Sonic hedgehog-Dependent Induction of MicroRNA 31 and MicroRNA 150 Regulates Mycobacterium bovis BCG-Driven Toll-Like Receptor 2 Signaling

Hedgehog (HH) signaling is a significant regulator of cell fate decisions during embryogenesis, development, and perpetuation of various disease conditions. Testing whether pathogen-specific HH signaling promotes unique innate recognition of intracellular bacteria, we demonstrate that among diverse Gram-positive or Gram-negative microbes, Mycobacterium bovis BCG, a vaccine strain, elicits a robust activation of Sonic HH (SHH) signaling in macrophages. Interestingly, sustained tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) secretion by macrophages was essential for robust SHH activation, as TNF-alpha(-/-) macrophages exhibited compromised ability to activate SHH signaling. Neutralization of TNF-alpha or blockade of TNF-alpha receptor signaling significantly reduced the infection-induced SHH signaling activation both in vitro and in vivo. Intriguingly, activated SHH signaling downregulated M. bovis BCG-mediated Toll-like receptor 2 (TLR2) signaling events to regulate a battery of genes associated with divergent functions of M1/M2 macrophages. Genome-wide expression profiling as well as conventional gain-of-function or loss-of-function analysis showed that SHH signaling-responsive microRNA 31 (miR-31) and miR-150 target MyD88, an adaptor protein of TLR2 signaling, thus leading to suppression of TLR2 responses. SHH signaling signatures could be detected in vivo in tuberculosis patients and M. bovis BCG-challenged mice. Collectively, these investigations identify SHH signaling to be what we believe is one of the significant regulators of host-pathogen interactions.

Nitric oxide and KLF4 protein epigenetically modify class II transactivator to repress Major histocompatibility complex II expression during Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin infection

Pathogenic mycobacteria employ several immune evasion strategies such as inhibition of class II transactivator (CIITA) and MHC-II expression, to survive and persist in host macrophages. However, precise roles for specific signaling components executing down-regulation of CIITA/MHC-II have not been adequately addressed. Here, we demonstrate that Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG)-mediated TLR2 signaling-induced iNOS/NO expression is obligatory for the suppression of IFN-gamma-induced CIITA/MHC-II functions. Significantly, NOTCH/PKC/MAPK-triggered signaling cross-talk was found critical for iNOS/NO production. NO responsive recruitment of a bifunctional transcription factor, KLF4, to the promoter of CIITA during M. bovis BCG infection of macrophages was essential to orchestrate the epigenetic modifications mediated by histone methyltransferase EZH2 or miR-150 and thus calibrate CIITA/MHC-II expression. NO-dependent KLF4 regulated the processing and presentation of ovalbumin by infected macrophages to reactive T cells. Altogether, our study delineates a novel role for iNOS/NO/KLF4 in dictating the mycobacterial capacity to inhibit CIITA/MHC-II-mediated antigen presentation by infected macrophages and thereby elude immune surveillance.

Mycobacterium bovis BCG promotes tumor cell survival from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis

Background: Increased incidence of lung cancer among pulmonary tuberculosis patients suggests mycobacteria-induced tumorigenic response in the host. The alveolar epithelial cells, candidate cells that form lung adenocarcinoma, constitute a niche for mycobacterial replication and infection. We thus explored the possible mechanism of M. bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-assisted tumorigenicity in type II epithelial cells, human lung adenocarcinoma A549 and other cancer cells. Methods: Cancer cell lines originating from lung, colon, bladder, liver, breast, skin and cervix were treated with tumor necrosis factor (TNF)-alpha in presence or absence of BCG infection. p53, COP1 and sonic hedgehog (SHH) signaling markers were determined by immunoblotting and luciferase assays, and quantitative real time PCR was done for p53-responsive pro-apoptotic genes and SHH signaling markers. MTT assays and Annexin V staining were utilized to study apoptosis. Gain-and loss-of-function approaches were used to investigate the role for SHH and COP1 signaling during apoptosis. A549 xenografted mice were used to validate the contribution of BCG during TNF-alpha treatment. Results: Here, we show that BCG inhibits TNF-alpha-mediated apoptosis in A549 cells via downregulation of p53 expression. Substantiating this observation, BCG rescued A549 xenografts from TNF-alpha-mediated tumor clearance in nude mice. Furthermore, activation of SHH signaling by BCG induced the expression of an E3 ubiquitin ligase, COP1. SHH-driven COP1 targeted p53, thereby facilitating downregulation of p53-responsive pro-apoptotic genes and inhibition of apoptosis. Similar effects of BCG could be shown for HCT116, T24, MNT-1, HepG2 and HELA cells but not for HCT116 p53(-/-) and MDA-MB-231 cells. Conclusion: Our results not only highlight possible explanations for the coexistence of pulmonary tuberculosis and lung cancer but also address probable reasons for failure of BCG immunotherapy of cancers.

The adenylyl cyclase Rv2212 modifies the proteome and infectivity of Mycobacterium bovis BCG

All organisms have the capacity to sense and respond to environmental changes. These signals often involve the use of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP). This second messenger is widely distributed among organisms and coordinates gene expression related with pathogenesis, virulence, and environmental adaptation. Genomic analysis in Mycobacterium tuberculosis has identified 16 adenylyl cyclases (AC) and one phosphodiesterase, which produce and degrade cAMP, respectively. To date, ten AC have been biochemically characterized and only one (Rv0386) has been found to be important during murine infection with M. tuberculosis. Here, we investigated the impact of hsp60-driven Rv2212 gene expression in Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) during growth in vitro, and during macrophage and mice infection. We found that hsp60-driven expression of Rv2212 resulted in an increased capacity of replication in murine macrophages but an attenuated phenotype in lungs and spleen when administered intravenously in mice. Furthermore, this strain displayed an altered proteome mainly affecting proteins associated with stress conditions (bfrB, groEL-2, DnaK) that could contribute to the attenuated phenotype observed in mice.

Sonic hedgehog-Dependent Induction of MicroRNA 31 and MicroRNA 150 Regulates Mycobacterium bovis BCG-Driven Toll-Like Receptor 2 Signaling

Hedgehog (HH) signaling is a significant regulator of cell fate decisions during embryogenesis, development, and perpetuation of various disease conditions. Testing whether pathogen-specific HH signaling promotes unique innate recognition of intracellular bacteria, we demonstrate that among diverse Gram-positive or Gram-negative microbes, Mycobacterium bovis BCG, a vaccine strain, elicits a robust activation of Sonic HH (SHH) signaling in macrophages. Interestingly, sustained tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) secretion by macrophages was essential for robust SHH activation, as TNF-alpha(-/-) macrophages exhibited compromised ability to activate SHH signaling. Neutralization of TNF-alpha or blockade of TNF-alpha receptor signaling significantly reduced the infection-induced SHH signaling activation both in vitro and in vivo. Intriguingly, activated SHH signaling downregulated M. bovis BCG-mediated Toll-like receptor 2 (TLR2) signaling events to regulate a battery of genes associated with divergent functions of M1/M2 macrophages. Genome-wide expression profiling as well as conventional gain-of-function or loss-of-function analysis showed that SHH signaling-responsive microRNA 31 (miR-31) and miR-150 target MyD88, an adaptor protein of TLR2 signaling, thus leading to suppression of TLR2 responses. SHH signaling signatures could be detected in vivo in tuberculosis patients and M. bovis BCG-challenged mice. Collectively, these investigations identify SHH signaling to be what we believe is one of the significant regulators of host-pathogen interactions.

Incidencia de Cysticercus bovis en la matanza industrial de Nicaragua

En este trabajo, se analizó la situación existente con respecto a la Cysticercosis bovina, en la Empresa Julio Moneada Tercero, ubicada en el Km 11 carretera Norte, departamento de Managua; Esta Empresa cubre el 33% de la matanza industrial en Nicaragua. Con los datos recabados se Evaluaron: Niveles de infestación de los años 1984, 1985, 1988 y 1989; se determinó la infestación por categorías; EL departamento de mayor incidencia; Y las pérdidas económicas. Para el análisis estadístico, el método utilizado fue el de mínimos cuadrados generalizado, usando el procedimiento CATMOD del paquete statistical Analisis System. Los resultados obtenidos en el Análisis de varianza, demuestran que existen diferencias significativas entre años, con un nivel de significancia de P< 0.05 obteniéndose 1.24% de infestación global para los cuatro años, así como también existen diferencias significativas para las diferentes categorías (P< 0.05), siendo la categoría vaca (C2) la más afectada. Matagalpa resultó ser el departamento con el mayor número de animales parasitados seguido de Boaco, Managua y León. Las pérdidas económicas revelan cifras aproximadas de US$ 109,121.50 (ciento nueve mil ciento veinte y un dólares con cincuenta centavos) para el productor, adicionando a esto, las divisas no captadas por un monto aproximado de US$ 653,511.07 (seiscientos cincuenta y tres mil quinientos once dólares con siete centavos) por disminución de las exportaciones.

Prevalencia de Cysticercus bovis en el matadero de Amerrisque

En el presente trabajo se analizó la situación existente en relación a la Prevalencia de Cysticercosis bovina en la Empresa Agrícola Centro Americana, S.A. Matadero de Amerrisque, ubicado en el km 128 carretera al Rama, Juigalpa, Chontales. Esta empresa se fundó en el año 1977 y del total de su producción el 98% va destinado a la exportación y el 2% para consumo local. Los análisis se realizaron basándose en datos de la Inspección Post-morten de los años 1982, 1984, 1990, 1991, 1992, para loe cuales se determinó el Año de mayor prevalencia, Categoría más afectada, Departamento de mayor prevalencia y Pérdidas económicas. Para la valoración estadística de los datos registrados fue utilizado el Método de Mínimos Cuadrados Generalizado, usando el procedimiento CATHOD del Paquete Statical Analisis System. Loa resultados obtenidos en el Análisis de Varianza, demuestran que existen diferencias significativas entre años, con un nivel de significancia de (P < 0.05), obteniéndose 0.93% de infestación promedio en los cinco años evaluados. A su vez también se encontraron diferencias significativas para las categorías (P < 0.05) encontrándose la categoría Buey (C4) la más infestada. Resultando Chontales el departamento con mayor número de animales parasitados, seguido de Boaco, Zelaya y Matagalpa. Las pérdidas económicas para estos años resultaron ser de US$ 71,905.85 para el productor, sumándose a ello, las divisas no captadas con un monto aproximado de US$ 535,511.63 al prescindir de su exportación.

Prevalencia de Cysticercus bovis en la carne procedente de dos mataderos industriales de ganado bovino

En el presente trabajo se analizó la situación existente con respecto a la cysticercosis bovina, en las empresas: San Martín, ubicada en el km 67 1/2, carretera panamericana, (Nandaime) y Alfonso González P. ubicada en el Km 16 1/2 carretera nueva a León, (Los Brasiles) siendo únicamente para consumo local. Con los datos recabados se evaluaron los porcentajes de infestación de los años 1987, 1988, 1989, 1990, 1991 para el matadero San Martín y 1989, 1990, 1991 para el matadero Alfonso González P., además se determinó la infestación por categorías para ambos mataderos, el departamento con mayor prevalencia en ambos mataderos y las pérdidas económicas, en ambas empresas. El análisis estadístico fue el de Ji- cuadrado (X 2) para lo cual se usó el procedimiento catmod del paquete statistical analysis system. (SAS). Los resultados obtenidos en el análisis de varianza, demuestran que existe diferencias significativa entre mataderos y a 10 largo de los años con un nivel de significancia de (p<0.05) obteniéndose 1.90% de infestación global para los años en estudio, siendo para et matadero San Martín 2.78% de infestación y para el matadero Alfonso González P. 1.12% de infestación, así como existe diferencia significativa para las diferentes categorías (p<0.05), siendo la categoría vaca (CJ) la más afectada para el matadero. San Martín y en el matadero Alfonso González P. la categoría toro (C2); Rivas resultó ser el departamento con el mayor número de animales parasitados seguido de Boaco, Chontales y Granada para el matadero San Martín y para el matadero Alfonso González P., Megasa resultó ser quien obtuvo el mayor número de animales parasitados seguido por la Subasta, Chontales y Matagalpa. Las pérdidas económicas revelan cifras aproximadas de U $ 283,932 para los productores en ambos mataderos, adicionando a esto las divisas no captadas de U$ 689,144.34 por disminución de las exportaciones.

Prevalencia de Tuberculosis (Mycobacterium bovis) y Brucelosis (Brucella abortus) en bovinos criollos de la raza Reyna en edad reproductiva, en la finca Santa Rosa

El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de tuberculosis(Micobacterium bovis) y brucelosis (Brucella abortus) en bovinos criollos de raza Reyna de la finca Santa Rosa propiedad de la Universidad Nacional Agraria. Este trabajo se realizó en dos etapas de campo con un intervalo de 215 días entre el primer muestreo y el segundo muestreo de la misma población de bovinos. Primer muestreo: 80 bovinos muestreados de un total de 120 animales, correspondiente al 66.83% de la población total. Segundo muestreo serológico se utilizaron 85 bovinos de una población de 130 equivalente al 65.39% del total de bovinos.Los criterios de selección fueron: bovinos de la raza Reyna clínicamente sanos y en edad reproductiva. Para la interpretación de los datos en este estudio se utilizó un análisis estadístico descriptivo. Para el diagnóstico de tuberculosis se realizó la prueba de tuberculina anocaudal y la prueba doble comparativa en los bovinos que reaccionaron a la aplicación de tuberculina PPD. En la primera y segunda etapa del muestreo serológico los animales dieron “no reactores” a la sensibilización dérmica por tuberculina. Los resultados del muestreo serológico realizados a través de las pruebas rosa de bengala, rivanol y test de ELISA para el diagnostico de brucelosis,demuestran que ninguno de los sueros de los bovinos presentaron anticuerpos aglutinantes, indicando que los animales no estuvieron expuestos a Brucella abortus, Brucella melitensis o Brucellasuis.

Prevalencia de Cysticercus bovis en el ganado vacuno sacrificado en los mataderos de Nicaragua

Para determinar la prevalencia de Cisticercosis en el ganado vacuno y la incidencia de la misma en las dos épocas del año así como el grado de ataque entre los mataderos, se analizaron los datos provenientes de las matanzas de un periodo de un año, en los cuatro mataderos que procesan carne para exportación sobre un total de 196,701 animales sacrificados desde el 1 de Junio de 1971 al 31 de Mayo de 1972, en los que se encontraron 6,783 casos positivos, lo que indica un porcentaje del 2.91%, el cual se estima alto con relación a años posteriores y si se agregara a estas cifras de 6,783 casos de Cisticercosis, registrados en los cuatro Mataderos en que se hizo la observación, lo que ocurren en mas de 113 rastros municipales y otros tipos de matanzas particulares en el país, es de suponerse que la incidencia aumentaría considerablemente. En cuanto al método que se usa actualmente para la inspección de carnes, debiera de aplicarse con mas rigor y hacerle modificaciones de acuerdo a las técnicas modernas de inspección, para lograr un control mas efectivo en la eliminación de este parásito que afecta el ganado logrando así, una mayor productividad de los recursos del suelo, ya que la incidencia debido a Cisticercosis, representa una enorme perdida año con año; y la disminución de la misma debe ser objeto de atención de las investigaciones, para mejorar la eficiencia de la producción ganadera, y aumentar el rendimiento de la misma para sus productores.

Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.

Produção e caracterização de MPB70 de Mycobacterium bovis para uso em imunodiagnóstico.

Demonstrou-se a produção e caracterização de MPB70 recombinante de M. bovis.

Production and Evaluation of Antibodies and Phage Display-Derived Peptide Ligands for Immunomagnetic Separation of Mycobacterium bovis

This study describes the development and optimization of an immunomagnetic separation (IMS) method to isolate Mycobacterium bovis cells from lymph node tissues. Gamma-irradiated whole M. bovis AF2122/97 cells and ethanol-extracted surface antigens of such cells were used to produce M. bovis-speci?c polyclonal and monoclonal antibodies in rabbits and mice. They were also used to generate M. bovis-speci?c peptide ligands by phage display biopanning. The various antibodies and peptide ligands obtained were used to coat MyOne tosyl-activated Dynabeads (Life Technologies), singly or in combination, and evaluated for IMS. Initially, M. bovis capture from Middlebrook 7H9 broth suspensions (concentration range, 10 to 10⁵ CFU/ml) was evaluated by IMS combined with an M. bovis-speci?c touchdown PCR. IMS-PCR results and, subsequently, IMS-culture results indicated that the beads with greatest immunocapture capability for M. bovis in broth were those coated simultaneously with a monoclonal antibody and a biotinylated 12-mer peptide. These dually coated beads exhibited minimal capture (mean of 0.36% recovery) of 12 other Mycobacterium spp. occasionally encountered in veterinary tuberculosis (TB) diagnostic laboratories. When the optimized IMS method was applied to various M. bovis-spiked lymph node matrices, it demonstrated excellent detection sensitivities (50% limits of detection of 3.16 and 57.7 CFU/ml of lymph node tissue homogenate for IMS-PCR and IMS-culture, respectively). The optimized IMS method therefore has the potential to improve isolation of M. bovis from lymph nodes and hence the diagnosis of bovine tuberculosis.