by this thesis: (1) whether different cellular environments affect receptor subtype and G protein coupling; (2) whether different sst receptors couple to different G proteins in similar cellular environments.^ Taken together our findings, both sst1 and sst2A receptors couple with G$\alpha\sb{\rm i1},$ G$\alpha\sb{\rm i2}$ and G$\alpha\sb{\rm i3}$ in CHO cells, G$\alpha\sb{\rm i2}$ and G$\alpha\sb{\rm i3}$ in GH$\sb4$C$\sb1$ cells. Further, sst2A receptors couple with G$\alpha\sb{\rm i1},$ G$\alpha\sb{\rm i2}$ and G$\alpha\sb{\rm i3}$ in AR4-2J cells while sst4 receptors couple with G$\alpha\sb{\rm i2}$ and G$\alpha\sb{\rm i3}$ in CHO cells. Therefore, the G protein coupling of the same sst receptors in different cell lines is basically similar in that they all couple with multiple $\alpha$-subunits of the G$\rm \sb{i}$ proteins, suggesting cellular environment has little effect on receptor and G protein coupling. Moreover, different sst receptors have similar G protein coupling specificities in the same cell line, suggesting components other than receptor and G$\alpha$ subunits in the signal transduction pathways may contribute to specific functions of each sst receptor subtype. This series of experiments represent a novel approach in dissecting signal transduction pathways and may have general application in the field. Furthermore, this is the first systematic study of sst receptor subtype and G protein $\alpha$-subunit interaction in both transfected cells and in normal cell lines. The information generated will be very useful in our understanding of sst receptor signal transduction pathways and in directing future sst receptor research. ^

Inactivation and self -association of CaM kinase: Effects of ATP, substrate binding domains, and isozymic forms

Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM kinase) is a multifunctional Ser/Thr protein kinase, that is highly enriched in brain and is involved in regulating many aspects of neuronal function. We observed that forebrain CaM kinase from crude homogenates, cytosolic fractions and purified preparations inactivates and translocates into the particulate fraction following autophosphorylation. Using purified forebrain CaM kinase as well as recombinant $\alpha$ isozyme, we determined that the formation of particulate enzyme was due to enzyme self-association. The conditions of autophosphorylation determine whether enzyme self-association and/or inactivation will occur. Self-association of CaM kinase is sensitive to pH, ATP concentration, and enzyme autophosphorylation. This process is prevented by saturating concentrations of ATP. However, in limiting ATP, pH is the dominant factor, and enzyme self-association occurs at pH values $\rm{<}7.0.$ Site-specific mutants were produced by substituting Ala for Thr286, Thr253, or Thr305,306 to determine whether these sites of autophosphorylation affect enzyme inactivation and self-association. The only mutation that influenced these processes was Ala286, which removed the protective effect afforded by autophosphorylation in saturating ATP. Enzyme inactivation occurs in the presence and absence of self-association and appears predominantly sensitive to nucleotide concentration, because saturating concentrations of $\rm Mg\sp{2+}/ADP$ or $\rm Mg\sp{2+}/ATP$ prevent this process. These data implicate the ATP binding pocket in both inactivation and self-association. We also observed that select peptide substrates and peptide inhibitors modeled after the autoregulatory domain of CaM kinase prevented these processes. The $\alpha$ and $\beta$ isozymes of CaM kinase were characterized independently, and were observed to exhibit differences in both enzyme inactivation and self-association. The $\beta$ isozyme was less sensitive to inactivation, and was never observed to self-associate. Biophysical characterization, and transmission electron microscopy coupled with image analysis indicated both isozymes were multimeric, however, the $\alpha$ and $\beta$ isozymes appeared structurally different. We hypothesize that the $\alpha$ subunit of CaM kinase plays both a structural and enzymatic role, and the $\beta$ subunit plays an enzymatic role. The ramifications for the functional differences observed for inactivation and self-association are discussed based on potential structural differences and autoregulation of the $\alpha$ and $\beta$ isozymes in both calcium-induced physiological and pathological processes. ^

Development of combined micro -preparation, separation, and mass spectrometry methods and application in the microdialysis study of neuropeptide metabolism

Two sets of mass spectrometry-based methods were developed specifically for the in vivo study of extracellular neuropeptide biochemistry. First, an integrated micro-concentration/desalting/matrix-addition device was constructed for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI MS) to achieve attomole sensitivity for microdialysis samples. Second, capillary electrophoresis (CE) was incorporated into the above micro-liquid chromatography (LC) and MALDI MS system to provide two-dimensional separation and identification (i.e. electrophoretic mobility and molecular mass) for the analysis of complex mixtures. The latter technique includes two parts of instrumentation: (1) the coupling of a preconcentration LC column to the inlet of a CE capillary, and (2) the utilization of a matrix-precoated membrane target for continuous CE effluent deposition and for automatic MALDI MS analysis (imaging) of the CE track.^ Initial in vivo data reveals a carboxypeptidase A (CPA) activity in rat brain involved in extracellular neurotensin metabolism. Benzylsuccinic acid, a CPA inhibitor, inhibited neurotensin metabolite NT1-12 formation by 70%, while inhibitors of other major extracellular peptide metabolizing enzymes increased NT1-12 formation. CPA activity has not been observed in previous in vitro experiments. Next, the validity of the methodology was demonstrated in the detection and structural elucidation of an endogenous neuropeptide, (L)VV-hemorphin-7, in rat brain upon ATP stimulation. Finally, the combined micro-LC/CE/MALDI MS was used in the in vivo metabolic study of peptide E, a mu-selective opioid peptide with 25 amino acid residues. Profiles of 88 metabolites were obtained, their identity being determined by their mass-to-charge ratio and electrophoretic mobility. The results indicate that there are several primary cleavage sites in vivo for peptide E in the release of its enkephalin-containing fragments. ^

Structural determinants of subunit -subunit interactions and subcellular localization of the calcium /calmodulin -dependent protein kinase II

The multifunctional Ca$\sp{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM kinase) is a Ser/Thr directed protein kinase that participates in diverse Ca$\sp{2+}$ signaling pathways in neurons. The function of CaM kinase depends upon the ability of subunits to form oligomers and to interact with other proteins. Oligomerization is required for autophosphorylation which produces significant functional changes that include Ca$\sp{2+}$/calmodulin-independent activity and calmodulin trapping. Associations with other proteins localize CaM kinase to specific substrates and effectors which serves to optimize the efficiency and speed of signal transduction. In this thesis, we investigate the interactions that underlie the appropriate positioning of CaM kinase activity in cells. We demonstrate that the subcellular distribution of CaM kinase is dynamic in hippocampal slices exposed to anoxic/aglycemic insults and to high K$\sp{+}$-induced depolarization. We determine the localization of CaM kinase domains expressed in neurons and PC-12 cells and find that the C-terminal domain of the $\alpha$ subunit is necessary for localization to dendrites. Moreover, monomeric forms of the enzyme gain access to the nucleus. Attempts made to identify novel CaM kinase binding proteins using the yeast two-hybrid system resulted in the isolation of hundreds of positive clones. Those that have been sequenced are identical to CaM kinase isoforms. Finally, we report the discovery of specific regions within the C-terminal domain that are necessary and sufficient for subunit-subunit interactions. Differences between the $\alpha$ and $\beta$ isoforms were discovered that indicate unique structural requirements for oligomerization. A model for how CaM kinase subunits interact to form holoenzymes and how structural heterogeneity might influence CaM kinase function is presented. ^

Proteolytic mechanisms of cell injury following glucose -oxygen deprivation in primary neuronal cultures

Researchers have historically emphasized the contribution of caspase-3 to apoptotic but not necrotic cell death, while calpain has been implicated primarily in necrosis and, to a lesser extent, in apoptosis. Activation of these proteases occurs in vivo following various CNS insults including ischemia. In addition, both necrotic and apoptotic cell death phenotypes are detected following ischemia. However, the contributions of calpain and caspase-3 to apoptotic and necrotic cell death phenotypes following CNS insults are relatively unexplored. To date, no study has examined the concurrent activation of calpain and caspase-3 in necrotic and apoptotic cell death phenotypes following any CNS insult. The present study employed oxygen-glucose deprivation (OGD) to determine the relative contributions of caspase-3 and calpain to apoptotic and necrotic cell death following OGD. Experiments characterized a model of OGD by evaluating cell viability and characterizing the cell death phenotypes following OGD in primary septo-hippocampal co-cultures. Furthermore, cell markers (NeuN and MAP2 or GFAP) assessed the effects of OGD on neuronal and astroglial viability, respectively. In addition, calpain and caspase-3 mediated proteolysis of α-spectrin was examined using Western blot techniques. Activation of these proteases in individual cells phenotypically characterized as apoptotic and necrotic was also evaluated by using antibodies specific for calpain or caspase-3 mediated breakdown products to α-spectrin. Administration of appropriate caspase-3 and calpain inhibitors also examined the effects of protease inhibition on cell death. OGD produced prominent expression of apoptotic cell death phenotypes primarily in neurons, with relatively little damage to astroglia. Although Western blot data suggested greater proteolysis of α-spectrin by calpain than caspase-3, co-activation of both proteases was usually detected in cells exhibiting apoptotic or necrotic cell death phenotypes. While inhibition of calpain and caspase-3 activity decreased LDH release following OGD, it was not clear whether this effect was also associated with a decrease in cell death and the appearance of apoptotic cell death phenotypes. These data demonstrate that both calpain and caspase-3 contribute to the expression of apoptotic cell death phenotypes following OGD, and that calpain could potentially have a larger role in the expression of apoptotic cell death than previously thought. ^

Contribution différentielle de Neuroligine‐1 et d’EphA4 à la régulation du sommeil

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil.

Relevance of CD40/CD40L downstream pathways to Alzheimer's disease

The amyloid cascade hypothesis places amyloid-β at the origin of Alzheimer's disease (AD). Amyloid-β (Aβ) is the product of the sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by the enzymes β- and γ-secretases. An inflammatory component to AD has been suggested in association with CD40 (a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRS) and its cognate ligand CD40L. In this study, I hypothesized that the neutralization of pro-inflammatory cytokines produced downstream of CD40/CD40L interaction would reduce APP processing. I also hypothesized that blocking the binding of different adaptor proteins to CD40 by mutating its cytoplasmic tail would result in significant reduction of the APP metabolites: Aβ, sAPPβ, sAPPα, CTFβ and CTFα. ^ Treatment with CD40L of human embryonic kidney cells over-expressing both APP and CD40 (HEK/APPsw/CD40) significantly increased levels of the cytokine granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). Neutralizing antibodies against GM-CSF mitigated the CD40L-induced production of Aβ in these cells. Treatment of the HEK/APPsw/CD40 cells with recombinant GM-CSF significantly increased Aβ levels. GM-CSF receptor gene silencing with shRNA significantly reduced Aβ levels to below base line in non-stimulated HEK/APPsw/CD40 cells. Silencing of the GM-CSF receptor also decreased APP endocytosis (therefore reducing the availability of APP to be cleaved in the endosomes). ^ Using CD40 mutants, I show that CD40L can increase levels of Aβ(1-40), Aβ(1-42), sAPPβ, sAPPα and CTFβ independently of TRAF signaling. TRAFs had been shown to be necessary for most CD40/CD40L-dependent signaling. An increase in mature/immature APP ratio after CD40L treatment of CD40wt and CD40-mutant cells was observed, reflecting alterations in APP trafficking. CD4OL treatment of a neuroblastoma cell line over-expressing CTFβ suggested that CD40L affected γ-secretase activity. Inhibition of γ-secretase activity significantly reduced sAPPβ levels in the CD40L treated HEK/APPsw CD40wt and the CD40-mutant cells. The latter suggests CD40/CD40L interaction primarily acts on γ-secretase and affects β-secretase via a positive feedback mechanism. ^ Taken together, the results of this dissertation suggest that GM-CSF operates downstream of CD40/CD40L interaction and that GM-CSF modulates Aβ production by influencing APP trafficking. Moreover, the data presented suggest that CD40/CD40L interaction can modulate APP processing via a mechanism independent of TRAF signaling. ^

Role of calcium in inflammation: Relevance to Alzheimer's disease

Alzheimer’s disease (AD) is neuropathologically characterized by excessive beta -amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated tau in the brain. Although the etiology of genetic cases of AD has been attributed to mutations in presenilin and amyloid precursor protein (APP) genes, in most sporadic cases of AD, the etiology is still unknown and various predisposing factors could contribute to the pathology of AD. Predominant among these possible predisposing factors that have been implicated in AD are age, hypertension, traumatic brain injury, diabetes, chronic neuroinflammation, alteration in calcium levels and oxidative stress. Since both inflammation and altered calcium levels are implicated in the pathogenesis of AD, we wanted to study the effect of altered levels of calcium on inflammation and the subsequent effect of selective calcium channel blockers on the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. Our hypothesis is that Aβ, depending on it conformation, may contribute to altered levels of intracellular calcium in neurons and glial cells. We wanted to determine which conformation of Aβ was most pathogenic in terms of increasing inflammation and calcium influx and further elucidate the possibility of a link between altered calcium levels and inflammation. In addition, we wanted to test whether calcium channel blockers could inhibit the inflammation mediated by the most pathogenic form of Aβ, by antagonizing the calcium influx triggered by Aβ. Our results in human glial and neuronal cells demonstrate that the high molecular weight oligomers are the most potent at stimulating the release of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 as well as increasing intracellular levels of calcium compared to other conformations of Aβ. Further, L-type calcium channel blockers and calmodulin kinase inhibitors are able to significantly reduce the levels of IL-6 and IL-8. These results suggest that Aβ-induced alteration of intracellular calcium levels contributes to its pro-inflammatory effect.

Mechanisms underlying activation of neural stem cells in the adult central nervous system

À la fin du 19e siècle, Dr. Ramón y Cajal, un pionnier scientifique, a découvert les éléments cellulaires individuels, appelés neurones, composant le système nerveux. Il a également remarqué la complexité de ce système et a mentionné l’impossibilité de ces nouveaux neurones à être intégrés dans le système nerveux adulte. Une de ses citations reconnues : “Dans les centres adultes, les chemins nerveux sont fixes, terminés, immuables. Tout doit mourir, rien ne peut être régénérer” est représentative du dogme de l’époque (Ramón y Cajal 1928). D’importantes études effectuées dans les années 1960-1970 suggèrent un point de vue différent. Il a été démontré que les nouveaux neurones peuvent être générés à l’âge adulte, mais cette découverte a créé un scepticisme omniprésent au sein de la communauté scientifique. Il a fallu 30 ans pour que le concept de neurogenèse adulte soit largement accepté. Cette découverte, en plus de nombreuses avancées techniques, a ouvert la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies neurodégénératives. Les cellules souches neurales (CSNs) adultes résident principalement dans deux niches du cerveau : la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et le gyrus dentelé de l’hippocampe. En condition physiologique, le niveau de neurogenèse est relativement élevé dans la zone sous-ventriculaire contrairement à l’hippocampe où certaines étapes sont limitantes. En revanche, la moelle épinière est plutôt définie comme un environnement en quiescence. Une des principales questions qui a été soulevée suite à ces découvertes est : comment peut-on activer les CSNs adultes afin d’augmenter les niveaux de neurogenèse ? Dans l’hippocampe, la capacité de l’environnement enrichi (incluant la stimulation cognitive, l’exercice et les interactions sociales) à promouvoir la neurogenèse hippocampale a déjà été démontrée. La plasticité de cette région est importante, car elle peut jouer un rôle clé dans la récupération de déficits au niveau de la mémoire et l’apprentissage. Dans la moelle épinière, des études effectuées in vitro ont démontré que les cellules épendymaires situées autour du canal central ont des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence (neurones, astrocytes, oligodendrocytes). Il est intéressant de noter qu’in vivo, suite à une lésion de la moelle épinière, les cellules épendymaires sont activées, peuvent s’auto-renouveller, mais peuvent seulement ii donner naissance à des cellules de type gliale (astrocytes et oligodendrocytes). Cette nouvelle fonction post-lésion démontre que la plasticité est encore possible dans un environnement en quiescence et peut être exploité afin de développer des stratégies de réparation endogènes dans la moelle épinière. Les CSNs adultes jouent un rôle important dans le maintien des fonctions physiologiques du cerveau sain et dans la réparation neuronale suite à une lésion. Cependant, il y a peu de données sur les mécanismes qui permettent l'activation des CSNs en quiescence permettant de maintenir ces fonctions. L'objectif général est d'élucider les mécanismes sous-jacents à l'activation des CSNs dans le système nerveux central adulte. Pour répondre à cet objectif, nous avons mis en place deux approches complémentaires chez les souris adultes : 1) L'activation des CSNs hippocampales par l'environnement enrichi (EE) et 2) l'activation des CSNs de la moelle épinière par la neuroinflammation suite à une lésion. De plus, 3) afin d’obtenir plus d’information sur les mécanismes moléculaires de ces modèles, nous utiliserons des approches transcriptomiques afin d’ouvrir de nouvelles perspectives. Le premier projet consiste à établir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à travers lesquels l’environnement enrichi module la plasticité du cerveau adulte. Nous avons tout d’abord évalué la contribution de chacune des composantes de l’environnement enrichi à la neurogenèse hippocampale (Chapitre II). L’exercice volontaire promeut la neurogenèse, tandis que le contexte social augmente l’activation neuronale. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de ces composantes sur les performances comportementales et sur le transcriptome à l’aide d’un labyrinthe radial à huit bras afin d’évaluer la mémoire spatiale et un test de reconnaissante d’objets nouveaux ainsi qu’un RNA-Seq, respectivement (Chapitre III). Les coureurs ont démontré une mémoire spatiale de rappel à court-terme plus forte, tandis que les souris exposées aux interactions sociales ont eu une plus grande flexibilité cognitive à abandonner leurs anciens souvenirs. Étonnamment, l’analyse du RNA-Seq a permis d’identifier des différences claires dans l’expression des transcripts entre les coureurs de courte et longue distance, en plus des souris sociales (dans l’environnement complexe). iii Le second projet consiste à découvrir comment les cellules épendymaires acquièrent les propriétés des CSNs in vitro ou la multipotence suite aux lésions in vivo (Chapitre IV). Une analyse du RNA-Seq a révélé que le transforming growth factor-β1 (TGF-β1) agit comme un régulateur, en amont des changements significatifs suite à une lésion de la moelle épinière. Nous avons alors confirmé la présence de cette cytokine suite à la lésion et caractérisé son rôle sur la prolifération, différentiation, et survie des cellules initiatrices de neurosphères de la moelle épinière. Nos résultats suggèrent que TGF-β1 régule l’acquisition et l’expression des propriétés de cellules souches sur les cellules épendymaires provenant de la moelle épinière.

Mechanisms underlying activation of neural stem cells in the adult central nervous system

À la fin du 19e siècle, Dr. Ramón y Cajal, un pionnier scientifique, a découvert les éléments cellulaires individuels, appelés neurones, composant le système nerveux. Il a également remarqué la complexité de ce système et a mentionné l’impossibilité de ces nouveaux neurones à être intégrés dans le système nerveux adulte. Une de ses citations reconnues : “Dans les centres adultes, les chemins nerveux sont fixes, terminés, immuables. Tout doit mourir, rien ne peut être régénérer” est représentative du dogme de l’époque (Ramón y Cajal 1928). D’importantes études effectuées dans les années 1960-1970 suggèrent un point de vue différent. Il a été démontré que les nouveaux neurones peuvent être générés à l’âge adulte, mais cette découverte a créé un scepticisme omniprésent au sein de la communauté scientifique. Il a fallu 30 ans pour que le concept de neurogenèse adulte soit largement accepté. Cette découverte, en plus de nombreuses avancées techniques, a ouvert la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies neurodégénératives. Les cellules souches neurales (CSNs) adultes résident principalement dans deux niches du cerveau : la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et le gyrus dentelé de l’hippocampe. En condition physiologique, le niveau de neurogenèse est relativement élevé dans la zone sous-ventriculaire contrairement à l’hippocampe où certaines étapes sont limitantes. En revanche, la moelle épinière est plutôt définie comme un environnement en quiescence. Une des principales questions qui a été soulevée suite à ces découvertes est : comment peut-on activer les CSNs adultes afin d’augmenter les niveaux de neurogenèse ? Dans l’hippocampe, la capacité de l’environnement enrichi (incluant la stimulation cognitive, l’exercice et les interactions sociales) à promouvoir la neurogenèse hippocampale a déjà été démontrée. La plasticité de cette région est importante, car elle peut jouer un rôle clé dans la récupération de déficits au niveau de la mémoire et l’apprentissage. Dans la moelle épinière, des études effectuées in vitro ont démontré que les cellules épendymaires situées autour du canal central ont des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence (neurones, astrocytes, oligodendrocytes). Il est intéressant de noter qu’in vivo, suite à une lésion de la moelle épinière, les cellules épendymaires sont activées, peuvent s’auto-renouveller, mais peuvent seulement ii donner naissance à des cellules de type gliale (astrocytes et oligodendrocytes). Cette nouvelle fonction post-lésion démontre que la plasticité est encore possible dans un environnement en quiescence et peut être exploité afin de développer des stratégies de réparation endogènes dans la moelle épinière. Les CSNs adultes jouent un rôle important dans le maintien des fonctions physiologiques du cerveau sain et dans la réparation neuronale suite à une lésion. Cependant, il y a peu de données sur les mécanismes qui permettent l'activation des CSNs en quiescence permettant de maintenir ces fonctions. L'objectif général est d'élucider les mécanismes sous-jacents à l'activation des CSNs dans le système nerveux central adulte. Pour répondre à cet objectif, nous avons mis en place deux approches complémentaires chez les souris adultes : 1) L'activation des CSNs hippocampales par l'environnement enrichi (EE) et 2) l'activation des CSNs de la moelle épinière par la neuroinflammation suite à une lésion. De plus, 3) afin d’obtenir plus d’information sur les mécanismes moléculaires de ces modèles, nous utiliserons des approches transcriptomiques afin d’ouvrir de nouvelles perspectives. Le premier projet consiste à établir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à travers lesquels l’environnement enrichi module la plasticité du cerveau adulte. Nous avons tout d’abord évalué la contribution de chacune des composantes de l’environnement enrichi à la neurogenèse hippocampale (Chapitre II). L’exercice volontaire promeut la neurogenèse, tandis que le contexte social augmente l’activation neuronale. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de ces composantes sur les performances comportementales et sur le transcriptome à l’aide d’un labyrinthe radial à huit bras afin d’évaluer la mémoire spatiale et un test de reconnaissante d’objets nouveaux ainsi qu’un RNA-Seq, respectivement (Chapitre III). Les coureurs ont démontré une mémoire spatiale de rappel à court-terme plus forte, tandis que les souris exposées aux interactions sociales ont eu une plus grande flexibilité cognitive à abandonner leurs anciens souvenirs. Étonnamment, l’analyse du RNA-Seq a permis d’identifier des différences claires dans l’expression des transcripts entre les coureurs de courte et longue distance, en plus des souris sociales (dans l’environnement complexe). iii Le second projet consiste à découvrir comment les cellules épendymaires acquièrent les propriétés des CSNs in vitro ou la multipotence suite aux lésions in vivo (Chapitre IV). Une analyse du RNA-Seq a révélé que le transforming growth factor-β1 (TGF-β1) agit comme un régulateur, en amont des changements significatifs suite à une lésion de la moelle épinière. Nous avons alors confirmé la présence de cette cytokine suite à la lésion et caractérisé son rôle sur la prolifération, différentiation, et survie des cellules initiatrices de neurosphères de la moelle épinière. Nos résultats suggèrent que TGF-β1 régule l’acquisition et l’expression des propriétés de cellules souches sur les cellules épendymaires provenant de la moelle épinière.

Investigation of Novel Circuits Involved in Virgin Female Receptivity of Drosophila melanogaster

Courtship is a behavior that allows the display of fitness of one sex to the other and gates possible subsequent mating. This behavior is crucial for reproduction and has strong innate components in all animals. Courtship in Drosophila melanogaster consists of a series of highly stereotyped actions that the male performs towards the female. He sings with vibrations of the wings, touches and licks her abdomen, while she evaluates the information presented to her.(...)

Uncertainty in olfactory decision-making

Relationships between accuracy and speed of decision-making, or speed-accuracy tradeoffs (SAT), have been extensively studied. However, the range of SAT observed varies widely across studies for reasons that are unclear. Several explanations have been proposed, including motivation or incentive for speed vs. accuracy, species and modality but none of these hypotheses has been directly tested. An alternative explanation is that the different degrees of SAT are related to the nature of the task being performed. Here, we addressed this problem by comparing SAT in two odor-guided decision tasks that were identical except for the nature of the task uncertainty: an odor mixture categorization task, where the distinguishing information is reduced by making the stimuli more similar to each other; and an odor identification task in which the information is reduced by lowering the intensity over a range of three log steps. (...)

Plasticité présynaptique et gliale à long-terme en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique,à la jonction neuromusculaire d’amphibien

La plasticité synaptique est une importante propriété du système nerveux, impliquée dans l’intégration de l’information. Cette plasticité a généralement été décrite par des changements aux niveaux pré et postsynaptiques. Notamment, l’efficacité présynaptique, soit la probabilité de libération de neurotransmetteurs associée au contenu quantique d’une synapse, peut être augmentée ou diminuée selon l’activité antérieure de la synapse. Malgré cette caractérisation, les mécanismes à l’origine de la détermination de l’efficacité présynaptique demeurent obscurs. Également, la plasticité synaptique reste encore mal définie au niveau glial, limitant, de ce fait, notre compréhension de l’intégration de l’information. Pourtant, la dernière décennie a mené à une redéfinition du rôle des cellules gliales. Autrefois reléguées à un rôle de support passif aux neurones, elles sont désormais reconnues comme étant impliquées dans la régulation de la neurotransmission. Notamment, à la jonction neuromusculaire (JNM), les cellules de Schwann périsynaptiques (CSPs) sont reconnues pour moduler l’efficacité présynaptique et les phénomènes de plasticité. Un tel rôle actif dans la modulation de la neurotransmission implique cependant que les CSPs soient en mesure de s’adapter aux besoins changeants des JNMs auxquelles elles sont associées. La plasticité synaptique devrait donc sous-tendre une forme de plasticité gliale. Nous savons, en effet, que la JNM est capable de modifications tant morphologiques que physiologiques en réponse à des altérations de l'activité synaptique. Par exemple, la stimulation chronique des terminaisons nerveuses entraîne une diminution persistante de l’efficacité présynaptique et une augmentation de la résistance à la dépression. À l’opposé, le blocage chronique des récepteurs nicotiniques entraîne une augmentation prolongée de l’efficacité présynaptique. Aussi, compte tenu que les CSPs détectent et répondent à la neurotransmission et qu’elles réagissent à certains stimuli environnementaux par des changements morphologiques, physiologiques et d’expression génique, nous proposons que le changement d'efficacité présynaptique imposé à la synapse, soit par une stimulation nerveuse chronique ou par blocage chronique des récepteurs nicotiniques, résulte en une adaptation des propriétés des CSPs. Cette thèse propose donc d’étudier, en parallèle, la plasticité présynaptique et gliale à long-terme, en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique, à la JNM d’amphibien. Nos résultats démontrent les adaptations présynaptiques de l’efficacité présynaptique, des phénomènes de plasticité à court-terme, du contenu mitochondrial et de la signalisation calcique. De même, ils révèlent différentes adaptations gliales, notamment au niveau de la sensibilité des CSPs aux neurotransmetteurs et des propriétés de leur réponse calcique. Les adaptations présynaptiques et gliales sont discutées, en parallèle, en termes de mécanismes et de fonctions possibles dans la régulation de la neurotransmission. Nos travaux confirment donc la coïncidence de la plasticité présynaptique et gliale et, en ce sens, soulèvent l’importance des adaptations gliales pour le maintien de la fonction synaptique.