Epidemiologia molecular aplicada ao estudo da mastite caprina causada por Staphylococcus spp

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Caracterização molecular dos genótipos G e P de rotavírus tipo G9 provenientes de crianças com gastrenterite aguda na região metropolitana de Belém, Pará, no período de 1999 a 2007

O rotavírus (RV) é o principal agente viral associado às gastrenterites, ocasionando em média 39% dos casos diarreicos que culminam em hospitalizações, sendo responsável por cerca de 520.000 óbitos entre crianças menores de cinco anos de idade a cada ano. Pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, possui RNA de dupla fita (dsRNA) com 11 segmentos codificando 12 proteínas, sendo seis estruturais (VPs) e seis não estruturais (NSPs). A proteína VP4, juntamente com a VP7, compõem a camada externa do RV, designando os genótipos P e G, respectivamente. Até o momento foram descritos 23 tipos G e 31 tipos P. O genótipo G9 emergiu em escala global e é possivelmente associado a manifestação clínica mais grave, estando geralmente acompanhado do genótipo P[8]. O genótipo G9 possui 6 linhagens distintas e o P[8] 4 linhagens. Este estudo objetivou caracterizar os genes VP7 e VP4 de RV do genótipo G9, circulantes na região metropolitana de Belém, Pará, no período de 1999 a 2007. O dsRNA viral de 38 amostras selecionadas foi extraído a partir das suspensões fecais e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida para determinação dos eletroferotipos, seguido da reação de seqüenciamento. Na presente investigação, foi possível a análise de 32 amostras selecionadas, sendo todas genótipo G9P[8] associadas ao eletroferotipo longo. A análise filogenética do gene VP7 demonstrou que as amostras G9 agruparam na linhagem 3 com elevados índices de similaridade, apresentando 8 substituições nucleotídicas. Contudo, apenas três modificações aminoacídicas foram observadas nas posições 43 (I→V), 66 (A→V) e 73 (Q→R), sendo estes resíduos 43 e 73 exclusivos das amostras do ano de 2007. A análise do gene VP4 demonstrou que as amostras P[8] agruparam na linhagem 3, identificando-se 15 substituições nucleotídicas, as quais ocasionaram quatro modificações aminoacídicas nos resíduos 108 (V→I), 172 (R→K), 173 (I→V) e 275 (K→R). As modificações nos resíduos 172 e 275 são exclusivos das amostras dos anos de 1999 a 2002. As amostras do presente estudo apresentaram elevada similaridade ao longo do tempo estudado. As amostras de 2007 foram as mais divergentes, tanto para o gene VP4 quanto para o gene VP7. É importante se proceder ao contínuo monitoramento do genótipo G9 na região metropolitana de Belém, a fim de detectar possíveis variantes emergentes que possam representar um desafio as estratégias de imunização atuais.

Análise filogenética de Leptodeira Fitzinger, 1843 e taxonomia das espécies do clado do sul do complexo Leptodeira annulata/septentrionalis (Serpentes, Dipsadidae)

Leptodeira é um gênero Neotropical de serpentes com nove espécies, dividido em quatro grupos morfológicos: annulata com as espécies L. annulata (L. a. annulata, L. a. ashmeadi, L. a. cussiliris, L. a. pulchriceps, L. a. rhombifera), L. bakeri, L. maculata, L. frenata (L. f. frenata, L. f. malleisi, L. f. yucatanensis), L. uribei; septentrionalis com L. septentrionalis (L. s. septentrionalis, L. s. larcorum, L. s. ornata, L. s. polysticta), L. splendida (L. s. splendida, L. s. bressoni, L. s. ephippiata); nigrofasciata com apenas a espécie L. nigrofasciata; e grupo punctata representado por L. punctata. Na última revisão taxonômica do gênero, várias espécies foram consideradas como subespécies, sendo caracterizadas principalmente com base no padrão de cor. No entanto, recentes análises moleculares não corroboraram o arranjo taxonômico proposto anteriormente. As duas espécies com distribuição geográfica mais ampla e maior número de subespécies, L. annulata e L. septentrionalis, não tiveram monofila validada. Na mais recente proposta filogenética de Leptodeira, a monofilia do complexo L. annulata/septentrionalis foi obtida a partir de caracteres moleculares, sendo recuperados dois clados geograficamente distintos: um clado Norte presente no sul da América do Norte e norte da América Central (L. s. polysticta ((L. rubricata - L. a. rhombifera) ((L. a. cussiliris - L. maculata) L. a. cussiliris))); e outro clado Sul-americano presente no sul da América Central e toda América do Sul ((L. s. ornata–L. a. annulata) (L. s. ornata (L. bakeri (L. a. ashmeadi–L. a. annulata)))). Neste trabalho, apresento uma hipótese filogenética para Leptodeira e reviso taxonomicamente o clado Sul do complexo L. annulata/septentrionalis, apresentando um novo arranjo taxonômico para o grupo. Desta forma, a presente tese está organizada em: Introdução Geral, onde foram apresentadas informações sobre taxonomia e sistemática de Leptodeira, especialmente do complexo L. annulata/septentrionalis; Capítulo 1 intitulado “Análise filogenética de Leptodeira (Serpentes, Dipsadidae)”, com o objetivo de propor uma hipótese filogenética para o gênero, com base em caracteres moleculares; e o Capítulo 2 intitulado “Taxonomia das espécies do clado Sul do complexo L. annulata/septentrionalis (Serpentes, Dipsadidae)”, que teve como objetivo caracterizar morfologicamente os clados obtidos a partir da análise molecular e propor um novo arranjo taxonômico para o grupo.

Análise taxonômica de espécies simpátricas do gênero Rhinocricus por meio da morfometria, citogenética e marcadores moleculares

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Revisão taxonômica e análise filogenética de Aplastodiscus (Anura; Hylidae)

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) - IBRC

Molecular and parasitological detection of Leishmania spp. in a dipteran of the species Tabanus importunus

A leishmaniose é uma importante zoonose, de caráter crônico, causada por protozoários do gênero Leishmania spp. Esta protozoose tem como principal vetor os flebotomíneos, sendo que, no Brasil, o Lutzomyia longipalpis é a principal espécie incriminada na transmissão da leishmaniose Visceral Americana. A presença do ácido desoxirribonucleico (DNA) do parasito em ectoparasitos, como carrapatos e pulgas, tem gerado especulações quanto a existência de novos vetores no ciclo da leishmaniose. Foi objetivo deste estudo relatar a detecção molecular de Leishmania spp. em uma mutuca da espécie Tabanus importunus que parasitava um cão oligossintomático infectado por Leishmania spp. A análise molecular amplificou o DNA do protozoário na cabeça, na região torácica e no abdomen do tabanídeo, resultando como positivo para complexo Leishmania. Este é o primeiro relato da presença de DNA de Leishmania spp. em insetos dipteros da espécie T. importunus.

Molecular characterization of accessions of crabgrass (Digitaria nuda) and response to ametryn

Digitaria species are sugar cane crop weeds in Brazil and are being controlled with herbicides, although there are some reports of control failure, notably to the triazine group. Molecular techniques are recommended to analyze the genetic variability in weeds. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) and, in combination with sequencing, allow the localization of resistance genes, as well as possible mutations related to the onset of resistant individuals in some species. Thus, the objective of this work was to characterize ten accessions of Digitaria spp. by RAPD and PCR-RFLP markers, to sequence a conserved region of the psbA gene and evaluate the accessions response to ametryn. As showed by molecular analysis there was high genetic similarity among the accessions, all of them presented similar genetics profiles and were susceptible to ametryn.

Diagnóstico morfológico e molecular de Haemonchus spp. em bovinos e ovinos

Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada - IBB

Análise de Alterações Cromossômicas, Mutações no Éxon 1 e do Padrão de Metilação da Região Promotora do Gene FOXO3 em Síndrome Mielodisplásica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Desenvolvimento e validação de sistema multiplex X-STR para identificação humana por DNA

Novas metodologias de análise molecular voltadas para estudos populacionais, clínicos, evolutivos, da biodiversidade e identificação forense foram desenvolvidas com base em marcadores microssátelites ou STR Short Tandem Repeats. Os marcadores STR, que estão amplamente espalhados nos genomas e se caracterizam por apresentar alto grau de polimorfismo, podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da polimerase). A análise foi facilitada a partir do desenvolvimento de sistemas de amplificação simultânea de múltiplos STR (multiplex STR) e com a detecção automatizada dos produtos de amplificação marcados por fluorescência. Recentemente, o uso de marcadores STR do cromossomo X (X-STR) tornou-se significativo na prática forense. Devido ao seu modo de transmissão, os X-STR são úteis em situações particulares de investigação de relações de parentesco, apresentando vantagens sobre o uso de STR autossômicos. Este estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento e validação de sistema multiplex, denominado LDD (X-STR) Decaplex, capaz de amplificar dez loci X-STR (DXS7133, DXS7424, DXS8378, DXS6807, DXS7132, DXS10074, DXS7423, DXS8377, GATA172D05 e DXS10101) para aplicação em genética populacional, identificação e análises forenses. Utilizando o LDD (X-STR) Decaplex 170 indivíduos autodenominados afrodescendentes, não aparentados geneticamente, foram genotipados. As freqüências alélicas e genotípicas não apresentaram desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg e estão em concordância com aquelas observadas em outros estudos. Os haplótipos observados foram únicos em indivíduos de amostra masculina. A análise de desequilíbrio de ligação não revelou associação entre os marcadores X-STR. A diversidade genética foi elevada, variando entre 0,6218 para o locus DXS7133 a 0,9327 para o locus DXS8377. Os parâmetros de Probabilidade de Vinculação (PV), Índice de Vinculação (IV), Poder de Exclusão (PE), Poder de Discriminação e Razão de Verossimilhança foram também elevados, demonstraram que os dez X-STRs são altamente polimórficos e discriminativos na população estudada. A concentração mínima de DNA para a amplificação dos loci do LDD (X-STR) Decaplex é de 0,5 ng e verificamos que amplificação por PCR pode ser afetada quando são adicionados mais de 5 ng de DNA nas reações. Os percentuais de bandas stutter foram elevados para os loci DXS7132 e DXS8377. No teste de reprodutibilidade observamos consistência entre as tipagem de diferentes amostras biológicas, incluindo as de restos mortais. No teste de mistura a proporção limite em que observamos a coexistência de duas espécies biológicas foi de 2,5:1ng (feminino-masculino). Os resultados evidenciaram que os loci do LDD (X-STR) Decaplex são altamente informativos, consistindo, em conjunto, uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco.

Investigação de mutações no gene ATP13A2 como um fator de risco para a Doença de Parkinson em pacientes brasileiros

A doença de Parkinson (DP) é a desordem neurodegenerativa motora mais frequente, com uma prevalência de, aproximadamente, 1% entre indivíduos com mais de 60 anos de idade, aumentando para 4 a 5% entre os indivíduos com idade superior a 85 anos. Esta condição é caracterizada pela perda seletiva dos neurônios dopaminérgicos da substância negra e pela presença de inclusões protéicas ricas em α-sinucleína nos neurônios sobreviventes. Pouco se sabe sobre a etiologia e a patogênese da DP. A maioria dos casos aparece esporadicamente, podendo estar associados a diversos fatores de risco ambientais e genéticos. Na última década, estudos de ligação identificaram 15 loci cromossômicos (PARK1 a PARK15) relacionados à DP e, nestes, um novo gene, ATP13A2, tem sido associado a casos de DP de início precoce. Esse gene está situado no 1p36 e codifica a proteína ATPase tipo-P da subfamília P5, de localização lisossômica, que é expressa em diversos tecidos, principalmente no cérebro. Mutações em ATP13A2 levam à formação de proteínas truncadas que ficam retidas no reticulo endoplasmático e posteriormente são degradadas pelo proteossomo, podendo causar a disfunção proteossômica, decorrente da sobrecarga gerada pela proteína mutante, ou causar a disfunção lisossômica, ambas gerando agregação tóxica. Este trabalho tem como objetivo realizar a análise molecular do gene ATP13A2 em uma amostra de 116 pacientes brasileiros com DP, de manifestação precoce (<50 anos), de forma a avaliar se mutações neste gene representam um fator de risco para a DP. O DNA foi extraído a partir de leucócitos do sangue periférico ou de saliva e a análise molecular dos éxons 2, 3, 12, 13, 14, 15, 16, 26 e 27, bem como, dos limites íntronéxons foi realizada por sequenciamento automático dos produtos da PCR. Identificamos oito variantes de sequência: quatro variantes intrônicas (uma no íntron 2, uma no íntron 13 e duas no íntron 27) e quatro variantes silenciosas (uma no éxon 3, 16, 26 e 27). Com base em dados da literatura e através de análises in silico e comparação com amostras controle, classificamos a alteração intrônica c.3084- 3C>T, e as alterações silenciosas c.2970G>A e c.3192C>T como não patogênicas; as alterações intrônicas c.106-30G>T, c.1306+42_1306+43 insC e c.3083+24C>T, e as alterações silenciosas c.132A>G e c.1610G>T foram classificadas como provavelmente não patogênicas. Nosso achados corroboram àqueles encontrados em outras populações e indicam que mutações no gene ATP13A2 não são uma causa comum de DP na amostra de pacientes brasileiros analisados. No entanto, se faz necessário estender nossas análises para outras regiões gênicas, a fim de determinar o real papel deste gene na etiologia da DP em nossa população.

Variantes no gene MBL2 codificador da Lectina Ligante de Manose (MBL): implicações na leishmaniose visceral humana

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários.

Revisão do gênero Neotropical Gundlachia Pfeiffer, 1849 (Mollusca, Pulmonata, Basommatophora, Planorboidea, Ancylidae): morfologia, distribuição geográfica, sistemática e filogenia

Gundlachia Pfeiffer 1849 é o gênero de molusco de água doce pateliforme com a mais ampla distribuição geográfica dentre os oito gêneros de Ancylidae assinalados para a região Neotropical. A concha pateliforme, considerada uma homoplasia por diversos autores em vários basomatóforos, tem sido historicamente utilizada para definir a unidade da família Ancylidae, apesar dos questionamentos contrários à monofilia do grupo. Dados moleculares confirmaram que "Ancylidae" é um grupo parafilético, principalmente por causa do gênero Burnupia. Os demais gêneros foram incluídos em Ancylinae, dentro de Planorbidae. No entanto, a ausência de todos os gêneros Neotropicais nas filogenias propostas, com base molecular ainda é um assunto que necessita ser investigado. Os principais objetivos desse trabalho foram: (a) revisar as espécies de Gundlachia, através de estudos morfológicos das conchas e partes moles; (b) padronizar as descrições das espécies para iniciar uma análise cladística do gênero Gundlachia; (c) iniciar um estudo de biologia molecular utilizando distintas espécies de representantes de Ancylinae, para verificar as suas interrelações e o provável grupoirmão de Gundlachia; (d) e por fim, construir um mapa de distribuição geográfica. Para isso, examinamos diversas coleções científicas e realizamos coletas nas localidadestipo. A morfologia das conchas foi comparada por análises morfométricas e por microscópio de luz e de varredura. As partes moles dos espécimes foram dissecadas e estudadas sob o microscópio estereoscópico. A análise molecular foi realizada em três espécimes de cada amostra, utilizando os genes da citocromo c oxidase I e o 16S mtDNA. Após o sequenciamento verificamos as distâncias genéticas entre as diferentes espécies de Gundlachia e as suas relações com os outros gêneros por meio do teste Neighbor-joining e Maximum likelihood. Com esse estudo apresentamos a redescrição de algumas espécies de Gundlachia, discutimos a validade de novos táxons descobertos e sequenciamos e analisamos espécies de sete gêneros de Ancylinae que ocorrem na região Neotropical. Com base nesses dados discutimos a monofilia de Gundlachia e o seu provável grupo-irmão. E ainda abordamos a validade dos demais gêneros neotropicais

Estudos genéticos em milho sobre o caráter tolerância no encharcamento do solo

A introdução de culturas de sequeiro em solos de várzea é importante para o desenvolvimento da região sul do Brasil, uma vez que estas áreas estão sub aproveitadas com a cultura de arroz irrigado e a pecuária extensiva. O milho é uma alternativa para o melhor aproveitamento destas terras, logo o desenvolvimento de genótipos tolerantes ao encharcamento do solo é fundamental para viabilizar esta exploração. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram estudar a genética da tolerância ao encharcamento e identificar marcadores de DNA associados a esse caráter. O trabalho foi conduzido em casa de vegetação, sendo analisados genitores, híbridos F1 e populações segregantes provenientes de cruzamentos entre linhagens tolerantes e sensíveis ao encharcamento do solo. A análise molecular, através de marcadores de microssatélites, foi realizada com uma população F3, resultante do cruzamento entre os genótipos mais contrastantes para a tolerância ao encharcamento. A seleção dos marcadores obedeceu ao critério de amostrar todos os cromossomos, com preferência aos que estivessem ligados a genes pertencentes a rotas metabólicas envolvidas com a glicólise e a fermentação. Os genitores demonstraram a existência de variabilidade genética para os caracteres matéria seca de parte aérea (MSP) e matéria seca de raiz (MSR), sendo que os coeficientes de herdabilidades estimados foram elevados. Ambos os caracteres revelaram complexidade quanto ao número de genes envolvidos, onde a análise de QTL indicou a presença de pelo menos três locos envolvidos na manifestação da tolerância ao encharcamento. A ação gênica predominante foi a de dominância e o efeito materno foi pronunciado. Três marcadores explicaram conjuntamente 33,3% da variação para MSP e 19,9% para MSR, podendo ser úteis na seleção assistida para a tolerância ao encharcamento na fase de planta jovem em milho De maneira geral, a seleção fenotípica para MSP e MSR poderá ser uma alternativa eficiente na seleção de genótipos de milho com tolerância ao encharcamento do solo.

Avaliação da medida da translucência nucal em gestantes com risco elevado de anomalia congênita

A medida da translucência nucal (TN) entre 11 e 14 semanas de gestação é um exame ultra-sonográfico que mede a camada líquida na região cervical posterior do feto, sendo observado um aumento de espessura nas anomalias cromossômicas, especialmente na trissomia 21. Com sua crescente utilização, outras anormalidades fetais têm sido descritas em associação a um aumento da TN. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho da medida da TN na detecção de diferentes anomalias fetais e outros efeitos adversos para a gestação. Realizou-se de um estudo observacional, no período de 1996 a 2004, com gestantes avaliadas no Ambulatório de Aconselhamento Genético para Diagnóstico Pré-natal do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por risco aumentado de anomalia congênita, e que haviam realizado a medida da TN. Foram consideradas adequadas as TN realizadas de acordo com a padronização da Fundação de Medicina Fetal de Londres, e aumentadas aquelas TN com valor cima do percentil 95 para idade gestacional. Das 443 gestantes avaliadas, 38 seguimentos foram perdidos, 4 gestações estavam em curso na análise final dos dados, finalizando 401 gestações com desfecho conhecido. Em 275 gestações com TN adequada, a medida aumentada foi significativamente associada a anormalidades congênitas em geral (p 0,000000), cromossomopatias (p 0,000059) e perdas gestacionais (p 0,000000), sendo aumentada em oito dos 14 casos de cromossomopatia e em 6/7 dos casos com Síndrome de Down. Por outro lado, no grupo das TN inadequadas (126 casos), a associação entre TN aumentada não foi significativa para defeitos congênitos em geral (p 0,641396), nem para cromossomopatias (p 0,329194) ou perdas gestacionais (p 0,096092). Especificamente com relação aos erros inatos do metabolismo (EIM) no feto, foram localizados relatos e séries de casos com TN aumentada em dez diferentes EIM. Nas dezenove gestantes com história familiar de EIM e com medida da TN, houve um caso de uma menina afetada por MPS I com TN aumentada, e um de Raquitismo Resistente à Vitamina D com TN normal. Nos outros 17 casos, a medida da TN foi normal e não havia evidência de um EIM. Entre as novas associações de TN aumentada com síndromes genéticas, relatamos um paciente com Síndrome de Artrogripose, Anomalia renal e Colestase (ARC), cuja análise molecular na Universidade de Birmingham identificou uma mutação sem sentido (1518C>T) em homozigose no gene VPS33B. Concluiu-se que o desempenho da TN na detecção de anomalias congênitas depende da qualidade do exame, sendo que uma medida adequada aumentada está significativamente associada a defeitos congênitos, cromossomopatias e a outros desfechos gestacionais adversos, e que a sensibilidade da TN é especialmente elevada na detecção da síndrome de Down.