Increased plasticity of the stiffness of melanoma cells correlates with their acquisition of metastatic properties.

The stiffness of tumor cells varies during cancer progression. In particular, metastatic carcinoma cells analyzed by Atomic Force Microscopy (AFM) appear softer than non-invasive and normal cells. Here we examined by AFM how the stiffness of melanoma cells varies during progression from non-invasive Radial Growth Phase (RGP) to invasive Vertical Growth Phase (VGP) and to metastatic tumors. We show that transformation of melanocytes to RGP and to VGP cells is characterized by decreased cell stiffness. However, further progression to metastatic melanoma is accompanied by increased cell stiffness and the acquisition of higher plasticity by tumor cells, which is manifested by their ability to greatly augment or reduce their stiffness in response to diverse adhesion conditions. We conclude that increased plasticity, rather than decreased stiffness as suggested for other tumor types, is a marker of melanoma malignancy. These findings advise caution about the potential use of AFM for melanoma diagnosis. FROM THE CLINICAL EDITOR: This study investigates the changes to cellular stiffness in metastatic melanoma cells examined via atomic force microscopy. The results demonstrate that increased plasticity is a marker of melanoma malignancy, as opposed to decreased stiffness.

The role of the Estrogen-Responsive B box protein in skin morphogenesis, wound repair and skin disease

SUMMARY: EBBP is a poorly characterized member of the RBCC/TRIM family (RING finger B-box coiled-coilltripartite motif). It is ubiquitously expressed, but particularly high levels are found in keratinocytes. There is evidence that EBBP is involved in inflammatory processes, since it can interact with pro-interleukin-1 ß (prolL-1 ß) in human macrophages and keratinocytes, and its downregulation results in reduced secretion of IL-1 ß. IL-1ß activation and secretion requires the proteolytic cleavage of prolL-1ß by caspase-1, which in turn is actìvated by a protein complex called the inflammasome. As it has been demonstrated that EBBP can bind two different proteins of the inflammasome (NALP-1 and caspase 1), we assumed that EBBP plays a role in the regulation of inflammation and that the inflammasome, which has as yet only been described in ínflammatory cells, may also exist in keratinocytes. Indeed, I could show in my thesis that the inflammasome components are expressed in human keratinócytes at the RNA and protein level and also in vivo in human epidermis. After irradiation with a physiological dose of UVB, keratinocytes activated prolL-1ß and secreted prolL-1 a, IL-1 ß, prolL-18 and inflammasome proteins, although all these proteins lack a classical signal peptide. The secretion was dependent on caspase-1 activity, but not on de novo protein synthesis. Knock-down of NALP1 and -3, caspase-1 and -5, EBBP and Asc strongly reduced the secretion of IL-1 ß, demonstrating that also in keratinocytes inflammasome proteins are directly involved in maturation of this cytokine. These results demonstrate for the first time the presence of an active inflammasome in non-professional immune cells. Moreover, they show that UV irradiation is a stimulus for inflammasome activation in keratinocytes. For the analysis of the ín vivo functions of EBBP, transgenic mice overexpressing EBBP in the epidermis were generated. To examine the influence of EBBP overexpression on inflammatory processes, we subjected the mice to different challenges, which induce inflammation. Wound-healing, UVB irradiation and delayed hypersensitivity were tested, but we did not observe any phenotype in the K14-EBBP mice. Besides, a conditional ebbp knockout mouse has been obtained, which will allow to determine the effects of EBBP gene deletion in different tissues and organs. RESUME: EBBP est un membre encore mal connu de la famille des RBCC/TRIM (RING finger B-box coiled-coil/tripartite motif). Il est exprimé de manière ubiquitaire, et en particulier dans les kératinocytes. EBBP étant capable d'interagir avec la prointerleukine-1 ß (prolL-1 ß) dans les macrophages et les kératinocytes humains et de réguler la sécrétion de l'IL-1 ß, il est très probable que cette protéine est impliquée dans l'inflammation. L'activation et la sécrétion de l'IL-1 ß requièrent le clivage protéolytique de son précurseur prolL-1ß par la caspase-1, qui est elle-même activée par un complexe protéique appelé l'inflammasome. Comme il a été démontré qu'EBBP peut lier deux protéines de l'inflammasome (NALP-1 et caspase-1), nous avons émis l'hypothèse qu'EBBP joue un rôle dans la régulation de l'inflammation et que l'inflammasome, jusqu'ici décrit exclusivement dans des cellules inflammatoires, existe dans les kératinocytes. En effet, j'ai pu montrer dans ma thèse que les composants de l'inflammasome sont exprimés dans les kératinocytes humains ainsi que in vivo dans l'épiderme humain. Après irradiation avec une dose, physiologique d'UVB, les kératinocytes activent la prolL-1 ß et sécrètent la prolL-1a, l'IL-1 ß, la prolL-18 et des protéines de l'inflammasome, bien que toutes ces protéines soient dépourvues de peptide signal. La sécrétion dépend de la caspase-1 mais pas de la synthèse protéique de novo. Le knock-down de NALP-1 et -3, des caspase-1 et -5, d'EBBP et d'Asc réduit de manière marquée la sécrétion d'IL-1 ß, démontrant que dans les kératinocytes également, les protéines de l'inflammasome sont impliquées directement dans la maturation de cette cytokine. Ces résultats démontrent pour la première fois la présence d'un inflammasome actif dans des cellules immunitaires non professionnelles. De plus, ils montrent que l'irradiation aux UV est un stimulus pour l'activation de l'inflammasome dans les kératinocytes. Pour l'analyse des fonctions d'EBBP in vivo, nous avons généré des souris transgéniques qui surexpriment EBBP dans l'épiderme. En vue d'examiner l'influence de la surexpression d'EBBP sur le processus inflammatoire, nous avons soumis ces souris à differents modèles d'inflammation. Nous avons testé cicatrisation, UVB et hypersensibilité retardée, mais n'avons pas observé de phénotype chez les souris transgéniques. En parallèle, nous avons également généré des souris knock-out pour ebbp qui devraient nous permettre de déterminer les effets de la suppression d'EBBP dans différents tissus et organes.

Radioimmunotherapy consolidation and rituximab maintenance in the initial treatment of follicular lymphoma.

ABSTRACT: Several reports have documented similar efficacies and tolerable toxicities of radioimmunotherapy (RIT) consolidation and rituximab maintenance after initial R-chemotherapy of follicular lymphoma. The relative merits of these two interventions are currently under discussion. We now raise the question whether both RIT consolidation and rituximab maintenance should be used together aiming to augment the results achievable with R-chemotherapy.

Annotating the human genome

2 Abstract2.1 En françaisLe séquençage du génome humain est un pré-requis fondamental à la compréhension de la biologie de l'être humain. Ce projet achevé, les scientifiques ont dû faire face à une tâche aussi importante, comprendre cette suite de 3 milliards de lettres qui compose notre génome. Le consortium ENCODE (ENCyclopedia Of Dna Elements) fût formé comme une suite logique au projet du génome humain. Son rôle est d'identifier tous les éléments fonctionnels de notre génome incluant les régions transcrites, les sites d'attachement des facteurs de transcription, les sites hypersensibles à la DNAse I ainsi que les marqueurs de modification des histones. Dans le cadre de ma thèse doctorale, j'ai participé à 2 sous-projets d'ENCODE. En premier lieu, j'ai eu la tâche de développer et d'optimiser une technique de validation expérimentale à haut rendement de modèles de gènes qui m'a permis d'estimer la qualité de la plus récente annotation manuelle. Ce nouveau processus de validation est bien plus efficace que la technique RNAseq qui est actuellement en train de devenir la norme. Cette technique basée sur la RT-PCR, m'a notamment permis de découvrir de nouveaux exons dans 10% des régions interrogées. En second lieu j'ai participé à une étude ayant pour but d'identifier les extrémités de tous les gènes des chromosomes humains 21 et 22. Cette étude à permis l'identification à large échelle de transcrits chimères comportant des séquences provenant de deux gènes distincts pouvant être à une grande distance l'un de autre.2.2 In EnglishThe completion of the human genome sequence js the prerequisite to fully understand the biology of human beings. This project achieved, scientists had to face another challenging task, understanding the meaning of the 3 billion letters composing this genome. As a logical continuation of the human genome project, the ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) consortium was formed with the aim of annotating all its functional elements. These elements include transcribed regions, transcription binding sites, DNAse I hypersensitive sites and histone modification marks. In the frame of my PhD thesis, I was involved in two sub-projects of ENCODE. Firstly I developed and optimized an high throughput method to validate gene models, which allowed me to assess the quality of the most recent manually-curated annotation. This novel experimental validation pipeline is extremely effective, far more so than transcriptome profiling through RNA sequencing, which is becoming the norm. This RT-PCR-seq targeted-approach is likewise particularly efficient in identifying novel exons, as we discovered about 10% of loci with unannotated exons. Secondly, I participated to a study aiming to identify the gene boundaries of all genes in the human chromosome 21 and 22. This study led to the identification of chimeric transcripts that are composed of sequences coming form two distinct genes that can be map far away from each other.

Evaluación de productos actuales

L'objectiu final és la recerca de dispositius idonis per a la seva instal·lació en el cas d'intervencions per a l'augment d'accessibilitat en el Patrimoni Cultural. Estudi dels avantatges i desavantatges dels dispositius que faciliten l'accessibilitat tant des d'un punt de vista general com des del punt de vista de la seva ocupació en monuments, així com detalls tècnics, informació visual dels distints dispositius, referències a manuals, revistes i pàgines de proveïdors i totes l'especificacions tècniques i la informació necessària per a accedir a la base de dades online.

Protocolo para el estudio constructivo previo a las intervenciones en el patrimonio arquitectónico

Informe amb la descripció dels protocols d'estudi adequats per a l'anàlisi prèvia, durant i posterior de les intervencions en monuments per a l'augment del seu grau d'accessibilitat.

Lentiviral gene transfer to the nonhuman primate brain.

Lentiviral vectors infect quiescent cells and allow for the delivery of genes to discrete brain regions. The present study assessed whether stable lentiviral gene transduction can be achieved in the monkey nigrostriatal system. Three young adult Rhesus monkeys received injections of a lentiviral vector encoding for the marker gene beta galatosidase (beta Gal). On one side of the brain, each monkey received multiple lentivirus injections into the caudate and putamen. On the opposite side, each animal received a single injection aimed at the substantia nigra. The first two monkeys were sacrificed 1 month postinjection, while the third monkey was sacrificed 3 months postinjection. Robust incorporation of the beta Gal gene was seen in the striatum of all three monkeys. Stereological counts revealed that 930,218; 1,192,359; and 1,501,217 cells in the striatum were beta Gal positive in monkeys 1 (n = 2) and 3 (n = 1) months later, respectively. Only the third monkey had an injection placed directly into the substantia nigra and 187,308 beta Gal-positive cells were identified in this animal. The injections induced only minor perivascular cuffing and there was no apparent inflammatory response resulting from the lentivirus injections. Double label experiments revealed that between 80 and 87% of the beta Gal-positive cells were neurons. These data indicate that robust transduction of striatal and nigral cells can occur in the nonhuman primate brain for up to 3 months. Studies are now ongoing testing the ability of lentivirus encoding for dopaminergic trophic factors to augment the nigrostriatal system in nonhuman primate models of Parkinson's disease.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Towards the validation of "in silico" models and physicochemical filters to identify and characterize new chemical entities

Summary: Lipophilicity plays an important role in the determination and the comprehension of the pharmacokinetic behavior of drugs. It is usually expressed by the partition coefficient (log P) in the n-octanol/water system. The use of an additional solvent system (1,2-dichlorethane/water) is necessary to obtain complementary information, as the log Poct values alone are not sufficient to explain ail biological properties. The aim of this thesis is to develop tools allowing to predict lipophilicity of new drugs and to analyze the information yielded by those log P values. Part I presents the development of theoretical models used to predict lipophilicity. Chapter 2 shows the necessity to extend the existing solvatochromic analyses in order to predict correctly the lipophilicity of new and complex neutral compounds. In Chapter 3, solvatochromic analyses are used to develop a model for the prediction of the lipophilicity of ions. A global model was obtained allowing to estimate the lipophilicity of neutral, anionic and cationic solutes. Part II presents the detailed study of two physicochemical filters. Chapter 4 shows that the Discovery RP Amide C16 stationary phase allows to estimate lipophilicity of the neutral form of basic and acidic solutes, except of lipophilic acidic solutes. Those solutes present additional interactions with this particular stationary phase. In Chapter 5, 4 different IANI stationary phases are investigated. For neutral solutes, linear data are obtained whatever the IANI column used. For the ionized solutes, their retention is due to a balance of electrostatic and hydrophobie interactions. Thus no discrimination is observed between different series of solutes bearing the same charge, from one column to an other. Part III presents two examples illustrating the information obtained thanks to Structure-Properties Relationships (SPR). Comparing graphically lipophilicity values obtained in two different solvent systems allows to reveal the presence of intramolecular effects .such as internai H-bond (Chapter 6). SPR is used to study the partitioning of ionizable groups encountered in Medicinal Chemistry (Chapter7). Résumé La lipophilie joue un .rôle important dans la détermination et la compréhension du comportement pharmacocinétique des médicaments. Elle est généralement exprimée par le coefficient de partage (log P) d'un composé dans le système de solvants n-octanol/eau. L'utilisation d'un deuxième système de solvants (1,2-dichloroéthane/eau) s'est avérée nécessaire afin d'obtenir des informations complémentaires, les valeurs de log Poct seules n'étant pas suffisantes pour expliquer toutes les propriétés biologiques. Le but de cette thèse est de développer des outils permettant de prédire la lipophilie de nouveaux candidats médicaments et d'analyser l'information fournie par les valeurs de log P. La Partie I présente le développement de modèles théoriques utilisés pour prédire la lipophilie. Le chapitre 2 montre la nécessité de mettre à jour les analyses solvatochromiques existantes mais inadaptées à la prédiction de la lipophilie de nouveaux composés neutres. Dans le chapitre 3, la même méthodologie des analyses solvatochromiques est utilisée pour développer un modèle permettant de prédire la lipophilie des ions. Le modèle global obtenu permet la prédiction de la lipophilie de composés neutres, anioniques et cationiques. La Partie II présente l'étude approfondie de deux filtres physicochimiques. Le Chapitre 4 montre que la phase stationnaire Discovery RP Amide C16 permet la détermination de la lipophilie de la forme neutre de composés basiques et acides, à l'exception des acides très lipophiles. Ces derniers présentent des interactions supplémentaires avec cette phase stationnaire. Dans le Chapitre 5, 4 phases stationnaires IAM sont étudiées. Pour les composés neutres étudiés, des valeurs de rétention linéaires sont obtenues, quelque que soit la colonne IAM utilisée. Pour les composés ionisables, leur rétention est due à une balance entre des interactions électrostatiques et hydrophobes. Donc aucune discrimination n'est observée entre les différentes séries de composés portant la même charge d'une colonne à l'autre. La Partie III présente deux exemples illustrant les informations obtenues par l'utilisation des relations structures-propriétés. Comparer graphiquement la lipophilie mesurée dans deux différents systèmes de solvants permet de mettre en évidence la présence d'effets intramoléculaires tels que les liaisons hydrogène intramoléculaires (Chapitre 6). Cette approche des relations structures-propriétés est aussi appliquée à l'étude du partage de fonctions ionisables rencontrées en Chimie Thérapeutique (Chapitre 7) Résumé large public Pour exercer son effet thérapeutique, un médicament doit atteindre son site d'action en quantité suffisante. La quantité effective de médicament atteignant le site d'action dépend du nombre d'interactions entre le médicament et de nombreux constituants de l'organisme comme, par exemple, les enzymes du métabolisme ou les membranes biologiques. Le passage du médicament à travers ces membranes, appelé perméation, est un paramètre important à optimiser pour développer des médicaments plus puissants. La lipophilie joue un rôle clé dans la compréhension de la perméation passive des médicaments. La lipophilie est généralement exprimée par le coefficient de partage (log P) dans le système de solvants (non miscibles) n-octanol/eau. Les valeurs de log Poct seules se sont avérées insuffisantes pour expliquer la perméation à travers toutes les différentes membranes biologiques du corps humain. L'utilisation d'un système de solvants additionnel (le système 1,2-dichloroéthane/eau) a permis d'obtenir les informations complémentaires indispensables à une bonne compréhension du processus de perméation. Un grand nombre d'outils expérimentaux et théoriques sont à disposition pour étudier la lipophilie. Ce travail de thèse se focalise principalement sur le développement ou l'amélioration de certains de ces outils pour permettre leur application à un champ plus large de composés. Voici une brève description de deux de ces outils: 1)La factorisation de la lipophilie en fonction de certaines propriétés structurelles (telle que le volume) propres aux composés permet de développer des modèles théoriques utilisables pour la prédiction de la lipophilie de nouveaux composés ou médicaments. Cette approche est appliquée à l'analyse de la lipophilie de composés neutres ainsi qu'à la lipophilie de composés chargés. 2)La chromatographie liquide à haute pression sur phase inverse (RP-HPLC) est une méthode couramment utilisée pour la détermination expérimentale des valeurs de log Poct.

A peripheral dose calculation model for estimating second cancer risk after breast radiotherapy

AbstractBreast cancer is one of the most common cancers affecting one in eight women during their lives. Survival rates have increased steadily thanks to early diagnosis with mammography screening and more efficient treatment strategies. Post-operative radiation therapy is a standard of care in the management of breast cancer and has been shown to reduce efficiently both local recurrence rate and breast cancer mortality. Radiation therapy is however associated with some late effects for long-term survivors. Radiation-induced secondary cancer is a relatively rare but severe late effect of radiation therapy. Currently, radiotherapy plans are essentially optimized to maximize tumor control and minimize late deterministic effects (tissue reactions) that are mainly associated with high doses (» 1 Gy). With improved cure rates and new radiation therapy technologies, it is also important to evaluate and minimize secondary cancer risks for different treatment techniques. This is a particularly challenging task due to the large uncertainties in the dose-response relationship.In contrast with late deterministic effects, secondary cancers may be associated with much lower doses and therefore out-of-field doses (also called peripheral doses) that are typically inferior to 1 Gy need to be determined accurately. Out-of-field doses result from patient scatter and head scatter from the treatment unit. These doses are particularly challenging to compute and we characterized it by Monte Carlo (MC) calculation. A detailed MC model of the Siemens Primus linear accelerator has been thoroughly validated with measurements. We investigated the accuracy of such a model for retrospective dosimetry in epidemiological studies on secondary cancers. Considering that patients in such large studies could be treated on a variety of machines, we assessed the uncertainty in reconstructed peripheral dose due to the variability of peripheral dose among various linac geometries. For large open fields (> 10x10 cm2), the uncertainty would be less than 50%, but for small fields and wedged fields the uncertainty in reconstructed dose could rise up to a factor of 10. It was concluded that such a model could be used for conventional treatments using large open fields only.The MC model of the Siemens Primus linac was then used to compare out-of-field doses for different treatment techniques in a female whole-body CT-based phantom. Current techniques such as conformai wedged-based radiotherapy and hybrid IMRT were investigated and compared to older two-dimensional radiotherapy techniques. MC doses were also compared to those of a commercial Treatment Planning System (TPS). While the TPS is routinely used to determine the dose to the contralateral breast and the ipsilateral lung which are mostly out of the treatment fields, we have shown that these doses may be highly inaccurate depending on the treatment technique investigated. MC shows that hybrid IMRT is dosimetrically similar to three-dimensional wedge-based radiotherapy within the field, but offers substantially reduced doses to out-of-field healthy organs.Finally, many different approaches to risk estimations extracted from the literature were applied to the calculated MC dose distribution. Absolute risks varied substantially as did the ratio of risk between two treatment techniques, reflecting the large uncertainties involved with current risk models. Despite all these uncertainties, the hybrid IMRT investigated resulted in systematically lower cancer risks than any of the other treatment techniques. More epidemiological studies with accurate dosimetry are required in the future to construct robust risk models. In the meantime, any treatment strategy that reduces out-of-field doses to healthy organs should be investigated. Electron radiotherapy might offer interesting possibilities with this regard.RésuméLe cancer du sein affecte une femme sur huit au cours de sa vie. Grâce au dépistage précoce et à des thérapies de plus en plus efficaces, le taux de guérison a augmenté au cours du temps. La radiothérapie postopératoire joue un rôle important dans le traitement du cancer du sein en réduisant le taux de récidive et la mortalité. Malheureusement, la radiothérapie peut aussi induire des toxicités tardives chez les patients guéris. En particulier, les cancers secondaires radio-induits sont une complication rare mais sévère de la radiothérapie. En routine clinique, les plans de radiothérapie sont essentiellement optimisées pour un contrôle local le plus élevé possible tout en minimisant les réactions tissulaires tardives qui sont essentiellement associées avec des hautes doses (» 1 Gy). Toutefois, avec l'introduction de différentes nouvelles techniques et avec l'augmentation des taux de survie, il devient impératif d'évaluer et de minimiser les risques de cancer secondaire pour différentes techniques de traitement. Une telle évaluation du risque est une tâche ardue étant donné les nombreuses incertitudes liées à la relation dose-risque.Contrairement aux effets tissulaires, les cancers secondaires peuvent aussi être induits par des basses doses dans des organes qui se trouvent hors des champs d'irradiation. Ces organes reçoivent des doses périphériques typiquement inférieures à 1 Gy qui résultent du diffusé du patient et du diffusé de l'accélérateur. Ces doses sont difficiles à calculer précisément, mais les algorithmes Monte Carlo (MC) permettent de les estimer avec une bonne précision. Un modèle MC détaillé de l'accélérateur Primus de Siemens a été élaboré et validé avec des mesures. La précision de ce modèle a également été déterminée pour la reconstruction de dose en épidémiologie. Si on considère que les patients inclus dans de larges cohortes sont traités sur une variété de machines, l'incertitude dans la reconstruction de dose périphérique a été étudiée en fonction de la variabilité de la dose périphérique pour différents types d'accélérateurs. Pour de grands champs (> 10x10 cm ), l'incertitude est inférieure à 50%, mais pour de petits champs et des champs filtrés, l'incertitude de la dose peut monter jusqu'à un facteur 10. En conclusion, un tel modèle ne peut être utilisé que pour les traitements conventionnels utilisant des grands champs.Le modèle MC de l'accélérateur Primus a été utilisé ensuite pour déterminer la dose périphérique pour différentes techniques dans un fantôme corps entier basé sur des coupes CT d'une patiente. Les techniques actuelles utilisant des champs filtrés ou encore l'IMRT hybride ont été étudiées et comparées par rapport aux techniques plus anciennes. Les doses calculées par MC ont été comparées à celles obtenues d'un logiciel de planification commercial (TPS). Alors que le TPS est utilisé en routine pour déterminer la dose au sein contralatéral et au poumon ipsilatéral qui sont principalement hors des faisceaux, nous avons montré que ces doses peuvent être plus ou moins précises selon la technTque étudiée. Les calculs MC montrent que la technique IMRT est dosimétriquement équivalente à celle basée sur des champs filtrés à l'intérieur des champs de traitement, mais offre une réduction importante de la dose aux organes périphériques.Finalement différents modèles de risque ont été étudiés sur la base des distributions de dose calculées par MC. Les risques absolus et le rapport des risques entre deux techniques de traitement varient grandement, ce qui reflète les grandes incertitudes liées aux différents modèles de risque. Malgré ces incertitudes, on a pu montrer que la technique IMRT offrait une réduction du risque systématique par rapport aux autres techniques. En attendant des données épidémiologiques supplémentaires sur la relation dose-risque, toute technique offrant une réduction des doses périphériques aux organes sains mérite d'être étudiée. La radiothérapie avec des électrons offre à ce titre des possibilités intéressantes.

Exposition aux bactéries aéroportées dans, et autour des élevages de porcs

En France, il y a plus de 30 000 exploitations élevant près de 15 millions de porcs. De nos jours, l'élevage du porc s'est intensifié et la densité de bêtes par m2 a fortement augmenté. Cette forte densité d'animaux, souvent confinés dans des locaux clos, génère une quantité importante de déchets et de poussière organique. Cette poussière, contenant beaucoup de microorganismes (bactéries, champignons) et d'endotoxines est facilement mise en suspension lors des différentes activités des animaux et des travailleurs. A cela s'ajoute des dégagements de gaz tels que l'ammoniac et l'hydrogène sulfuré qui contribuent aussi à la détérioration de la qualité de l'air. L'augmentation de la taille des exploitations implique une présence plus importante de l'éleveur et donc une exposition de plus longue durée à ces nuisances aéroportées. Plusieurs études ont montré que les éleveurs de porcs avaient significativement plus de symptômes de bronchite chronique, d'inflammation des voies respiratoires et d'asthme que des personnes ne travaillant pas dans des élevages ou dans des fermes (Cole et al., 2000). Le premier article analysé (Ko et al., 2008) traite de la caractérisation microbiologique des bioaérosols émis dans l'environnement immédiat des élevages de porcs. La seconde étude (Nehme et al., 2008) s'attache à montrer la pertinence des méthodes moléculaires pour quantifier et caractériser les bactéries dans l'air des porcheries. [Auteur]

Dipòsit i caracterització de capes primes orgàniques de P3HT:PCBM per a aplicacions fotovoltaiques

En un món on el ritme de la societat actual ens ha portat a considerar les energies enovables com a prioritat vital i necessària i en el que es preveu que la demanda energètica augmenti un 50% fins al 2030, l'interès en la recerca de materials emiconductors orgànics per aplicacions de captura solar, ha assolit un potencial enorme de cara al futur. Molts són el avantatges que presenten aquest tipus de materials en front als seus homòlegs inorgànics. La facilitat de fabricació, la utilització de materials més econòmics i amb menys impacte ambiental, així com la possibilitat de produir dispositius flexibles, són algunes de les atractives aracterístiques que presenten aquests materials. No obstant, certs inconvenients om les baixes eficiències energètiques dels dispositius, i la inestabilitat ambiental ue es tradueix en un temps de vida molt reduït, fan que encara s'hagi d'invertir sforç per aconseguir que aquests materials puguin ser utilitzats en el camp de la aptura d'energia solar. El material més prometedor fins a data d'avui és el P3HT:PCBM. Es tracta d'un sistema polímer:molècula lleugera, on el P3HT actua com a component donador del sistema i el PCBM actua com a component acceptor. Les propietats optoelectròniques i eficiències energètiques de combinats orgànics P3HT:PCBM epèn en gran mesura de la seva morfologia i microestructura. Paràmetres com la proporció entre els components, el dissolvent utilitzat en la dissolució, així com 'aplicació de determinats tractaments tèrmics afecten de forma crítica a la seva orfologia. Durant el present treball s'han utilitzat diverses tècniques de caracterització per a estudiar determinades propietats que presenten aquest tipus de aterials. Entre les tècniques experimentals utilitzades hi trobem la microscòpia FM, l'espectroscòpia Raman i la conductimetria AFM o current sensing AFM CS-AFM). Els experiments en temps real durant l'escalfament de capes primes 3HT:PCBM, mostren que el P3HT pateix una cristal·lització al voltant dels 140ºC, permetent el reordenament de les molècules i un millor solapament del sorbitals [pi]-[pi]*, que resulta en un increment del transport de forats a través de la fase donadora del material. Paralel·lament, entre els 80-120ºC, el material també presenta determinats canvis tant en el comportament dels enllaços, com en la cristal·linitat del material, provocant una quasi transició de fase que atribuïm a la transició vitrea del material. Per altra banda, experiments amb conductimetria AFM realitzats en sistemes P3HT:HDPE mostren un signicatiu augment en la eva estabilitat ambiental, que es tradueix en un augment del temps de vida, sense una pèrdua considerable en els seus valors de conducció. Tot i la combinació del P3HT amb proporcions de polímers aïllants de fins al 80%, el sistema és capaç de no perdre la capacitat de transport gràcies a la formació de fases i dominis rics en P3HT. El present treball posa de manifest que ens trobem davant d'una tecnologia emergent i que nous estudis i esforços en la recerca d'aquest tipus materials és fonamental per aconseguir nous resultats i posicionar als materials semiconductors orgànics com una alternativa viable en el camp dels dispositus fotovoltaics. Assumint dades procedents de la tecnologia actual utilitzada en aquest tipus de materials, estudis i avaluacions ambientals i econòmiques mostren que petits increments tant en les eficiències com en el temps de vida de dispositius basats en aterials orgànics, posicionarien a aquest material com a alternativa totalment viable en el mercat fotovoltaic d'un futur proper.

Avaluació de la capacitat de segrest de carboni d'un sòl restaurat amb fangs de depuradora: estabilitat de la matèria orgànica

L’avaluació de la capacitat de segrest de carboni d’un sòl denudat per l’extracció de calcàries i la seva posterior restauració amb fangs de depuradora s’ha realitzat mitjançant l’anàlisi de l’estabilitat de la matèria orgànica del sòl (MOS) en funció de la dosi de fangs aplicada. Els resultats d’aquest treball demostren dos fets fonamentals per a l’estudi de la capacitat de segrest de carboni, els qual són: la conservació del contingut total de MOS i l’augment de la seva estabilitat fins a nivells més alts que els de la MOS de les parcel·les de control. Aquests resultats són explicables per (i) la conservació i augment de la MOS recalcitrant, i (ii) la protecció d’una porció més o menys rellevant de la MO làbil continguda amb els fangs gràcies a l’acció simultània dels mecanismes d’estabilització de la MOS, com són: l’estabilització bioquímica (humificació), química, física, a més de la pròpia hidrofobicitat de la MOS, aquests dos últims potenciats per l’addicció del fangs de depuradora.

Desenvolupament de vacunes peptídiques y dendrímers basats en polietilenglicol per al tractament del càncer

El principal problema de les teràpies actuals contra el càncer es la baixa especificitat envers les cèl•lules tumorals, cosa que comporta gran quantitat d’efectes secundaris. Per això es important el desenvolupament de nous tipus de teràpies i sistemes d’alliberament efectius per als fàrmacs ja existents al mercat. En la immunoteràpia contra el càncer es pretén estimular el sistema immunològic per a eliminar les cèl•lules canceroses de manera selectiva. En aquest projecte s’han sintetitzat derivats de l’antigen peptídic de melanoma NY-ESO1 i s’ha estudiat la seva capacitat per a estimular el sistema immunològic com a vacunes contra el càncer. També s’han encapsulat el antígens peptídics en liposomes com a adjuvants i sistemes d’alliberament. De totes les variants peptídiques la que resultà més immunogènica fou la que contenia el grup palmitoil i el fragment toxoide tetànic en la seva estructura. La utilització de liposomes com a sistema adjuvant sembla una estratègia interessant per al disseny de vacunes contra el càncer donat que l’encapsulació del pèptid en liposomes va augmentar notablement la resposta immunològica de l’antigen. Per altra banda, s’han desenvolupat dendrímers basats en polietilenglicol com a sistemes alliberadors de fàrmacs per al tractament de tumors. El polietilenglicol és àmpliament utilitzat com a sistema d’alliberament de fàrmacs degut a les seves interessants propietats, augment de la solubilitat i dels temps de residència en plasma, entre d’altres. La metodologia química descrita permet la diferenciació controlada de varies posicions en la superfície del dendrímer a més del creixement del dendrímer fins a una segona generació. S’ha sintetitzat la primera generació del dendrímer contenint el fàrmac antitumoral 5-fluorouracil i s’han realitzat estudis de citotoxicitat comprovant que l’activitat del nanoconjugat és del mateix ordre de magnitud que el 5-fluorouracil sense conjugar.

TAT-RasGAP317-326-mediated tumor cell death sensitization can occur independently of Bax and Bak.

The increase of cancer specificity and efficacy of anti-tumoral agents are prime strategies to overcome the deleterious side effects associated with anti-cancer treatments. We described earlier a cell-permeable protease-resistant peptide derived from the p120 RasGAP protein, called TAT-RasGAP317-326, as being an efficient tumor-specific sensitizer to apoptosis induced by genotoxins in vitro and in vivo. Bcl-2 family members regulate the intrinsic apoptotic response and as such could be targeted by TAT-RasGAP317-326. Our results indicate that the RasGAP-derived peptide increases cisplatin-induced Bax activation. We found no evidence, using in particular knock-out cells, of an involvement of other Bcl-2 family proteins in the tumor-specific sensitization activity of TAT-RasGAP317-326. The absence of Bax and Bak in mouse embryonic fibroblasts rendered them resistant to cisplatin-induced apoptosis and consequently to the sensitizing action of the RasGAP-derived peptide. Surprisingly, in the HCT116 colon carcinoma cell line, the absence of Bax and Bak did not prevent cisplatin-induced apoptosis and the ability of TAT-RasGAP317-326 to augment this response. Our study also revealed that p53, while required for an efficient genotoxin-induced apoptotic response, is dispensable for the ability of the RasGAP-derived peptide to improve the capacity of genotoxins to decrease long-term survival of cancer cells. Hence, even though genotoxin-induced Bax activity can be increased by TAT-RasGAP317-326, the sensitizing activity of the RasGAP-derived peptide can operate in the absence of a functional mitochondrial intrinsic death pathway.