Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Role of the Protein Tyrosine Kinase 7 gene in human neural tube defects

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations.

Rôles de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans l'angiogenèse, la perméabilité vasculaire et la progression tumorale

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

Kinetic Parameters of Thymidine Kinase and DNA Synthesis During Liver Regeneration: Role Ofthyroid Hormones

The role of thyroid hormones in DNA synthesis and in the activity of Thymidille kinase (TK), a key regulatory enzyme of DNA synthesis was studied in proliferating hepatocytes in vivo. Liver regeneration after partial hepatectomy was used as a model for controlled cell division in rats having different thyroid status - euthyroid, hypothyroid and 3,3',5'-triiodo-L-thyronine (T))-heated hypothyroid. Partial hepatectomy caused a significant elevation of DNA synthesis (p<0.01) in all the three groups compared to their sham-operated counterparts. Hypothyroid liepatectomised animals showed significantly lower (p<0.01) level of DNA synthesis than euthyroid hepatectomised animals. A single subcutaneous close of 1'3 to hypothyroid shamoperated animals resulted in a significant increase (p<0.01) of DNA synthesis in the intact liver. 17tis was comparable to the level of DNA synthesis occurring in regenerating liver of euthyroid animals. In hypothyroid hepatectomised animals, "1'3 showed an additive effect on l)NA synthesis and this group exhibited maximum level of DNA synthesis (p<0.0I ). Studies of the kinetic parameters of TK show that the Michelis-Menten constant, (K111) of TK for thymidine was altered by the thyroid status. K11 increased significantly (p<0.01) in untreated hypothyroid animals when compared to the euthyroid rats. '13 treatment of hypothyroid animals reversed this effect and this group showed the lowest value for K111 (p<0.01). Thus our results indicate that thyroid hormones can influence DNA synthesis during liver regeneration and they may regulate the activity of enzymes such as 17rymidine kinase which are important for DNA synthesis and hence cell division.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.

An update of the mechanisms of resistance to EGFR-tyrosine kinase inhibitors in breast cancer: gefitinib (Iressatrade mark)-induced changes in the expression and nucleo-cytoplasmic trafficking of HER-ligands (Review)

Intrinsic resistance to the epidermal growth factor receptor (EGFR; HER1) tyrosine kinase inhibitor (TKI) gefitinib, and more generally to EGFR TKIs, is a common phenomenon in breast cancer. The availability of molecular criteria for predicting sensitivity to EGFR-TKIs is, therefore, the most relevant issue for their correct use and for planning future research. Though it appears that in non-small-cell lung cancer (NSCLC) response to gefitinib is directly related to the occurrence of specific mutations in the EGFR TK domain, breast cancer patients cannot be selected for treatment with gefitinib on the same basis as such EGFR mutations have been reported neither in primary breast carcinomas nor in several breast cancer cell lines. Alternatively, there is a general agreement on the hypothesis that the occurrence of molecular alterations that activate transduction pathways downstream of EGFR (i.e., MEK1/MEK2 - ERK1/2 MAPK and PI-3'K - AKT growth/survival signaling cascades) significantly affect the response to EGFR TKIs in breast carcinomas. However, there are no studies so far addressing a role of EGF-related ligands as intrinsic breast cancer cell modulators of EGFR TKI efficacy. We recently monitored gene expression profiles and sub-cellular localization of HER-1/-2/-3/-4 related ligands (i.e., EGF, amphiregulin, transforming growth factor-α, ß-cellulin, epiregulin and neuregulins) prior to and after gefitinib treatment in a panel of human breast cancer cell lines. First, gefitinibinduced changes in the endogenous levels of EGF-related ligands correlated with the natural degree of breast cancer cell sensitivity to gefitinib. While breast cancer cells intrinsically resistant to gefitinib (IC50 ≥15 μM) markedly up-regulated (up to 600 times) the expression of genes codifying for HERspecific ligands, a significant down-regulation (up to 106 times) of HER ligand gene transcription was found in breast cancer cells intrinsically sensitive to gefitinib (IC50 ≤1 μM). Second, loss of HER1 function differentially regulated the nuclear trafficking of HER-related ligands. While gefitinib treatment induced an active import and nuclear accumulation of the HER ligand NRG in intrinsically gefitinib-resistant breast cancer cells, an active export and nuclear loss of NRG was observed in intrinsically gefitinib-sensitive breast cancer cells. In summary, through in vitro and pharmacodynamic studies we have learned that, besides mutations in the HER1 gene, oncogenic changes downstream of HER1 are the key players regulating gefitinib efficacy in breast cancer cells. It now appears that pharmacological inhibition of HER1 function also leads to striking changes in both the gene expression and the nucleo-cytoplasmic trafficking of HER-specific ligands, and that this response correlates with the intrinsic degree of breast cancer sensitivity to the EGFR TKI gefitinib. The relevance of this previously unrecognized intracrine feedback to gefitinib warrants further studies as cancer cells could bypass the antiproliferative effects of HER1-targeted therapeutics without a need for the overexpression and/or activation of other HER family members and/or the activation of HER-driven downstream signaling cascades

The four major N- and C-terminal splice variants of the excitatory amino acid transporter GLT-1 form cell surface homomeric and heteromeric assemblies

The L-glutamate transporter GLT-1 is an abundant CNS membrane protein of the excitatory amino acid transporter (EAAT) family which controls extracellular L-glutamate levels and is important in limiting excitotoxic neuronal death. Using RT-PCR, we have determined that four mRNAs encoding GLT-1 exist in mouse brain, with the potential to encode four GLT-1 isoforms that differ in their N- and C-termini. We expressed all four isoforms (termed MAST-KREK, MPK-KREK, MAST-DIETCI and MPK-DIETCI according to amino acid sequence) in a range of cell lines and primary astrocytes and show that each isoform can reach the cell surface. In transfected HEK-293 or COS-7 cells, all four isoforms support high-affinity sodium-dependent L-glutamate uptake with identical pharmacological and kinetic properties. Inserting a viral epitope (V5, HA or FLAG) into the second extracellular domain of each isoform allowed co-immunoprecipitation and tr-FRET studies using transfected HEK-293 cells. Here we show for the first time that each of the four isoforms are able to combine to form homomeric and heteromeric assemblies, each of which are expressed at the cell surface of primary astrocytes. After activation of protein kinase C by phorbol ester, V5-tagged GLT-1 is rapidly removed from the cell surface of HEK-293 cells and degraded. This study provides direct biochemical evidence for oligomeric assembly of GLT-1 and reports the development of novel tools to provide insight into the trafficking of GLT-1.

Modeling chemotaxis reveals the role of reversed phosphotransfer and a bi-functional kinase-phosphatase

Understanding how multiple signals are integrated in living cells to produce a balanced response is a major challenge in biology. Two-component signal transduction pathways, such as bacterial chemotaxis, comprise histidine protein kinases (HPKs) and response regulators (RRs). These are used to sense and respond to changes in the environment. Rhodobacter sphaeroides has a complex chemosensory network with two signaling clusters, each containing a HPK, CheA. Here we demonstrate, using a mathematical model, how the outputs of the two signaling clusters may be integrated. We use our mathematical model supported by experimental data to predict that: (1) the main RR controlling flagellar rotation, CheY6, aided by its specific phosphatase, the bifunctional kinase CheA3, acts as a phosphate sink for the other RRs; and (2) a phosphorelay pathway involving CheB2 connects the cytoplasmic cluster kinase CheA3 with the polar localised kinase CheA2, and allows CheA3-P to phosphorylate non-cognate chemotaxis RRs. These two mechanisms enable the bifunctional kinase/phosphatase activity of CheA3 to integrate and tune the sensory output of each signaling cluster to produce a balanced response. The signal integration mechanisms identified here may be widely used by other bacteria, since like R. sphaeroides, over 50% of chemotactic bacteria have multiple cheA homologues and need to integrate signals from different sources.

Syk-Dependent Cytokine Induction by Dectin-1 Reveals a Novel Pattern Recognition Pathway for C Type Lectins

Pattern-recognition receptors (PRRs) detect molecular signatures of microbes and initiate immune responses to infection. Prototypical PRRs such as Toll-like receptors (TLRs) signal via a conserved pathway to induce innate response genes. In contrast, the signaling pathways engaged by other classes of putative PRRs remain ill defined. Here, we demonstrate that the β-glucan receptor Dectin-1, a yeast binding C type lectin known to synergize with TLR2 to induce TNFα and IL-12, can also promote synthesis of IL-2 and IL-10 through phosphorylation of the membrane proximal tyrosine in the cytoplasmic domain and recruitment of Syk kinase. syk−/− dendritic cells (DCs) do not make IL-10 or IL-2 upon yeast stimulation but produce IL-12, indicating that the Dectin-1/Syk and Dectin-1/TLR2 pathways can operate independently. These results identify a novel signaling pathway involved in pattern recognition by C type lectins and suggest a potential role for Syk kinase in regulation of innate immunity.

Phosphoinositide (PI) 3-kinase assays

The regulation of phosphoinositide (PI) 3-kinase activities has been linked to many normal and disease-related processes, including cell survival, cell growth and proliferation, cell differentiation, cell motility, and intracellular vesicle trafficking. However, as the family of enzymes has now grown to include eight true members, in three functional classes, plus several related protein kinases that are also inhibited by the widely used PI 3-kinase selective inhibitors, wortmannin and LY294002, extended methodologies are required to identify which type of kinase is involved in a particular cellular process, or protein complex, under study. A robust in vitro PI 3-kinase assay, suitable for use with immunoprecipitates, or purified proteins, is described here together with a series of modifications of substrate and assay conditions that will aid researchers in the identification of the particular class and isoform of PI 3-kinase that is involved in a signaling process under investigation.

A dual role for integrin-linked kinase in platelets: regulating integrin function and alpha-granule secretion

Integrin-linked kinase (ILK) has been implicated in the regulation of a range of fundamental biological processes such as cell survival, growth, differentiation, and adhesion. In platelets ILK associates with beta 1- and beta 3-containing integrins, which are of paramount importance for the function of platelets. Upon stimulation of platelets this association with the integrins is increased and ILK kinase activity is up-regulated, suggesting that ILK may be important for the coordination of platelet responses. In this study a conditional knockout mouse model was developed to examine the role of ILK in platelets. The ILK-deficient mice showed an increased bleeding time and volume, and despite normal ultrastructure the function of ILK-deficient platelets was decreased significantly. This included reduced aggregation, fibrinogen binding, and thrombus formation under arterial flow conditions. Furthermore, although early collagen stimulated signaling such as PLC gamma 2 phosphorylation and calcium mobilization were unaffected in ILK-deficient platelets, a selective defect in alpha-granule, but not dense-granule, secretion was observed. These results indicate that as well as involvement in the control of integrin affinity, ILK is required for alpha-granule secretion and therefore may play a central role in the regulation of platelet function. (Blood. 2008; 112: 4523-4531)

Induction of heme oxygenase 1 by moderately oxidized low-density lipoproteins in human vascular smooth muscle cells: role of mitogen-activated protein kinases and Nrf2

Oxidized low-density lipoproteins (LDL) play a central role in atherogenesis and induce expression of the antioxidant stress protein heme oxygenase 1 (HO-1). In the present study we investigated induction of HO-1 and adaptive increases in reduced glutathione (GSH) in human aortic smooth muscle cells (SMC) in response to moderately oxidized LDL (moxLDL, 100 mu g protein/ml, 24 h), a species containing high levels of lipid hydroperoxides. Expression and activity of HO-1 and GSH levels were elevated to a greater extent by moxLDL than highly oxidized LDL but unaffected by native or acetylated LDL. Inhibitors of protein kinase C (PKC) or mitogen-activated protein kinases (MAPK) p38(MAPK) and MEK or c-jun-NH2-terminal kinase (JNK) significantly attenuated induction of HO-1. Phosphorylation of p38(MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2), or JNK and nuclear translocation of the transcription factor Nrf2 were enhanced following acute exposure of SMC to rnoxLDL (100 mu g proteiri/ml, 1-2 h). Pretreatment of SMC with the antioxidant vitamin C (100 mu M, 24 h) attenuated the induction of HO-1 by moxLDL. Native and oxidized LDL did not alter basal levels of intracellular ATP, mitochondrial dehydrogenase activity, or expression of the lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1) in SMC. These findings demonstrate for the first time that activation of PKC, p38(MAPK), JNK, ERK1/2, and Nrf2 by oxidized LDL in human SMC leads to HO-1 induction, constituting an adaptive response against oxidative injury that can be ameliorated by vitamin C. (C) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.