Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Análise do livro didático de biologia em relação à abordagem da temática lixo

O livro didático é muito utilizado por professores e alunos, sendo importante como recurso constante de pesquisa quanto à qualidade do conteúdo oferecido à educação, pois pode influenciar comportamentos frente à sociedade. Sendo assim, é fundamental que os professores adotem livros didáticos que colaborem com textos atuais e com temas presentes no cotidiano onde estão inseridos e que envolvam a relação entre ciência e tecnologia e os seus aspectos políticos, econômicos e culturais. Este trabalho tem como objetivo identificar a forma como o tema lixo está sendo abordado nos livros didáticos de biologia no último ano do Ensino Médio. Para o desenvolvimento dessa pesquisa escolhemos os livros didáticos de Biologia que fazem parte do Plano Nacional do Livro Didático de (2012 a 2014).Os quais são utilizados na rede pública estadual do município de Governador Mangabeira- BA. Os livros didáticos analisados apresentam pontos que precisam ser reavaliados, com intuitos de possibilitar ao professor e aos alunos uma visão critica dos conteúdos, das imagens, das atividades complementares, as quais estão sendo abordado em relação o tema lixo.

Uma experiência de ensino de biologia numa perspectiva inovadora

O presente estudo tem como tema central Uma experiência de ensino de biologia numa perspectiva inovadora. Insere-se na linha de pesquisa da inovação pedagógica e incidindo em uma reflexão sobre a metodologia de ensino e aprendizagem adotada pelo professor de Biologia na sua prática pedagógica na 3ª série do Ensino Médio, de uma escola pública - o Centro Educacional Professora Olga Damous, situado no município de Turiaçu – MA. Faz-se uma análise das tipologias dos métodos aplicados na práxis educativa e de como essas práticas têm possibilitado o desenvolvimento de aprendizagens significativas nos alunos, refletindo na formação de conceitos e atitudes no seu cotidiano. A análise tem como referência a postura do professor a partir dos conceitos trabalhados na sala de aula e seus reflexos na construção de uma consciência crítica dos educandos. Nesse sentido, optou-se pela pesquisa qualitativa de abordagem etnográfica, utilizando o estudo de caso, apoiando na entrevista semi-estruturada, observação participante, por se ter um contato direto com o fenômeno a ser observado, e na análise documental. Na pesquisa, a concepção de ensino de biologia e aprendizagem significativa respaldou-se, principalmente, nos estudos de Krasilchik, Bizzo, Coll, Ausubel. Já os conceitos de inovação pedagógica tiveram as contribuições de Carlos Fino, Farias e Sebarroja, dentre outros, os quais trouxeram aportes importantes para fundamentação teórica desta pesquisa. Paralelo aos estudos teóricos, foram realizadas as observações na sala de aula e a análise dos eventos e do discurso construídos pelo professor e seus alunos. Em síntese, esta investigação pretendeu desvendar as sutilezas do processo ensino-aprendizagem do professor de Biologia na perspectiva de uma prática pedagógica inovadora.

Os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila Melanogaster

O plasma não térmico nos cuidados de saúde é um campo emergente que tem as suas raízes na ciência de plasmas. Este tipo de investigação tem crescido rapidamente e é agora objeto de um amplo esforço de pesquisa interdisciplinar envolvendo a medicina, a biologia, a física, a química e a engenharia. Têm sido feitos vários trabalhos de modo a elucidar quais as interações das espécies produzidas pelo plasma com os sistemas vivos. É evidente que o mecanismo da interação do plasma com os sistemas vivos é complexo, em parte devido à complexidade do plasma mas principalmente devido à enorme complexidade da biologia. O principal objetivo desta dissertação foi observar os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica (PNTPAs) no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila melanogaster. Para o efeito, foram expostas e analisadas fenotipicamente 2.566 larvas após exposição, dos diferentes estádios (1.º, 2.º e 3.º) de desenvolvimento. Os testes foram realizados com aplicações de plasma com e sem ultra violeta, em duas linhas diferentes de Drosophila; uma linha selvagem preparada por nós e uma linha laboratorial. A análise fenotípica revelou que após exposição as larvas apresentavam alterações no fenótipo e no comportamento que não foram observadas no controlo, nomeadamente anomalias nas mudas, traqueias partidas, formação de massas melanóticas que podiam persistir até à fase adulta, excesso de gotículas lipídicas, atraso no desenvolvimento, comportamento de não alimentação e formação de pupa imatura que levava à formação de pupa precoce e morte pupal. Na fase pupal, as anomalias mais comuns estavam relacionadas com a forma do pupário (causadas pela pipação prematura), apresentando um desenvolvimento aberrante. Entre os vários fenótipos observados, o mais significativo foi o criptocefálico (alterações na eversão dos discos imaginais) levando à morte pupal. Nos adultos, as principais anomalias morfológicas foram registadas na formação e segmentação das patas, na forma e padrão das nervuras das asas e na formação do tórax. A similaridade destes resultados com trabalhos publicados relacionados com a hormona esteróide ecdisona indicam que provavelmente o PNTPA poderá ter influenciado a biossíntese e/ou a regulação da ecdisona, a principal hormona que regula o desenvolvimento e a metamorfose em Drosophila.

Estudo do genoma do vírus causador da mionecrose infecciosa em camarões e desenvolvimento de métodos para detecção de diferentes variantes

Shrimp farming is one of the activities that contribute most to the growth of global aquaculture. However, this business has undergone significant economic losses due to the onset of viral diseases such as Infectious Myonecrosis (IMN). The IMN is already widespread throughout Northeastern Brazil and affects other countries such as Indonesia, Thailand and China. The main symptom of disease is myonecrosis, which consists of necrosis of striated muscles of the abdomen and cephalothorax of shrimp. The IMN is caused by infectious myonecrosis virus (IMNV), a non-enveloped virus which has protrusions along its capsid. The viral genome consists of a single molecule of double-stranded RNA and has two Open Reading Frames (ORFs). The ORF1 encodes the major capsid protein (MCP) and a potential RNA binding protein (RBP). ORF2 encodes a probable RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and classifies IMNV in Totiviridae family. Thus, the objective of this research was study the IMNV complete genome and encoded proteins in order to develop a system differentiate virus isolates based on polymorphisms presence. The phylogenetic relationship among some totivirus was investigated and showed a new group to IMNV within Totiviridae family. Two new genomes were sequenced, analyzed and compared to two other genomes already deposited in GenBank. The new genomes were more similar to each other than those already described. Conserved and variable regions of the genome were identified through similarity graphs and alignments using the four IMNV sequences. This analyze allowed mapping of polymorphic sites and revealed that the most variable region of the genome is in the first half of ORF1, which coincides with the regions that possibly encode the viral protrusion, while the most stable regions of the genome were found in conserved domains of proteins that interact with RNA. Moreover, secondary structures were predicted for all proteins using various softwares and protein structural models were calculated using threading and ab initio modeling approaches. From these analyses was possible to observe that the IMNV proteins have motifs and shapes similar to proteins of other totiviruses and new possible protein functions have been proposed. The genome and proteins study was essential for development of a PCR-based detection system able to discriminate the four IMNV isolates based on the presence of polymorphic sites

Biologia reprodutiva da |Tainha, Mugil curema valencientes, 1836 (osteichthyes: mugilidade) nas águas costeiras do Rio Grande do Norte

The marine fish white mullet, Mugil curema Valenciennes, 1836 (Osteichthyes: Mugilidae) exhibits a wide geographical distribution, being common in the Brazilian coast and is an important component of the artisanal fisheries. The objective of this study was to investigate the reproductive biology of M. curema in the coastal waters of Rio Grande do Norte. Fish samples were captured on a monthly basis during August, 2008 to July, 2009. The fish specimens were numbered, weighed, measured, dissected and their gonads were removed, weighed, their sex and gonadal development were identified. The length-weight relationship was determined for males and females. The sex ratio, the size at first gonadal maturation and gonadosomatic index (GSI) were calculated and ovarian development was investigated using macroscopic and histological techniques. The fecundity, spawning type and the reproductive period of the species were determined. A total of 366 specimens (186 males and 180 females) were captured. The sex ratio was 1:1 and the females were heavier than males. The estimated values of the angular coefficient for both sexes suggest that the species has isometric growth. The size at which 50% of the population began the process of maturation was 25.9 cm of total length for grouped sex. The macroscopic characteristics of the ovaries showed four stages of development: immature, maturing, mature and spent. However, the microscopic characteristics of the ovaries showed five stages of development: immature, early maturing, late maturing, mature and spent. The development of oocytes indicated five phases: Chromatin-nucleolus (phase I), initial perinucleolar (phase II), final perinuclear (phase II), formation of vitelline vesicle or yolk (phase III), vitellogenic (phase IV) and complete vitellogenesis (phase V). The species has a prolonged spawning period, with two peaks coinciding with the rainy season.

Proteínas SAG1, SAG2, SAG3 de toxoplasma gondii como perspectivas para o desenvolvimento de protótipo vacinal contra a toxoplasmose

Toxoplasmosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by the protozoan Toxoplasma gondii, triggering dangerous complications in immunocompromised patients and pregnant women, as well as having great economic impact for the livestock. So far the control of toxoplasmosis is made primarily by chemotherapy. However, most drugs used routinely have some limitations. In order to control this disease, several research groups, including ours, has been working to develop a medical-veterinary vaccine based on parasite antigens, vectors and protocols of immunization. In this study were implemented and standardized methodologies for amplification and cloning of recombinant immunogens in the system for the development of a prototype vaccine, based on the surface antigens of T. gondii and recombinant adenovirus encoding these antigens. Genes encoding BAG1, GRA2 and SAG1 proteins were amplified. We established a strategy for cloning SAG1, SAG2, SAG3 and TgAMA1- genes in recombinant system. The genes encoding SAG1 and SAG2 were cloned and their sequences showed high similarity with sequences from GenBank. The virtual translation of these proteins showed polymorphisms in the amino acid sequence, which can be correlated with levels of antigenicity. Simultaneously, the adenovirus encoding the SAGs (HAdSAGs) were expanded, purificated and characterizated. Immunization of C57bl/6 mice, using viral supernatant was not enought to elicit immune responses at high levels, being required HAdSAGs titration for future immunizations. Therefore, this study allowed the cloning of the two genes important for the development of a prototype vaccine. Besides, implementations methodologies that permit advancements in the development of a vaccine against toxoplasmosis using adenovirus to express proteins of the parasite

Efeitos da solarização do solo através de plástico transparente sobre o desenvolvimento da tiririca (Cyperus rotundus)

Um ensaio foi conduzido em condições de campo, durante o verão, com o objetivo de avaliar o potencial da técnica de solarização do solo no controle da tiririca (Cyperus rotundus L.). O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados com três repetições, e os tratamentos num esquema fatorial 2 x 2 x 3, sendo duas situações de cobertura (com e sem plástico transparente de 300 mm de espessura), dois estádios de desenvolvimento da planta daninha (vegetativo e florescimento) e três períodos de cobertura com plástico (15, 30 e 60 dias). A temperatura do solo sob solarização teve um aumento médio de 4,3oC em relação à testemunha, atingindo valores superiores a 50oC em determinados horários. Observou-se, também, um acúmulo da ordem de 400 % nos teores de CO2 na atmosfera do solo solarizado. Nessas condições houve inibição da brotação dos tubérculos e diminuição no peso de matéria seca de todas as partes estudadas da planta. Houve redução da taxa de multiplicação dos tubérculos, reduzindo-a de 1:11 para 1:4, quando coberta no estádio vegetativo e para 1:9 quando a cobertura se realizou no estádio de florescimento. Houve, ainda diminuição na ordem de 20% na viabilidade dos tubérculos remanescentes.

Desenvolvimento e composição mineral do picão-preto sob diferentes níveis de pH

Visando estudar a tolerância do picão-preto (Bidens pilosa) a diferentes níveis de pH do substrato, conduziu-se um ensaio em condições de câmara de crescimento e utilizando-se a técnica de hidroponia, no qual três plântulas foram transplantadas para recipientes contendo solução nutritiva de Hoagland & Arnon, com pH ajustado para 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com três repetições. Ao final do período experimental, 42 dias após o transplante, observou-se que as plantas que se desenvolveram nos pHs 3,5 e 8,0 apresentaram-se menores, com menor comprimento e volume do sistema radicular, menor número de folhas vivas e, consequentemente, menor peso de matéria seca das folhas, caule e raízes. Os teores de N e S nas raízes diminuiram com o aumento do pH do substrato, enquanto os de Ca e Mg aumentaram e os de K e P diminuiram no pH 5,0 a 6,0. No caule, apenas o teor de Mg foi afetado pelo pH, mostrando resposta positiva. Na folha obteve-se os maiores teores de P, S, Ca e Mg quando a planta se desenvolveu em pH 6,0. Não se constatou diferença significativa entre os efeitos dos pHs 5,0, 6,0 e 7,0 nos parâmetros avaliados, sendo que foi no pH 6,0 que se estimou, através de análise de regressão, melhor desenvolvimento do picão-preto. Concluiu-se que o picãopreto apresenta melhor desenvolvimento em pHs próximo ao neutro, com certa tolerância a pHs extremos (3,5 e 8,0).

Morfologia floral e biologia reprodutiva de genótipos de aceroleira

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Influência de genótipos de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) na biologia de Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae)

Objetivou-se, com este trabalho, avaliar a influência de alguns genótipos de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) no desenvolvimento de Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae). Os genótipos avaliados foram: Manteiga de Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga de São José, Manteiga de Monte Alegre, Pires 2 de Campinas, Couve Comum, Couve de Arthur Nogueira 2, Couve de Arthur Nogueira 1. Lagartas recém-eclodidas foram mantida em discos foliares de 8 cm de diâmetro para cada genótipo. Foram analisados os seguintes parâmetros: duração e viabilidade das fases larval e pupal, longevidade e fecundidade de adultos, utilizando análises paramétricas e de agrupamentos para interpretação dos dados. Observou-se um prolongamento em dias no ciclo de P. xylostella, aumento no peso de pupa e maiores valores de viabilidade e fecundidade, durante a segunda geração. O genótipo Couve de Arthur Nogueira 2 foi menos favorável ao desenvolvimento de P. xylostella nas duas gerações, e Couve Comum demonstrou maior influência negativa ao inseto na segunda geração. Manteiga de Ribeirão Pires I-2620 foi o mais suscetível nas duas gerações, agrupando com este na segunda geração Pires 2 de Campinas e Manteiga de São José.

Efeito de genótipos de maracujazeiro (Passiflora spp.) e da densidade larval na biologia de Dione juno juno (Cramer) (Lepidoptera: Nymphalidae)

Objetivou-se estudar em laboratório a biologia de Dione juno juno (Cramer), determinando-se os efeitos da densidade larval e da alimentação das larvas com folhas de nove genótipos de maracujazeiro. Foram analisados a duração, o peso e a viabilidade das fases larval e pupal e a longevidade dos adultos sem alimento. Verificou-se que a densidade de cinco lagartas por recipiente proporcionou melhor desenvolvimento do inseto do que uma e dez lagartas. Passiflora alata e P. setacea apresentaram resistência do tipo não-preferência para alimentação e/ou antibiose, enquanto o híbrido P. alata2 x P. macrocarpa apresentou não-preferência para alimentação, possivelmente associada à presença de compostos químicos com alto grau de repelência a D. juno juno ou a supressores de alimentação.

Biologia de Leptopharsa heveae Drake & Poor (Heteroptera: Tingidae) e a relação de suas exigências térmicas com a flutuação populacional em seringueira

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estádios de desenvolvimento e vias de contato e absorção dos herbicidas na inviabilização de tubérculos de Cyperus rotundus

Herbicidas que inviabilizam tubérculos de tiririca (Cyperus rotundus) quando absorvidos nas folhas ou na solução do solo, garantem melhor desempenho para a desinfestação gradativa da área. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os estádios de crescimento mais adequados para a aplicação de herbicidas em pós-emergência, além da possibilidade de ação dos principais herbicidas na parte subterrânea da tiririca após aplicação localizada na parte aérea, no solo e sobre ambos os meios. Foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação do Departamento de Fitossanidade da Universidade Estadual Paulista, campus de Jaboticabal-SP. Os resultados do primeiro experimento mostraram que todos os herbicidas estudados (trifloxysulfuron-sodium + ametrine, halosulfuron, sulfentrazone e imazapic) proporcionaram reduções significativas no número de tubérculos viáveis, de forma coerente com suas características de atuação e pela via em que são recomendados. No segundo experimento, as maiores porcentagens de tubérculos afetados na seqüência das cadeias, a partir das manifestações epígeas originais e derivadas, foram obtidas nas aplicações de trifloxysulfuron-sodium + ametrine nos estádios jovem e de pré-florescimento das plantas de tiririca, de halosulfuron no estádio jovem e de glyphosate no de pré-florescimento.

Efeito de diferentes dietas sobre o desenvolvimento pós-embrionário de Chrysoperla defreitasi Brooks (Neuroptera: Chrysopidae)

Avaliou-se o período pós-embrionário do predador Chrysoperla defreitasi Brooks alimentada com ovos de Sitotroga cerealella (Olivier) e Diatraea saccharalis (Fabricius) em condições de laboratório à temperatura de 25±2ºC, UR de 70±10% e fotofase de 14h. Os ovos do crisopídeo foram individualizados em tubos de vidro e, após a eclosão, as larvas foram alimentadas com as respectivas presas e mantidas em sala climatizada, sob condições controladas. O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado com 150 repetições para cada dieta. As durações do 1º, 2º e 3º ínstar e da fase pupal foram, respectivamente, 3,4, 2,7, 3,5 e 11,9 dias para larvas alimentadas com D. saccharalis e 3,6, 2,8, 2,7 e 9,3 dias, quando a dieta oferecida foi ovos de S. cerealella. Larvas de crisopídeos alimentados com ovos de D. saccharalis levaram em média 21,5 dias para completar o desenvolvimento pós-embrionário, com 34,0% de adultos emergidos, enquanto que os alimentados com ovos de S. cerealella levaram 18,4 dias com 55,3% de adultos. Pode-se, pois, constatar que a melhor dieta para o desenvolvimento pós-embrionário de C. defreitasi foram os ovos de S. cerealella, sendo que insetos alimentados com esta dieta apresentaram período mais curto de desenvolvimento, maior viabilidade nos três ínstares larvais e no período pupal, produzindo maior número de adultos.