Efeito da administração aguda de arginina sobre aspectos bioquímicos e comportamentais em ratos adultos

Os erros inatos do metabolismo (EIM) constituem um grupo de doenças genéticas causadas pela deficiência ou ausência de uma proteína, geralmente uma enzima. A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência de arginase, enzima que converte a arginina em ornitina e uréia. O bloqueio desta reação resulta no acúmulo tecidual e plasmático de arginina e seus metabólitos, os compostos guanidínicos. As manifestações clínicas desta doença diferem substancialmente das demais doenças metabólicas do ciclo da uréia. Seus principais sintomas, que manifestam-se progressivamente, são caracterizados por espasticidade, epilepsia e retardo mental. A correlação entre o metabolismo da arginina e do óxido nítrico ocorre no chamado ciclo arginina-citrulina. A arginina é o substrato para a síntese de óxido nítrico pela ação da enzima óxido nítrico sintetase (ONS). Como os pacientes hiperargininêmicos apresentam altos níveis de arginina no plasma e tecidos, é provável que, devido ao excesso deste substrato, ocorra um aumento na síntese de óxido nítrico. O óxido nítrico em concentrações elevadas está associado à produção de radicais livres, neurotoxicidade e inibição da enzima Na+,K+-ATPase. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental ao funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC), pois regula a transmissão do impulso nervoso, o volume celular e o transporte de moléculas ligadas ao cotransporte de Na+, tais como aminoácidos, glicose e neurotransmissores. A inibição da atividade da Na+,K+-ATPase nos sítios pré-sinápticos resulta na inibição da recaptação de glutamato, bem como na estimulação de sua liberação. A inibição desta enzima também tem sido associada a diversas neuropatologias. A Na+,K+-ATPase também está envolvida na LTP (long term potentiation – potenciação de longa duração), que é um tipo de neuroplasticidade celular que provoca alterações nas cascatas bioquímicas no SNC, que são, muitas vezes, idênticas àquelas que ocorrem durante o processo de formação da memória. Assim, acredita-se que a LTP seja um dos diversos mecanismos bioquímicos importantes para a formação da memória. Neste estudo investigamos o efeito in vivo da administração aguda de arginina, L-NAME (um potente inibidor da ONS) e a co-administração de Arg + L-NAME sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos adultos e sobre testes 6 comportamentais utilizados para avaliar o aprendizado e memória: campo aberto e esquiva inibitória. Os resultados obtidos demonstraram que a arginina inibiu significativamente a atividade da enzima Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos. A administração de L-NAME não alterou a atividade da enzima, mas preveniu a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase causada pela arginina. Nos experimentos de comportamento foram avaliados o aprendizado, a consolidação e a evocação da memória de longa duração pela administração das soluções em três momentos diferentes. A arginina diminuiu o desempenho do teste de esquiva inibitória nos três momentos, o L-NAME isoladamente não alterou o comportamento dos animais, mas quando co-administrado com a arginina aumentou a capacidade de memorização desta tarefa. Estes resultados indicam que a administração de arginina in vivo reduz tanto a atividade da Na+,K+-ATPase como a modulação da memória em ratos, e que isso ocorreu, provavelmente, pelo aumento da síntese de óxido nítrico. Assumindo a possibilidade de que isso possa ocorrer em pacientes com hiperargininemia, os resultados obtidos podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a disfunção neurológica associada a essa doença.

Efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre as atividades enzimáticas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

A deficiência de desidrogenase das acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo devido a um defeito no último ciclo de β-oxidação, sendo específica para ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 carbonos), resultando no acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico, formados pela metabolização por rotas secundárias do butiril-CoA acumulado. A deficiência de SCAD manifesta-se principalmente no período neonatal ou durante a infância e até mesmo na idade adulta. Os achados clínico-laboratoriais são heterogêneos, incluindo acidose metabólica, acidose lática, vômitos, atraso no desenvolvimento, convulsões, fraqueza muscular e miopatia crônica. No entanto, o sintoma mais comum apresentado pelos pacientes portadores dessa deficiência é a disfunção neurológica, a qual pode estar relacionada ao acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta e sua toxicidade ao sistema nervoso central. No presente trabalho nosso objetivo foi investigar o efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre algumas atividades enzimáticas fundamentais para o metabolismo energético. Visando contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia dessa doença testamos o efeito desses metabólitos sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens. Verificamos que os ácidos etilmalônico e metilsucínico, na concentração de 1 mM, inibiram significativamente a atividade do complexo I+III da cadeia respiratória em córtex cerebral de ratos, porém não alteraram a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória (II, SDH, II+III, III e IV) nesses tecido bem como não alteraram a atividade de todos os complexos da cadeia repiratória em músculo esquelético e músculo cardíaco dos ratos nas concentrações de 1 e 5 mM. Observamos também que o ácido etilmalônico (1 e 2,5 mM) reduziu de forma significativa a atividade total de creatina quinase em córtex cerebral de ratos, mas não alterou essa atividade nos músculos esquelético e cardíaco. Por outro lado o ácido metilsucínico não modificou a atividade total da creatina quinase em nenhum dos três tecidos estudados, córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos. Testamos então o efeito do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase nas frações mitocondrial e citosólica de córtex cerebral, músculo cardíaco e músculo esquelético de ratos. O ácido (1 e 2,5 mM) inibiu significativamente a atividade da creatina quinase apenas na fração mitocondrial de córtex cerebral. Demostramos também que o antioxidante glutationa (1 mM) preveniu o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade total da creatina quinase em córtex cerebral. A glutationa (0,5 mM) e o ácido ascórbico (0,5 mM) também preveniram o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase na fração mitocondrial de córtex cerebral. Por outro lado a adição de L-NAME ou trolox não alterou o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase. Esses resultados indicam que o ácido etilmalônico possui um efeito inibitório específico sobre a isoforma mitocondrial da creatina quinase do cérebro, ou seja, sobre a CKmi a, não afetando a isoenzima citosólica cerebral ou as isoenzimas citosólicas e mitocondrial presentes no músculo esquelético e no músculo cardíaco. Além disso, o efeito da glutationa, que atua como um agente redutor de grupos tióis, indica que a ação inibitória do ácido etilmalônico sobre a creatina quinase pode estar relaciona à oxidação de grupos sulfidrila essenciais à atividade da enzima. Já a prevenção do efeito inibitório do ácido etilmalônico causada pelo ácido ascórbico sugere que o ácido pode estar envolvido com a formação dos radicais superóxido e hidroxila, uma vez que este agente antioxidante atua sobre esses radicais livres. Essas observações em seu conjunto indicam que os ácidos etilmalônico e metilsucínico comprometem o metabolismo energético cerebral através da inibição de atividades enzimáticas essenciais para a produção e transporte de energia pela célula. É, portanto, possível que esse possa ser um dos mecanismos envolvidos com o dano cerebral que ocorre nos pacientes afetados por deficiência de SCAD.

Avaliação do estresse oxidativo no desenvolvimento da hipertensão renovascular : papel protetor dos estrogênios

A contribuição dos radicais livres na hipertensão está relacionada com a produção do ânion radical superóxido e sua influência na ativação da enzima conversora da angiotensina (ECA). Os estrogênios têm um potencial antioxidante bastante relevante, uma vez que esse hormônio esteróide pode interferir no processo de iniciação da lipoperoxidação (LPO), atuando como “scavenger” de radicais livres. Foram objetivos deste trabalho avaliar a influência dos estrogênios na LPO, na capacidade antioxidante total (TRAP), na atividade das enzimas antioxidantes e no metabolismo do NO em coração e rins de ratas hipertensas. Procurou-se, ainda, avaliar a progressão temporal do estresse oxidativo sistêmico. Foram utilizadas 60 ratas Wistar, divididas em 4 grupos: normotenso controle (NCO), hipertenso controle (HCO), normotenso castrado (NCA) e hipertenso castrado (HCA). Foi induzida a hipertensão renovascular (modelo Goldblatt 2) por 21 dias e, concomitantemente, realizada a ovariectomia. Num grupo de animais, amostras de sangue foram coletadas no 3º, 10º e 20º dia. Em outros animais, os corações e rins foram homogeneizados, no 21° dia. Na avaliação sistêmica, a quimiluminescência (QL) aumentou do 3º para o 21º dia nos grupos HCO, NCA e HCA em relação ao grupo NCO. A atividade da superóxido dismutase (SOD) seguiu o mesmo padrão de oscilação. Os níveis de nitratos também aumentaram no 21° dia nos grupos HCO, NCA e HCA. No entanto, no 3° dia mostraram-se menores que os do grupo NCO.A atividade da catalase (CAT) mostrou-se aumentada no 10º dia nos grupos HCO e HCA em relação aos grupos NCO e NCA. Já o TRAP apresentou-se diminuído no 10° dia nos grupos HCO, NCA e HCA em relação ao 3° dia e ao grupo NCO. Nos tecidos, a LPO apresentou-se aumentada no grupo NCA em relação ao grupo NCO e o grupo HCA apresentou-se aumentado em relação aos grupos HCO e NCA . A atividade da SOD em homogeneizado cardíaco apresentou-se aumentada nos grupos hipertensos. A atividade da glutationa peroxidase (GPx) em tecido cardíaco apresentou-se aumentada no grupo HCO em relação aos grupos NCO e HCA. A atividade da CAT em homogeneizado cardíaco apresentou-se aumentada nos grupos HCO e NCA em relação ao grupo NCO. No rim a CAT apresentou-se aumentada nos grupos castrados. A atividade da glutationa S-transferase (GST), em coração e rins, apresentou-se aumentada com a hipertensão. O TRAP apresentou-se, em tecido cardíaco, diminuído no grupo HCO e aumentado no grupo HCA. No tecido renal, apenas o grupo NCA apresentou TRAP aumentado. O nível de nitratos em tecido cardíaco apresentou-se menor no grupo HCO e maior no grupo NCA em relação ao grupo NCO. O grupo HCA apresentou-se menor em relação ao grupo NCA. Nos homogeneizados de rins a SOD, a GPx e os nitratos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Pode-se observar que tanto a hipertensão quanto a castração induziram um aumento de estresse oxidativo sistêmico que progride com o passar do tempo, assim como adaptações do sistema antioxidante enzimático e não enzimático. Nos tecidos, o estresse oxidativo é aumentado pela retirada dos estrogênios, efeito este potencializado quando concomitante à hipertensão. Os dados encontrados neste trabalho confirmam a ação antioxidante dos estrogênios.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Relação entre resistência dos músculos ventilatórios e resistência geral em indivíduos com doença pulmonar obstrutiva crônica

O desempenho do sistema músculo esquelético pode ser afetado por muitos fatores durante o exercício. Em indivíduos saudáveis, o sistema muscular é o principal fator limitante da atividade aeróbia. O desempenho físico durante o exercício em pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) pode estar limitado por fatores como fraqueza dos músculos ventilatórios, alteração da mecânica da caixa torácica e também pelo metabolismo anaeróbio. O objetivo do estudo foi avaliar se existe correlação entre a resistência muscular ventilatória com a capacidade ao exercício em indivíduos com DPOC. Para determinar a capacidade de resistir trabalho da musculatura ventilatória, realizamos o teste incremental destes músculos proposto por Martyn e col. A capacidade ao exercício foi determinada pelo teste da caminhada de seis minutos. Foram avaliados onze indivíduos com diagnóstico clínico de DPOC (VEF1 1.01+/-0.52 L / idade 67+/-12anos). A distância percorrida no teste de caminha em metros se correlacionou positivamente com resistência ventilatória, expressa em peso (r=0.72) e com VEF1 (r=0.75). Com base nestes resultados conclui-se que a capacidade ao exercício em indivíduos com DPOC correlaciona-se com resistência da musculatura ventilatória.

Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

Identificação das características cinéticas, expressão e localização das ecto-nucleotidases em cultura de astrócitos e linhagens de gliomas

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

Efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros do sistema glutamatérgico e de estresse oxidativo em cérebro de ratos

A deficiência da enzima desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo potencialmente letal que afeta o último ciclo da oxidação de ácidos graxos. O bloqueio da rota na conversão de n-butiril-CoA a acetil-CoA resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico. Os pacientes afetados apresentam episódios de acidose metabólica intermitente, hiperamonemia, coma e acidose neonatal com hiperreflexia, miopatia por depósito de lipídios e hipotonia. Os sinais e sintomas dessa doença são variáveis, podendo aparecer em qualquer idade, do nascimento à vida adulta, e em combinações variáveis, freqüentemente levando a episódios ameaçadores à vida de descompensação metabólica depois de um período de ingesta inadequada de calorias e/ou doença intercorrente. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na deficiência da SCAD é pouco conhecida, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros envolvendo o sistema glutamatérgico e a produção de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens. Observamos inicialmente que o ácido etilmalônico promoveu uma diminuição significativa na captação de L-[3H]glutamato por fatias de córtex nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Já nas técnicas relacionadas à união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas, o ácido provocou uma diminuição da ligação de L-[3H]glutamato às membranas na ausência de sódio em todas as concentrações testadas (0,01 – 1,0 mM) e, quando em presença de sódio, houve diminuição da união somente na concentração de 1,0 mM do ácido. Por outro lado, não foi verificado qualquer efeito desse ácido sobre a captação vesicular de L-[3H]glutamato nas concentrações utilizadas. O ácido metilsucínico comportou-se de forma semelhante ao ácido etilmalônico nos parâmetros de captação de L-[3H]glutamato por fatias e união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas. Houve uma diminuição da captação de glutamato por fatias de córtex cerebral, uma diminuição da união de L-[3H]glutamato na ausência de sódio em todas as concentrações e, na presença de sódio, uma diminuição da captação apenas na concentração de 1,0 mM. Por outro lado, distintamente do que ocorreu com o ácido etilmalônico, na captação vesicular observamos uma diminuição da captação em todas as concentrações testadas. Nossos resultados demonstram, desta forma, alterações importantes no sistema glutamatérgico pelos ácidos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta. A etapa seguinte foi investigar o efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens: medida do potencial antioxidante total (TRAP), medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e medida de quimiluminescência. Foi verificado que os dois ácidos não afetam a lipoperoxidação, medida através do TBA-RS e quimiluminescência e tampouco as defesas antioxidantes não-enzimáticas, medidas através do TRAP. Embora não tenhamos medido o efeito dos ácidos sobre as defesas enzimáticas antioxidantes representadas pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os resultados dos parâmetros analisados no presente trabalho sugerem que os ácidos acumulados na deficiência da SCAD não produzem estresse oxidativo.

Estudo sobre a biodegradação do herbicida trufluralina por bactérias isoladas de solo agrícola e proposta metodológica para o ensino de biodegradação

Trifluralina (a, a, a,trifluoro-2,6-dinitro-N, N-dipropil-p-toluidina) (TFL) é um herbicida pré-emergente, incorporado ao solo que tem sido usado na agricultura desde a década de sessenta; ele é moderadamente persistente em vários tipos de solos do Brasil. O objetivo deste estudo foi isolar - de um solo agrícola contaminado por quatro décadas - e caracterizar bactérias resistentes a TFL, determinar suas habilidades em degradar a TFL, investigar a presença de gens degardadores que possam estar envolvidos na degradação da TFL e propor um método de ensino teórico prático sobre a biodegradação, para cursos de graduação. Oito bactérias foram isoladas, pela técnica de subculturas repetidas em meio contendo TFL como única fonte de carbono, e identificadas, pelo método bioquímico e seqüenciamento do rDNA 16S como Klebsiella oxytoca, Herbaspirillum seropedicae, 3 strains of Bacillus simplex, 2 de Pseudomonas montelli e uma outra Pseudomonas sp. Uma terceira bactéria (iaolado #9), não identificada, que crescia ao redor de cristais de TFL em meio sólido, foi isolada; esta é uma técnica nova que poderá ser útil no isolamento de bactérias que são resistentes a outros compostos pouco solúveis em água. Todas as bactérias isoladas foram submetidas ao teste de biodegradação, em um meio contendo sais minerais, 0,1% succinato, 0,1 % de extrato de leveduras e 50 mg. L-1 de TFL Cinco bactérias reduziram a concentração de TFL no meio, após trinta dias de incubação: Klebsiella oxytoca (24,6 %), Herbaspirillum seropedicae (16,4 %), Bacillus simplex 2 (25.0 %), Bacillus simplex 3 (16.0 %) e isolado 9 (21.0 %). Uma bactéria conhecida como degradadora da TFL, Brevundimonas diminuta (NCIMB 10329) degradou a TFL, neste meio, de maneira semelhantes ao das bactérias isoladas. Os DNAs extraídos das quatro bactérias identificadas degradadoras da TFL, foram sondados para os gens catbólicos ndoB, todC, xylX, catA e xylE, os quais codificam as enzimas naftaleno 1,2-dioxigenase, toluene dioxigenase, toluate 1,2-dioxigenase, catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase, respectivamente. Técnicas de PCR e hibridização demonstraram que os DNAs de todas estas quatro bactérias foram fortemente hibridizadas para o gen ndoB, contudo, usando a técnica de ¨zonas claras¨, observou-se que nenhuma delas degradou naftaleno. Estes resultados indicam a presença de gens dioxigenases, nestas bactérias degradadoras da TFL, que poderiam estar transformando a TFL como substrato principal, ou como cometabolismo. O conhecimento sobre processos de biodegradação é necessário para os graduados dos cursos de agronomia, química, biologia, tecnologia de alimentos, etc. Neste trabalho, também, propomos o estudo teórico e prático da compostagem o qual estimula o interesse dos estudantes em aprender sobre o metabolismo envolvido neste, e em outros, processos biotecnológicos.

Níveis de lipoproteínas e apolipoproteínas em uma amostra de indivíduos descendentes de Japoneses da região de Cascavel (PR)

Dislipidemia são alterações nas concentrações dos lipídios no organismo, e são divididos em hipo e hiperlipidemias. As hiperlipidemias possuem maior importância clínica, frequentemente associadas com um aumento no risco em desenvolver outras doenças, como doenças coronarianas, pancreatites, etc. Altas concentrações dos lipídios plasmáticos, principalmente colesterol total, estão associados com doenças coronarianas. Altos níveis de triglicerídios e baixos níveis de HDL-colesterol, também são fatores que predispõem a doenças cardiovasculares. Os níveis de triglicerídios podem ter várias causas: como a dieta ou alterações relacionadas ao metabolismo lipídico. Este estudo foi composto por 96 indivíduos descendentes de japoneses residindo no Sul do Brasil (Cascavel-PR). O objetivo deste trabalho foi analisar alterações nos lipídios plasmáticos em uma população específica – indivíduos descendentes de japoneses residentes na região de Cascavel (PR) . Foram determinados os níveis de triglicerídios, colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, VLDL-colesterol, apolipoproteína A-I e B e o padrão eletroforético de lipoproteínas em 96 indivíduos japoneses entre 10 a 89 anos. Para os níveis de triglicerídios, 18,7% dos indivíduos descendentes de japoneses obtiveram valores acima de 200 mg/dL.. Quando relacionamos os níveis de colesterol total, 69,7% dos indivíduos descendentes de japoneses possuem níveis acima da normalidade. Observamos dois padrões eletroforéticos de lipoproteínas na população japonesa; 10,4% desses indivíduos obtiveram alterações na banda pré-beta relacionada ao VLDL-colesterol e 8,3% obtiveram alterações nas bandas da origem (Quilomicra) e na banda pré-beta.

Efeito in vitro dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre alguns parâmetros do sistema glutamatérgico em córtex cerebral de ratos e em astrócitos cultivados de córtex de ratos

A acidemia glutárica tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva que se caracteriza bioquimicamente pela deficiência da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase da rota de degradação dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofânio. O bloqueio da rota na conversão de glutaril-CoA à crotonil-CoA e resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico e, em alguns casos, do ácido glutacônico. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos especialmente após crises encefalopáticas, comuns no primeiro ano de vida, em que ocorre necrose bilateral dos gânglios da base, degeneração do globo pálido e da substância branca. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na AG I é pouco conhecida e que as lesões do SNC dos pacientes muito se assemelham às lesões devido à excitotoxicidade, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre alguns parâmetros neuroquímicos envolvendo o sistema glutamatérgico em córtex cerebral e astrócitos cultivados de córtex cerebral de ratos. Alguns desses parâmetros já haviam sido testados previamente com o ácido glutárico. Observamos que o ácido 3-hidroxiglutárico, em concentrações de 10 µM a 1 mM, não alterou a captação de L-[3H]glutamato por preparações sinaptossomais. Verificamos também que os ácidos glutárico e 3- hidroxiglutárico, nas mesmas concentrações, não alteraram a liberação do L- [3H]glutamato por estas estruturas em condições basais ou estimuladas (despolarizadas) por potássio (20 mM e 40 mM). Já nos ensaios de união do L- [3H] glutamato a membranas plasmáticas, o ácido 3-hidroxiglutárico inibiu a união do neurotransmissor em meio de incubação sem sódio e cloreto (sítios receptores), quando em baixas concentrações (1 µM a 100 µM), enquanto não alterou esta união em altas concentrações (500 µM a 2 mM). Na presença de alto sódio (sítios transportadores), ambos os ácidos inibiram a união de L- [3H]glutamato em todas as concentrações testadas (10 µM a 1 mM). Outros experimentos demonstraram que o ácido 3-hidroxiglutárico não alterou a captação vesicular de L-[3H]glutamato. Avaliamos também a influência dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre a captação de L-[3H]glutamato por astrócitos cultivados de córtex cerebral. Inicialmente verificamos a viabilidade destas células na presença dos ácidos pelo teste do MTT que reflete a atividade das desidrogenases mitocondriais e também pela liberação de lactato desidrogenase para o meio de incubação. Na concentração de 1 mM , os ácidos glutárico e 3- hidroxiglutárico não se mostraram citotóxicos para estas células. Por outro lado, quando incubados por 60 minutos, nas concentrações de 50 µM e 1mM, aumentaram significativamente a captação de L-[3H]glutamato pelos astrócitos.

Efeito dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus cetoácidos sobre a atividade da creatinaquinase de cérebros de ratos jovens

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

Utilização de nutrientes energéticos por córtex cerebral de ratos : efeitos de diferentes concentrações de potássio

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Expressão das iodotironinas desiodases tipos I e II em diferentes tecidos de camundongos normais e com deficiência inata para a desiodase tipo I

Duas enzimas, as iodotironinas desiodases tipos I e II (D1 e D2), catalizam a reação de 5’ desiodação do T4 promovendo a formação do hormônio tireoidiano ativo, T3. A D1, principal fonte de T3 circulante no plasma, esta presente no fígado, rim e tireóide. Até recentemente, acreditava-se que a expressão da D2 estivesse restrita a tecidos nos quais a concentração intracelular de T3 desempenha um papel crítico como na hipófise, sistema nervoso central e tecido adiposo marrom (TAM). Estes conceitos foram estabelecidos com base em estudos de atividade enzimática em homogenados de tecidos de ratos. A recente clonagem dos cDNAs da D1 e D2, de ratos e humanos, forneceu novos meios para a avaliação da distribuição tecidual e dos mecanismos que regulam a expressão dos genes destas enzimas. Estudos anteriores demonstraram que altos níveis de mRNA da D2 são encontrados na tireóide e músculos cardíaco e esquelético em humanos, entretanto este mesmo padrão não foi observado em ratos. Os hormônios tireoidianos tem um efeito direto sobre as desiodases, regulando a ação dessas enzimas de maneira tecido-específica. Estudos prévios demonstraram que elevados níveis de T4 reduzem à metade a atividade da D2 no cérebro e hipófise dos camundongos C3H/HeJ (C3H), linhagem de camundongos que apresenta uma deficiência inata da D1 compensada com o aumento dos níveis séricos de T4 que, nestes animais, são aproximadamente o dobro daqueles observados nos camundongos normais, C57BL/6J (C57). No presente trabalho, utilizamos a técnica da PCR a partir da transcrição reversa (RT-PCR) para determinar o padrão de expressão do mRNA da D1 e D2 em diferentes tecidos de camundongos e avaliar sua regulação pelos hormônios tireoidianos. Investigamos, também, os níveis de mRNA da D2 em diferentes tecidos de camundongos normais e com deficiência inata da D1 para avaliarmos o mecanismo pelo qual o T4 regula a atividade da D2 nos animais deficientes. Nossos resultados demonstraram, como esperado, que altos níveis de mRNA da D1 estão presentes no fígado e rim e em menores quantidades no testículo e hipófise. Detectamos mRNA da D2, predominantemente, no TAM, cérebro, cerebelo, hipófise e testículo. Níveis mais baixos de expressão foram detectados, também, no coração. O tratamento com T3 reduziu, significativamente, a expressão da D2 no TAM e coração, mas não no cérebro e testículo. Por outro lado, os níveis de mRNA da D2 aumentaram, significativamente, no testículo de camundongos hipotireoideos. Transcritos da D2 foram identificados no cérebro, cerebelo, hipófise, TAM, testículo e, em menores quantidades, no coração em ambas as linhagems de camundongos, C57 e C3H. Entretanto, ao contrário da atividade, nenhuma alteração significativa nos níveis basais de expressão do mRNA da D2 foi detectada nos tecidos dos camundongos deficientes. O tratamento com T3 reduziu de forma similar, os níveis de mRNA da D2 no TAM e coração em ambos os grupos de animais. Em conclusão, nossos resultados demonstraram que o mRNA da D2 se expressa de forma ampla em diferentes tecidos de camundongos, apresentando um padrão de expressão similar ao descrito em ratos. A co-expressão da D1 e D2 no testículo sugere um papel importante dessas enzimas no controle homeostático do hormônio tireoidiano neste órgão. Demonstramos, também, que a deficiência da D1 não altera os níveis basais de expressão do mRNA da D2 nos camundongos C3H, confirmando que o T4 atua ao nível pós-transcricional na regulação da atividade da D2 nestes animais. Além disso, o T3 age de forma tecido-específica e tem efeito similar sobre a regulação pré-transcricional do gene da D2 em ambas as linhagens de camundongos.

Avaliação do estresse oxidativo em indivíduos submetidos a diferentes intensidades de exercicio em esteira rolante

O exercício físico está relacionado com a formação de radicais livres e com a adaptação do sistema antioxidante. O objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros oxidativos e antioxidantes após três sessões independentes de exercício agudo em esteira rolante, em três intensidades diferentes, determinadas a partir dos limiares ventilatórios e consumo máximo de oxigênio, obtidos em um teste de potência aeróbia máxima. Dezessete indivíduos do sexo masculino com idade entre 20 e 30 anos divididos em dois grupos; oito triatletas, compondo o grupo treinado, e nove estudantes de educação física, compondo o grupo não treinado. As amostras sangüíneas foram coletadas antes e imediatamente após o exercício para determinação da quimiluminescência, da capacidade antioxidante total plasmática (TRAP) e da atividade eritrocitária das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Foram observados um efeito do exercício sobre a capacidade antioxidante total, que se apresentou aumentada após o exercício (p<0,05) e um efeito do estado de condicionamento físico sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase, que se apresentou maior nos indivíduos treinados (p<0,05). Houve redução da quimiluminescência após o exercício em alta intensidade no grupo treinado (p<0,05). A enzima superóxido dismutase se apresentou elevada após o exercício nas intensidades baixa e média no grupo não treinado (p<0,05). Não foram encontradas mudanças na atividade da enzima catalase.