MLPA en el estudio de desórdenes genómicos

El término de desórdenes genómicos se utiliza para definir aquellas condiciones que surgen por inestabilidad en la molécula de ADN y, que ocasionan, rearreglos cromosómicos que involucran regiones de uno o varios pares de megabases. Estos rearreglos determinan la pérdida, ganancia o disrupción de genes cuya expresión fenotípica varía de acuerdo a la cantidad de secuencia codificante presente (dosage- sensitive- genes). Estas anormalidades genómicas surgen predominantemente durante eventos de recombinación no alélica entre cromosomas homólogos (NAHR), aunque otros mecanismos también han sido descriptos. Los rearreglos cromosómicos ocurren en puntos de quiebra que concentran regiones inestables de la molécula de ADN como lo son las secuencias repetidas llamadas LCRs (low copy repeats) que sirven como sustrato de recombinación o los sitios palindrómicos ricos en adenina- timina. Entre los desórdenes originados por alteración en la estructura genómica se cita al síndrome de deleción/duplicación 22q11.2, que incluye varios cuadros clínicos con superposición de rasgos fenotípicos. Se estima que la variabilidad clínica en estos pacientes es consecuente con la cantidad de secuencia codificante presente en relación al tamaño de la deleción/ duplicación. El advenimiento de nuevas técnicas moleculares permite actualmente determinar con precisión el segmento delecionado/ duplicado. Una nueva metodología conocida como MLPA (multiplex ligation probe amplification) podría discriminar, para este desorden en particular, cambios en el número de copias genómicas responsables de los diferentes fenotipos. Se considera que la técnica de MLPA es una herramienta de diagnóstico complementaria, con una alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de desórdenes genómicos, que permite cuantificar microdeleciones/ microduplicaciones no objetivables por otros métodos. Se espera en un futuro que el conocimiento en cuanto a los complejos mecanismos de producción de los diferentes desórdenes genómicos permita definir con claridad la existencia de una relación genotipo- fenotipo que pueda delinear a aquellas entidades con fenotipos intermedios.

Differential expression in “rogue” paramutation in peas (Pisum sativum L.)

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Multifactorial approach to non-viral gene therapy: development of an efficient system for the retina

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Identification and analysis of novel virulence-defective Rhodococcus fascians mutants

Rhodococcus fascians é uma actinomiceta fitopatogénica que induz uma doença, conhecida como irritação frondosa, caracterizada pela indução de múltiplos rebentos, numa vasta gama de plantas herbáceas dicotiledóneas. O principal factor de patogenicidade da bactéria é a produção de uma mistura de 6 citoquininas codificadas pelos genes do operão fas que está localizado num plasmídeo linear associado à virulência, pFiD188. Este trabalho teve como objectivo a análise de dois novos loci deste plasmídeo associados à virulência: GT1 que codifica uma glicosiltransferase e os genes mtr1 e mtr2, grandemente homólogos, que codificam metiltransferases dependentes de SAM. Trabalhos prévios com 21D5, mutante na glicosiltransferase, mostraram que possui uma morfologia de colónia modificada e forma agregados em culturas líquidas. Neste trabalho demonstrou-se que essas características não afectam o crescimento em meio de cultura rico, mas levam à incapacidade de proliferação em condições de privação de nutrientes, tendo um impacto forte na competência epifítica. Este impacto foi demostrado pela atenuação severa da virulência em 21D5, que foi acompanhada de uma expressão alterada dos genes fas e att, essenciais para a virulência, e consequente redução da capacidade de invasão dos tecidos da planta e de produção dos factores de virulência. Demonstrou-se também que a expressão de GT1 é induzida por compostos que são acumulados em plantas nas fases iniciais da infecção, colocando a função de GT1 no começo da interacção. Tal como R. fascians, Streptomyces turgidiscabies possui um operão fas e dois genes mtr associados. R. fascians mutantes nestes genes mtr’s perderam a capacidade de provocar sintomas, mas produziram 2MeS-citoquininas, implicando que outras citoquininas metiladas são cruciais para a indução da doença. De modo a identificar os produtos de reacção das MTRs procedeu-se à análise do perfil de citoquininas de R. fascians em condições que induzem a expressão dos genes do operão fas e de S. turgidiscabies alimentados com SAM e adenina marcadas com 14C em TLC. No entanto, não foi possível a identificação de compostos dependentes de fas ou mtr nos sobrenadantes. Pela determinação do perfil de expressão dos genes mtr in vitro e in planta tornou-se claro que a regulação destes genes é muito complexa, sendo a sua expressão limitada a células de R. fascians que colonizam o hospedeiro. Para possibilitar a identificação dos produtos de recção de MTR, desenvolveu-se um protocolo que permite a expressão in planta em condições in vitro, o que permitirá a repetição dos ensaios de marcação com 14C.

Valutazione dell’adenina come indurente da fonte rinnovabile per resine epossidiche commerciali e per la produzione di materiali compositi

Le resine più utilizzate industrialmente per la produzione di materiali compositi sono quelle epossidiche a base di diglicidil etere del bisfenolo A. Tipicamente, a livello industriale vengono utilizzate diammine sintetizzate da precursori tossici per l’ambiente e per l’uomo. Prendendo atto dell’intrinseca pericolosità di questi sistemi, sono state valutate delle alternative per rendere il processo di produzione dei materiali compositi più sostenibile e sensibile verso l’ambiente e la salute degli operatori. Questo progetto di tesi di laurea sperimentale è il proseguimento di un lavoro precedentemente svolto dal gruppo di ricerca che ha individuato l’adenina come un’alternativa non tossica e bio-based agli attuali agenti reticolanti. Nel presente lavoro di tesi, sono stati effettuati studi di formulazione e reticolazione dell’adenina con resine epossidiche commerciali da infusione e da impregnazione già utilizzate a livello industriale. L’obbiettivò è stato quello di ottenere formulati di resina e adenina capaci di dare un prodotto completamente reticolato, utilizzabile commercialmente e con elevati valori di Tg. Le formulazioni più promettenti così ottenute per ogni tipo di resina sono state utilizzate insieme a fibre di carbonio (vergini e riciclate), fibre di lino e di juta per la produzione di materiali compositi a fibra corta. Le formulazioni di resina e i compositi ottenuti sono stati caratterizzati mediante Analisi Termogravimetrica (TGA), Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC) e Analisi Dinamico Meccanica (DMA).

Studio dell’adenina come indurente per resine epossidiche e produzione di materiali compositi da fonti rinnovabili

A causa di una maggiore preoccupazione ambientale, la ricerca si sta muovendo verso lo sviluppo di nuovi prodotti bio-based. Il progetto è stato incentrato sulla possibilità di produrre materiali compositi utilizzando un sistema resina-indurente interamente ottenuto da fonti rinnovabili con fibre naturali totalmente green e sintetiche. In particolare, è stata studiata la possibilità di utilizzare l’adenina, una molecola atossica e derivante da fonte rinnovabile, per la produzione di compositi con fibre di lino, juta, carbonio vergine e riciclato con resina epossidica da fonte bio. In particolare è stato ottimizzato il ciclo di cura e sono state caratterizzate le proprietà termiche e meccaniche dei materiali prodotti mediante analisi DSC (Differential Scanning Calorimetry), DMA (Dynamic Mechanical Analysis) e TGA (Termo-Gravimetric-Analysis). Per comprendere meglio la reticolazione delle resine epossidiche, si è studiato il meccanismo di reazione tra l’adenina e un precursore epossidico attraverso spettroscopia 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance).