Constitutively active mutants of the alpha 1B-adrenergic receptor: role of highly conserved polar amino acids in receptor activation.

Site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulations of the alpha 1B-adrenergic receptor (AR) were combined to explore the potential molecular changes correlated with the transition from R (inactive state) to R (active state). Using molecular dynamics analysis we compared the structural/dynamic features of constitutively active mutants with those of the wild type and of an inactive alpha 1B-AR to build a theoretical model which defines the essential features of R and R. The results of site-directed mutagenesis were in striking agreement with the predictions of the model supporting the following hypothesis. (i) The equilibrium between R and R depends on the equilibrium between the deprotonated and protonated forms, respectively, of D142 of the DRY motif. In fact, replacement of D142 with alanine confers high constitutive activity to the alpha 1B-AR. (ii) The shift of R143 of the DRY sequence out of a conserved 'polar pocket' formed by N63, D91, N344 and Y348 is a feature common to all the active structures, suggesting that the role of R143 is fundamental for mediating receptor activation. Disruption of these intramolecular interactions by replacing N63 with alanine constitutively activates the alpha 1B-AR. Our findings might provide interesting generalities about the activation process of G protein-coupled receptors.

Synthetic RGD-containing alpha-helical coiled coil peptides promote integrin-dependent cell adhesion.

Integrin receptors are the main mediators of cell adhesion to the extracellular matrix. They bind to their ligands by interacting with short amino acid sequences, such as the RGD sequence. Soluble, small RGD-based peptides have been used to block integrin-binding to ligands, thereby interfering with cell adhesion, migration and survival, while substrate-immobilized RGD sequences have been used to enhance cell binding to artificial surfaces. This approach has several important medical applications, e.g. in suppression of tumor angiogenesis or stimulation of bone formation around implants. However, the relatively weak affinity of short RGD-containing peptides often results in incomplete integrin inhibition or ineffective ligation. In this work, we designed and synthesized several new multivalent RGD-containing molecules and tested their ability to inhibit or to promote integrin-dependent cell adhesion when used in solution or immobilized on substrates, respectively. These molecules consist of an oligomeric structure formed by alpha-helical coiled coil peptides fused at their amino-terminal ends with an RGD-containing fragment. When immobilized on a substrate, these peptides specifically promoted integrin alphaVbeta3-dependent cell adhesion, but when used in solution, they blocked alphaVbeta3-dependent cell adhesion to the natural substrates fibronectin and vitronectin. One of the peptides was nearly 10-fold more efficient than fibronectin or vitronectin in promoting cell adhesion, and almost 100-fold more efficient than a linear RGD tripeptide in blocking adhesion. These results indicate that alpha-helical coiled coil peptides carrying an amino-terminal RGD motif can be used as soluble antagonists or surface-immobilized agonists to efficiently inhibit or promote integrin alphaVbeta3-mediated cell adhesion, respectively.

Ezrin directly interacts with the alpha1b-adrenergic receptor and plays a role in receptor recycling.

Using the yeast two-hybrid system, we identified ezrin as a protein interacting with the C-tail of the alpha1b-adrenergic receptor (AR). The interaction was shown to occur in vitro between the receptor C-tail and the N-terminal portion of ezrin, or Four-point-one ERM (FERM) domain. The alpha1b-AR/ezrin interaction occurred inside the cells as shown by the finding that the transfected alpha1b-AR and FERM domain or ezrin could be coimmunoprecipitated from human embryonic kidney 293 cell extracts. Mutational analysis of the alpha1b-AR revealed that the binding site for ezrin involves a stretch of at least four arginines on the receptor C-tail. The results from both receptor biotinylation and immunofluorescence experiments indicated that the FERM domain impaired alpha1b-AR recycling to the plasma membrane without affecting receptor internalization. The dominant negative effect of the FERM domain, which relies on its ability to mask the ezrin binding site for actin, was mimicked by treatment of cells with cytochalasin D, an actin depolymerizing agent. A receptor mutant (DeltaR8) lacking its binding site in the C-tail for ezrin displayed delayed receptor recycling. These findings identify ezrin as a new protein directly interacting with a G protein-coupled receptor and demonstrate the direct implication of ezrin in GPCR trafficking via an actin-dependent mechanism.

Lentiviral vectors: a powerful tool to target astrocytes in vivo.

The morphological and functional diversity of astrocytes, and their essential contribution in physiological and pathological conditions, are starting to emerge. However, experimental systems to investigate neuron-glia interactions and develop innovative approaches for the treatment of central nervous system (CNS) disorders are still very limited. Fluorescent reporter genes have been used to visualize populations of astrocytes and produce an atlas of gene expression in the brain. Knock-down or knock-out of astrocytic proteins using transgenesis have also been developed, but these techniques remain complex and time-consuming. Viral vectors have been developed to overexpress or silence genes of interest as they can be used for both in vitro and in vivo studies in adult mammalian species. In most cases, high transduction efficiency and long-term transgene expression are observed in neurons but there is limited expression in astrocytes. Several strategies have been developed to shift the tropism of lentiviral vectors (LV) and allow local and controlled gene expression in glial cells. In this review, we describe how modifications of the interaction between the LV envelope glycoprotein and the surface receptor molecules on target cells, or the integration of cell-specific promoters and miRNA post-transcriptional regulatory elements have been used to selectively express transgenes in astrocytes.

Molecular and cellular analysis of genodermatoses

Summary Skin is the essential interface between our body and its environment; not only does it prevent water loss and protect us from external insults it also plays an essential role in the central nervous system acting as a major sense organ primarily for touch and pain. The main cell type present in skin, keratinocyte, undergoes a differentiation process leading to the formation of this protecting barrier. This work is intended to contribute to the understanding of how keratinocyte differentiates and skin functions. To do this, we studied two genetic skin diseases: Erythrokeratodermia variabilis and Mal de Meleda. Our approach was to examine the expression and localization of proteins implicated in these two pathologies in normal and diseased tissues and to determine the influence of mutant proteins at the molecular and cellular levels. Connexins are major components of gap junctions, channels allowing direct communication between cells. Our laboratory has identified mutations in both connexin 30.3 (Cx30.3) and 31 (Cx31) to be causally involved in erythrokeratodermia variabilis (EKV), an autosomal dominant disorder of keratinization. In the first chapter, we show a new mutation of Cx31, L209P-Cx31, in 3 EKV patients, extending the field of EKV-causing mutations although the mechanism by which connexin mutations lead to the disease is unclear. In the second chapter, we studied the effect of F137L-Cx30.3 on expression, trafficking and localization of cotransfected Cx31 and Cx30.3 in connexin-deficient HeLa cells. The F137 amino acid, highly conserved in connexin family, is oriented towards the channel pore and F137L mutation in either Cx30.3 or Cx31 lead to EKV. As two genes can lead to EKV when mutated, our hypothesis was that Cx31 and Cx30.3 might cooperate at a molecular level. We were able to demonstrate a physical interaction between Cx31 and Cx30.3. The presence of F137L-Cx30.3 disturbed the trafficking of both connexins, less connexins were integrated into gap junctions and thus, the coupling between cell was diminished. Connexins formed in the presence of F137L-Cx30.3 are degraded at their exit from the endoplasmic reticulum. In conclusion, our results indicate that the genetic heterogeneity of EKV is due to mutations in two interacting proteins. F137L-Cx30.3 has a dominant negative effect and affects Cx31, disturbing cellular communication in epidermal cells. Mal de Meleda is an autosomal recessive inflammatory and a keratotic palmoplantar skin disorder due to mutations in SLURP1 (secreted LY6/PLAUR-related protein 1). SLURP1 belongs to the LY6/PLAUR family of proteins and has the particularity of being secreted instead of being GPI-anchored. The high degree of structural similarity between SLURP1 and the three fingers motif of snake neurotoxins and LYNX 1-C suggests that this protein could interact with the neuronal acetylcholine receptors. In the third chapter, we show that SLURP1 potentiates responses of the a7 nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) to acetylcholine. These results identify SLURP1 as a secreted epidermal neuromodulator that is likely to be essential for palmoplantar skin. In the fourth chapter, we show that SLURP1 is expressed in the granular layer of the epidermis but is absent from skin biopsies of Mal de Meleda patients. SLURP1 is also present in secretions such as sweat, tears or saliva. An in vitro analysis on two mutant of SLURP-I demonstrates that W15R-SLURP1 is absent in cells while G86R-SLURP1 is expressed and secreted, suggesting that SLURP1 can lead to the disease by either an absent or an abnormal protein. Finally, in the fifth chapter, we analyse the expression and biological properties of other LY6/PLAUR members, clustered around SLURP] on chromosome 8. Their GPI-anchored or secreted status were analysed in vitro. SLURP1, LYNX1-A and -B are secreted while LYPDC2 and LYNX 1-C are GPI anchored. Three of these proteins are expressed in the epidermis and in cultured keratinocytes. These results suggest that these LY6/PLAUR members may have an important role in skin homeostasis. Résumé Résumé La peau est la barrière essentielle entre notre corps et l'environnement, nous protégeant des agressions extérieures, de la déshydratation et assurant aussi un rôle dans le système nerveux central en tant qu'organe du toucher et de la douleur. Le principal type de cellules présent dans la peau est le kératinocyte qui suit un processus de différenciation aboutissant à la formation de cette barrière protectrice. Ce travail est destiné à comprendre la différenciation des kératinocytes et le fonctionnement de la peau. Pour cela, nous avons étudié deux maladies génodermatoses : l'Erthrokeratodermia Variabilis (EKV) et le Mal de Meleda. Nous avons examiné l'expression et la localisation des protéines impliquées dans ces deux pathologies dans des tissus normaux et malades puis déterminé l'influence des protéines mutantes aux niveaux moléculaires et cellulaires. Les connexines (Cx) sont les composants majeurs des jonctions communicantes, canaux permettant la communication directe entre les cellules. Notre laboratoire a identifié des mutations dans les Cx30.3 et Cx31 comme responsables de l'EKV, génodermatose de transmission autosomique dominante. Dans le ler chapitre, nous décrivons une nouvelle mutation de Cx31, L209-Cx31, et contribuons à l'établissement du catalogue des mutations de Cx31 entraînant cette maladie. Cependant, le mécanisme par lequel les mutations de Cx31 et C3x0.3 provoquent l'EKV est inconnu. Dans le 2ème chapitre, nous étudions les effets de la mutation F137L-Cx30.3 sur l'expression, le trafic et la localisation des Cx31 et Cx30.3 transfectées dans des cellules HeLa, déficientes en connexines. Comme deux gènes peuvent causer une EKV quand ils sont mutés, notre hypothèse était que Cx31 et Cx30.3 pourraient coopérer au niveau moléculaire. Nous avons montré l'existence d'une interaction physique entre ces deux connexines. La présence de la mutation F137L-Cx30.3 perturbe le trafic des deux connexines, moins de connexines sont intégrées dans les jonctions communicantes et donc le couplage entre les cellules est diminué. Les connexons formés en présence de cette mutation sont dégradés à leur sortie du réticulum endoplasmique. En conclusion, nos résultats indiquent que l'hétérogénéité génétique de EKV est due à des mutations dans deux protéines qui interagissent. F137L-Cx30.3 a un effet dominant négatif et affecte Cx31, perturbant la communication entre les cellules épidermiques. Le Mal de Meleda est une maladie récessive de la peau palmoplantaire due à des mutations dans SLURP1. SLURP1 appartient à la famille des protéines contenant un domaine LY6/PLAUR et a la particularité d'être sécrétée. La grande homologie de structure existant entre SLURP1, les neurotoxines de serpent et LYNX1-C suggère que la protéine pourrait interagir avec des récepteurs à acétylcholine (Ach). Dans le 3ème chapitre, nous montrons que SLURP1 module la réponse à l'Ach du récepteur nicotinique α7. Ces résultats identifient SLURP1 comme un neuromodulateur épidermique sécrété, probablement essentiel pour la peau palmoplantaire. Dans le 4ème chapitre, nous montrons que SLURP1 est exprimé dans la couche granuleuse de l'épiderme et qu'il est absent des biopsies des patients. SLURP1 a aussi été détecté dans des sécrétions telles que la sueur, les lamies et la salive. Une analyse in vitro de deux mutants de SLURP1 a montré que W15R-SLURP1 est absent des cellules tandis que G86R-SLURP1 est exprimé et sécrété, suggérant qu'une absence ou une anomalie de SLURP1 peuvent causer la maladie. Finalement, dans le 5ème chapitre, nous analysons l'expression et les propriétés biologiques d'autres membres de la famille LY6/PLAUR localisés autour de SLURP1 sur le chromosome 8. Leur statut de protéines sécrétées ou liées à la membrane par une ancre GPI est analysé in vitro. SLURP1, LYNXI-A et -B sont sécrétées alors que LYPDC2 et LYNX1-C sont liés à la membrane. Trois de ces protéines sont exprimées dans l'épiderme et dans des kératinocytes cultivés. Ces résultats suggèrent que la famille LY6/PLAUR pourrait avoir un rôle important dans l'homéostasie de la peau.

Lorraine VII : Correspondance de René II duc de Lorraine et de Philippa de Gueldres, sa seconde femme avec le Conseil de Lorraine (1485-1502), correspondance diplomatique et missives d'officiers de Lorraine.

Contient : Dette de René II duc de Lorraine envers Girardin Boucher et procès ; Obligation de René II duc de Lorraine pour Louis Merlin son conseiller, qui s'est engagé envers Girardin Boucher pour de la vaisselle d'or et d'argent que le duc destinait à Philippa de Gueldres ; Obligation de René II duc de Lorraine envers Girardin Boucher, bourgeois de Paris, pour un prêt ; Quittances de maître Girardin Boucher pour René II duc de Lorraine, dans l'ordre inverse de la chronologie ; Lettre de Jacques d'Estouteville, garde de la prévôté de Paris, comparution de Louis Merlin et Jacques Duprast garants de René II duc de Lorraine, à propos du procès de Girardin Boucher pour la dette du duc, remboursée en « faible monnaie ». L'acte contient la lettre du 2 mars 1485 (cf. f. 3) ; Quittance de Mathieu le Vacher, orfèvre bourgeois de Paris pour Louis Merlin, au nom de René II duc de Lorraine ; Comparution au Châtelet de Paris du procureur des héritiers de Girardin Boucher ; Lettre de Louis XII, arrêt du Parlement dans le procès de Girardin Boucher, en latin ; Lettre de Louis XII, arrêt du Parlement dans le procès de Girardin Boucher, en latin ; Lettre de Nicolas Dupré, receveur : quittance au profit de Louis Merlin et Jacques Duprast après la sentence du prévôt de Paris ; Lettre des gens des Comptes de Bar aux gens des Comptes à Nancy : pour le procès entre Robert II de Sarrebrück et René II duc de Lorraine, ils leur demandent l'original conservé à Nancy des lettres de Louis cardinal duc de Bar donnant le duché à René d'Anjou ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande les originaux des testaments des rois de Sicile et les titres de Joinville pour son oncle Henri de Lorraine évêque de Metz : toutes les archives ont été « pieça transportées à Vaudémont et de là à Nancey avant les guerres de Bourgogne » ; Affaire du moulin de l'abbaye de Clairlieu à Xeuilley ; Registre du conseil de Nancy autorisant l'abbé de Clairlieu et les chapelains de Thélod à réparer un moulin sur le Madon à Xeuilley, contenant la supplique s. d. de l'abbé ; Supplique de Jannot de Bidox seigneur du Pont-Saint-Vincent à René II duc de Lorraine qui proteste contre les travaux entrepris par l'abbé de Clairlieu ; Lettre de René II duc de Lorraine à son conseil à Nancy ordonnant d'annuler l'autorisation des travaux et d'enquêter sur ce moulin ; Missives de René II duc de Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine aux sénéchal de Lorraine, bailli de Nancy et seigneur de Pierrefort : étant à Bar, il leur demande de recevoir les ambassadeurs du Comte Palatin passant par Nancy pour aller en France ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur le docteur Merswin ; Lettre des gens du Conseil de Bar à René II duc de Lorraine : ils lui envoient une copie du contrat de mariage de la reine Marie, à défaut d'avoir trouvé l'original à la Chambre des Comptes ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il faut répondre au docteur Merswin, ambassadeur auprès du roi des Romains et lui envoyer de l'argent ; il faut refuser de s'associer aux attaques du Roi des Romains contre le duc de Gueldres ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : ordre de remettre en état les bombardes ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande de chercher le contrat de mariage de Marie de Blois dans le Trésor (cf. f. 32) ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur l'ambassade du docteur Merswin, Henri de Ramberg et les quatre Commissaires de la police de Nancy ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : négociations avec le seigneur de Clêves bailli de Hainaut sur la terre « d'Ascot » ; Copie d'une lettre du 8 août 1498 de Maximilien d'Autriche à son conseil de Bourgogne sur les plaintes de René II duc de Lorraine à cause des incursions de soldats dans ses pays ; « rôle de ceux qu'il a été avisé d'envoyer aux villes et lieux qui s'ensuivent... » ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur l'ambassade du docteur Merswin, Henri de Ramberg et les quatre Commissaires de la police de Nancy ; Lettre de Maximilien d'Autriche ordonnant à ses troupes de ne pas piller les terres de René II duc de Lorraine, en allemand ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy pour préparer la défense des places du duché ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy ; Instructions de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy ; Lettre à Philippa de Gueldres sur les troupes bourguignonnes qui arrivent en masse dans le pays ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur la haute justice de Moussel-sur-Seille ; Copie et traduction des lettres dimanche du 21 octobre 1498 de Frédéric duc de Saxe à René II duc de Lorraine ; Missive de Philippe le Beau à Phillippa de Gueldres : il lui demande d'inciter René II à délivrer Huin Roynette, de sorte que le Roi des Romains puisse parler à ce dernier ; Lettres missives de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres ; Lettre de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres : il négocie pour faire valoir ses droits sur la Provence et demande à sa femme de réunir les Etats pour payer ses frais de séjour ; Lettre écrite un 20 mars aux Montils sous Blois, de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres ; Lettre écrite un 23 avril aux Montils sous Blois, de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres ; Correspondance de Philippa de Gueldres Toutes ces pièces sont écrites de Bar-le-Duc, sur papier cacheté de cire rouge et portent le seing manuel de Philippa de Gueldres ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy sur la guerre entre France et Empire : il faut envoyer Jacques d'Haraucourt s'informer des mouvements de troupes près de Lure ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle demande à Johannes Lud de traduire un mémoire sur les dommages causés à Châtillon et Lamarche par Colard d'Anglure ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud et au sénéchal de Lorraine : il faut demander à Saint-Nicolas-du-Port de consentir à une aide plus importante ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle leur transmet des lettres de René II ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : le docteur Merwin doit revenir de Fribourg ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : même sujet que f. 58 ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : Jacques d'Haraucourt a obtenu du Roi des Romains Maximilien d'Autriche un mandement qui interdit aux Impériaux de causer des dommages aux pays de René II duc de Lorraine, cf. f. 56 ; Fragment de lettre ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy sur la rencontre prévue entre Louis XII et Maximilien d'Autriche et les risques causés aux pays de René II duc de Lorraine par les mouvements de troupes ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle accorde une lettre de rémission à Demengeot Ravarre du ban d'Epinal ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : il faut envoyer des nobles lorrains pour garder les places du Bassigny. Cf. f. 113 ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : recommandation pour le procureur général de Lorraine porteur d'une lettre de René II duc de Lorraine ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens des Comptes de Nancy : demande de deniers pour René II duc de Lorraine ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy sur la pension de René II duc de Lorraine ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud : il doit rédiger une minute de lettre de non-préjudice pour un prisonnier qu'il faut libérer ; Fragment sur le même sujet que la pièce précédente, peut-être un post-scriptum ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle met en garde contre les troupes du Grand Bertrand qui sont à Faverney et Port-sur-Saône et leur envoie une lettre de ce capitaine ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : René II duc de Lorraine demande des faucons, il faut leur acheter deux cages pour que Hennequoin son fauconnier les lui amène ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle leur demande de faire délivrer le fils de Nicolas des Fours ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy : elle a transmis à René II duc de Lorraine une lettre du docteur Merswin et propose de l'envoyer auprès de Maximilien d'Autriche avec le bailli de l'évêché de Metz ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy : elle transmet une lettre de René II duc de Lorraine qui demande deux sauf-conduits ; Lettre de Philippa de Gueldres au docteur Merswin ou au bailli de l'évêché de Metz (cf. f. 75) ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud : il lui transmet une lettre pour le protonotaire de Savigny ; il faut avertir le Conseil que la ville de Strasbourg entreprend d'imiter la monnaie lorraine ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy elle envoie une lettre de créance pour l'envoyé auprès de Maximilien d'Autriche et fait demander des nouvelles de Claude d'Einvau lieutenant de Saint-Dié ; Lettre de Philippa de Gueldres à Maximilien d'Autriche : elle le supplie d'épargner les possessions de René II duc de Lorraine en France ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : nouvelles diverses ; Lettre de Philippa de Gueldres au sénéchal de Lorraine et à Johannes Lud : elle les convoque instamment ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : dépenses diverses ; Lettre de Philippa de Gueldres au sénéchal de Lorraine et à Johannes Lud : elle a reçu leurs excuses de ne pouvoir venir (cf. f. 82) et évoque le passage des troupes en Bassigny ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle transmet à René II duc de Lorraine les lettres de Jacques de Haraucourt et du docteur Merswin ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy sur les lettres du docteur Merswin et du capitaine d'Arches ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle donne des nouvelles de René II duc de Lorraine et demande si le messager porteur de lettres en allemand pour le duc avait des nouvelles dont elle devait être avertie ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle transmettra leurs lettres à René II duc de Lorraine quand il sera de retour ; Mémoire s. d. (août 1498) pour le docteur Merswin et le bailli de l'évêché de Metz auprès de Maximilien d'Autriche : René II duc de Lorraine n'est en France que pour faire valoir ses droits ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud : elle lui envoie Claude d'Einvau pour qui il doit rédiger ses instructions ; Correspondance de René II duc de Lorraine sans date d'année ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud sur la plainte d'Adam Bayer : Jean Delez a pris sa ville de Boppard ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il le convoque à Château-Salins au sujet des demandes que lui a adressées Guillaume de Thierstein ; Lettre autographe de Huin Roynette à Johannes Lud ; Lettre de Louis XII à René II duc de Lorraine : Maximilien d'Autriche lui a écrit une lettre de bonnes intentions et propose une rencontre à Mouzon ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il faut renforcer la garde des places car Maximilien d'Autriche entre en Lorraine ; Post-scriptum à la lettre précédente ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il faut envoyer quelqu'un pour connaître précisément les mouvements des troupes qui s'introduisent en Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il vient de recevoir des lettres de Maximilien d'Autriche et demande qu'on envoie à Villé deux canonniers et un charpentier ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il a établi des courriers pour être informé du trajet de Maximilien d'Autriche ; Post-scriptum à la lettre précédente : il faut secrètement faire rentrer les vivres dans les villes ; Copie d'une lettre du 21 septembre 1498 de Maximilien d'Autriche à René II duc de Lorraine : il lui demande de rester à Bar pour attendre ses conseillers et lui apporte des oiseaux ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il a lu les lettres du Conseil à Philippa de Gueldres et celles de l'officier de Saint-Hippolyte et va y répondre ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il faut avertir Maximilien d'Autriche par le docteur Merswin qu'il est de retour dans ses pays ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande des documents pour une contestation avec le seigneur de Neufchâtel ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande d'envoyer les clefs des archives à son procureur ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il faut transmettre une lettre au conseil et veiller à ce que le docteur Merswin soit défrayé de son voyage ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande d'aller à Saverne pour partir à Strasbourg rencontrer Maximilien d'Autriche avec le comte de Salm et le seigneur de Bitsche ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud sur les affaires des Neufchâtel ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud sur le remboursement d'un marchand par le duc Alexandre ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : pour s'excuser sur plusieurs affaires, il envoie auprès de Maximilien d'Autriche le capitaine d'Arches Hans von Hohenfurst et lui demande de traduire ses instructions en allemand ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : Maximilien d'Autriche étant à Strasbourg, il doit y aller avec plusieurs seigneurs ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il faut consulter le conseil sur l'attitude à avoir dans les négociations avec l'Empire ; Correspondance de Philippa de Gueldres et de René II ; Copie d'une lettre écrite un 25 juillet (1498) à Lamarche, de J. de Seroncourt, à Philippa de Gueldres sur l'occupation du pays par le seigneur de Vergy ; Lettre de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres : il faut laisser entrer Maximilien d'Autriche dans leurs pays s'il le veut ; Lettre de René II duc de Lorraine à Philippa de Gueldres : il demande deux passeports pour des gens du marquis de Rothelin ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : il faut veiller à ce que l'armée impériale en se retirant, ne ravage pas la région des Vosges ; Copie d'une lettre du 12 août (1498 ?) à Lamarche, de Claude d'Arberg (?) à Philippa de Gueldres : il l'informe sur le départ des troupes bourguignonnes ; Correspondance sans date d'année de René II duc de Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il leur transmet une plainte de l'archiduc sur un de ses sujets détroussé par un Lorrain et leur demande de s'informer sur le motif de cet « exploit » ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il doit écrire au docteur Merswin à Strasbourg d'attendre les ambassadeurs qui doivent aller à Salzbourg avec lui auprès de Maximilien d'Autriche ; René II duc de Lorraine à Johannes Lud et aux prévôts des chanoines de Nancy : il leur demande de mettre fin au désordre des religieuses de Nancy en fermant le couvent à clef en attendant sa réforme ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui envoie pour examen un projet d'accord sur le mariage de sa sœur Marguerite de Vaudémont avec René duc d'Alençon ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il faut dire à Maître Gabriel que Jacques le fils de Huin Roynette n'a pas à être jugé par la Chambre Impériale ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il faut choisir quelqu'un pour envoyer à Saint-Hippolyte ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande de lui envoyer une lettre de Saint-Amadour, négociateur auprès du roi ; Lettre de René II à Johannes Lud : il lui envoie un mandement de la Chambre impériale sur la détention de Huin Roynette, pour qu'il le traduise ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande si les villages de Herbeviller, Manonviller et Bathelémont qui refusent de payer les aides sont de ses fiefs et s'ils sont francs d'impôts et demande son avis sur le cas de Huin Roynette, qu'il a fait arrêter par force aux Cordeliers de Toul ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : ils doivent choisir cinq ou six personnes et les lui envoyer pour choisir les prochains quatre jurés de Nancy ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens des Comptes de Nancy ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy : il leur envoie une lettre de l'archevêque de Trêves qui proteste contre la saisie de deux chevaux d'un de ses sujets par les officiers de Sierck pour le fait des aides ; Lettre de Jean évêque de Tournai (Jean de Mailly 1425-1473 ?) au duc de Lorraine (Jean II d'Anjou ou Nicolas duc de Lorraine ?) qu'il lui envoie par maître Gratien, confesseur du Saint-Père ; Lettre des gens du Conseil de Nancy à René II duc de Lorraine sur les affaires du bailliage d'Allemagne ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud sur une ambassade de Maximilien d'Autriche qui vient rencontrer le roi (Louis XII ?) ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens des Comptes de Nancy sur le rachat de Hombourg ; Lettre de Henri comte de Thierstein à René II duc de Lorraine : comme un marchand a été détroussé près de Saint-Dié, il promet de punir les coupables s'ils sont des gens de guerre qu'il héberge ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il a reçu les lettres concernant Jean de Bruxelles ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui faut traduire les lettres de maître Gabriel qui sont en allemand, le duc fera faire le nécessaire pour celles qui sont en latin ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il leur envoie pour examen une demande des officiers de Châtel-sur-Moselle pour la libération d'un homme fait prisonnier par le prévôt d'Epinal ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il faut envoyer Guillaume de Warsperg et Jacques de Haraucourt à « l'obsèque » à Trêves (pour l'archevêque Jean de Bade mort en 1503 ?) et leur préparer des habits appropriés ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur les obsèques de l'archevêque de Trêves ; Lettre de cinq officiers du roi qui ont attendu en vain le roi des Romains et demandent quelles sont ses intentions à René II duc de Lorraine ; Lettre de Jean de l'Eglise, procureur de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il a été reçu à Bruxelles par l'archiduc pour les négociations sur Arschot et le tonlieu de Dam ; Lettre de Petre de Dalhem et Humbert de Widrenges : ils envoient une lettre du « passager » de Sierck disant qu'une armée venue des Pays-Bas s'approche de Thionville ; Lettre de René II duc de Lorraine au bâtard de Granson : il lui demande de lui amener des chevaux pour lui et Philippa de Gueldres ; Lettre des gens du Conseil de Nancy à René II duc de Lorraine : ils lui conseillent d'accepter la demande du prince d'Orange qui veut faire passer ses troupes vers le Luxembourg par la Lorraine, s'il les fait passer par petits groupes de 5 ou 6 ; Correspondance datée de René II duc de Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine aux électeurs de Trêves et Cologne et au comte palatin : il craint que Louis XII n'intervienne dans la future guerre entre l'Empereur et les Suisses, en allemand ; Même pièce que la précédente, sans l'adresse ; Lettre de l'archevêque de Cologne à René II duc de Lorraine, réponse à la pièce précédente : il le remercie de ses bons offices et l'assure de sa coopération, en allemand ; Lettre de René II duc de Lorraine au sénéchal de Lorraine et à Johannes Lud : après son départ de la Cour, il a renvoyé Saint-Amadour auprès de Louis XII. Il leur envoie des lettres d'Anne de Bretagne et du cardinal d'Amboise ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens et auditeurs des Comptes de Nancy : il leur demande de se renseigner sur le statut des villages de Herbeviller, Manonviller et Bathelémont que le seigneur de Gerbéviller prétend ne pas être des fiefs de Lorraine et donc exempts d'impôts ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande de sceller une lettre en faveur d'un de ses serviteurs ; Missives de Philippa de Gueldres ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud : elle a reçu une lettre de René II duc de Lorraine sur les négociations pour la Provence, l'aide que ses pays lui accordent, les intrusions de soldats bourguignons, etc ; Lettre de Philippa de Gueldres à Johannes Lud : il faut avertir les évêques de Trêves et Cologne et le comte palatin des négociations d'Anne de Bretagne pour la guerre de l'archiduc et des Suisses et donner un sauf-conduit à l'ambassadeur français auprès de Maximilien d'Autriche ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle leur envoie une lettre du seigneur de Valengin et une supplique du chapitre de Toul ; Lettre du chapitre de Toul à Philippa de Gueldres : plainte contre le bailli des Vosges qui veut dénombrer les feux du ban de Vicherey pour l'imposer ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy : elle leur transmet la pièce précédente ; Lettre de Philippa de Gueldres aux gens du Conseil de Nancy : elle a reçu une lettre de René II duc de Lorraine amenée par Jean Jourdain « seigneur des Ursins de Rome » en sa faveur : il faut lui accorder un sauf-conduit pour traverser la Lorraine ; Lettre de Philippa de Gueldres au bailli du Bassigny : les Bourguignons menacent de revenir, il faut que tous se mettent en armes, prêts à marcher ; Lettre de Philippa de Gueldres au sénéchal de Lorraine, au bailli de Nancy, seigneur de Pierrefort et au receveur du bailli : elle leur demande de travailler au procès de Huin Roynette ; Correspondance de René II duc de Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud : il lui demande d'écrire des lettres pour les ambassadeurs auprès de Maximilien d'Autriche ; Lettre d'Heinrich Schon à René II duc de Lorraine : il l'avertit que Maximilien d'Autriche est arrivé à Strasbourg, en allemand ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy sur le rachat à faire d'un héritage au Ban Sainte-Marguerite occupé par Thiébaut de Jussey ; Lettre de René II duc de Lorraine à Ferry de Helmstat : il l'envoie accueillir le comte palatin à la Petite-Pierre et s'excuser de ne pouvoir aller le voir, mais il doit parler avec le duc de Gueldres qui s'en va en France ; Mémoires et instructions ; Instructions données à Guillaume de Warsperg et Adam, receveur de Sierck pour une journée sur un différend avec le comte palatin fixée au dimanche de Letare. Trois hommes de Lutzelbourg ont été pris par les officiers d'« Eyvershusen » en contre-gage d'un homme pris par le seigneur de Lutzelbourg dans un bois qu'il dit être de la seigneurie de Fenestrange en Lorraine alors que le comte palatin le revendique de sa principauté ; Information faite par Claude Nagel receveur de Lunéville et Jean le Moyne, secrétaire et tabellion de Lunéville, sur les dommages causés dans la prévôté d'Azerailles par les « aventuriers » bourguignons, contenant une lettre du 27 mai 1499 du Conseil de Nancy à eux adressés, leur demandant d'informer sur ces dommages par ordre de Philippa de Gueldres. Dépositions des témoins du 19 au 30 mai, à Azerailles et Hadonviller. Cf. vol. 108 f. 96 ; Information faite par Colin Nigault châtelain, et Nicolas Pierre, tabellion, sur les dommages causés par les Bourguignons à Xures, Ley, Moncourt, Haraucourt, etc ; Correspondance de René II duc de Lorraine ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil et des Comptes de Nancy : il leur envoie le double d'une instruction du prévôt de Neufchâtel-en-Ardenne ; Copie d'une lettre de René II duc de Lorraine en allemand ; Fragment sur papier ; Lettre de créance de Charles de Gueldres à l'archiduc d'Autriche pour son maître d'hôtel, le bâtard de Granson ; Lettre de J. Vincent, procureur général du Barrois, aux gens du conseil de Bar : procès de René II duc de Lorraine contre la dame d'Apremont doit être déplacé de Saint-Julien à cause de la peste ; Analyse d'une lettre de René II duc de Lorraine à un destinataire non identifié ; Lettre de René II duc de Lorraine au président et aux gens des Comptes de Nancy : il leur transmet une supplique de l'abbé de Saint-Martin de Metz dont l'abbaye est endettée et menace ruine. En post-scriptum, il annonce que Philippa de Gueldres a donné naissance à un fils dans la soirée (Louis de Lorraine, évêque de Verdun puis comte de Vaudémont) et leur demande de le faire savoir pour louer Dieu ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il leur envoie les lettres du docteur Merswin et de Maximilien d'Autriche et leur demande de répondre ; Lettre de René II duc de Lorraine aux gens du Conseil de Nancy : il leur envoie une lettre de Jacob de Fleckenstein, lieutenant du landvogt d'Alsace, sur Marmoutier ; Lettre du 18 janvier 1502 n. s. de Philippe comte palatin du Rhin à René II duc de Lorraine : il le remercie de ses bons offices auprès de Louis XII à propos d'une pension que le roi lui devait, en allemand ; Lettre de Guillaume landgrave de Hesse à René II duc de Lorraine, en allemand ; Mémoire de Louis Merlin, président des comptes du duché de Bar : dépenses faites au service de René II duc de Lorraine pour l'année 1502 ; Copie et traduction de la pièce suivante ; Lettre de 1502 du comte palatin à René II duc de Lorraine : il lui demande de l'aide car Guillaume landgrave de Hesse et d'autres lèvent des troupes, en allemand ; Lettre de Guillaume landgrave de Hesse à René II duc de Lorraine, en allemand ; Lettres diverses ; Lettre de Jean Hanalt ? à Jean le Jeune chanoine d'Apremont : sur un envoi du drap et la cure de Leheville ; Lettre de créance de Pierre de Bourbon à René II duc de Lorraine en faveur de Michel Gaillart. Cf. vol. 11 f. 6-11 ; Lettre de Ferry de Savigny seigneur de Dombasle et Jean d'Einvau ? aux gens du Conseil de Nancy : ils ont rencontré les chefs des aventuriers (bourguignons) qui occupent Bezanges et supplient le conseil d'intervenir ; Lettre de « Jehan Drey » à René II duc de Lorraine : le duc lui a demandé de venir avec le plus de gens d'armes possible, il lui envoie son lieutenant et les gens d'armes mais doit demander son congé au Roi ; Lettre de Jehan Drey à René II duc de Lorraine : le prévôt d'Epinal et le lieutenant de Bruyères lui ont ordonné au nom du duc de quitter la ville et même les pays du duc puis l'abbesse lui a refusé l'entrée dans la ville : il demande des explications et proteste de sa fidélité ; Lettre des gens du Conseil de René II duc de Lorraine étant alors à Reims, sur les négociations avec les commissaires de « messire Robert » (Robert II de la Marck) : cf. vol. 11 f. 12-22 ; Lettre de Thomin Boulart, trésorier, à René II duc de Lorraine : il lui envoie ce qu'il avait commandé : des « heures », deux pièces d'écarlate et des pâtenôtres pour son « père » (René d'Anjou ?) mais sans roche d'Allemagne ; Lettre d'Hugues des Hazards à René II duc de Lorraine sur Adam Bayer et le landgrave de Hesse ; Instructions pour Jacques d'Haraucourt et le docteur Jacques Merswin, envoyés à Louis V comte palatin pour le féliciter de son accession au trône ; Missive de maître Marcus Schünagel, curé de Châteausalins à René II duc de Lorraine, en allemand ; Lettre du président de Barrois au président de Lorraine ; Minute d'une lettre du conseil ducal écrite à René II duc de Lorraine sur les exigences de Maximilien d'Autriche et un procès pour la cure de Bousonville ; Lettre écrite de Rome à René II duc de Lorraine sur les affaires d'Italie et Alexandre VI ; Lettre de René II duc de Lorraine à Johannes Lud, il lui envoie une lettre de Maximilien d'Autriche lui interdisant de soutenir le duc Robert de Bavière ; Minute de quatre lettres ( ?) de René II duc de Lorraine : au cardinal de Rohan (François II ?), au « maréchal de Grey », au « chancelier » et à un destinataire anonyme (« mon cousin mon amy ») ; Lettre de Hue e. de Toul (Hugues des Hazards) au président de Lorraine à qui il s'excuse d'avoir emprunté sa hacquenée ; Copie d'une lettre du Conseil ducal à René II duc de Lorraine : ils récusent la compétence du Parlement de Paris et en appellent à des juges neutres pour le différend entre le duc et le roi sur la Provence. Ils craignent que le roi fasse hommage du Milanais à Maximilien d'Autriche ; Lettre de René II duc de Lorraine aux prévôts des chanoines (de Saint-Georges de Nancy) et à Johannes Lud, il leur envoie la lettre du docteur Merswin et la réponse prête : il autorise son secrétaire à la refaire le cas échéant ; Lettre du président et des gens des Comptes de Nancy à René II duc de Lorraine, ils lui renvoient le dossier de Jean de Wauldrey dont le père Philibert bâtard de Wauldrey aurait fait la guerre pour le roi de Sicile, n'en ont pas trouvé de traces dans les archives mais conseillent de ne pas irriter le plaignant

Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) by Fully Human Antibodies Correlates with Their Specificity for the β-Sheet Structure of MIF.

The macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a proinflammatory cytokine that recently emerged as an attractive therapeutic target for a variety of diseases. A diverse panel of fully human anti-MIF antibodies was generated by selection from a phage display library and extensively analyzed in vitro. Epitope mapping studies identified antibodies specific for linear as well as structural epitopes. Experimental animal studies revealed that only those antibodies binding epitopes within amino acids 50-68 or 86-102 of the MIF molecule exerted protective effects in models of sepsis or contact hypersensitivity. Within the MIF protein, these two binding regions form a β-sheet structure that includes the MIF oxidoreductase motif. We therefore conclude that this β-sheet structure is a crucial region for MIF activity and a promising target for anti-MIF antibody therapy.

Formation of the long range Dpp morphogen gradient.

The TGF-β homolog Decapentaplegic (Dpp) acts as a secreted morphogen in the Drosophila wing disc, and spreads through the target tissue in order to form a long range concentration gradient. Despite extensive studies, the mechanism by which the Dpp gradient is formed remains controversial. Two opposing mechanisms have been proposed: receptor-mediated transcytosis (RMT) and restricted extracellular diffusion (RED). In these scenarios the receptor for Dpp plays different roles. In the RMT model it is essential for endocytosis, re-secretion, and thus transport of Dpp, whereas in the RED model it merely modulates Dpp distribution by binding it at the cell surface for internalization and subsequent degradation. Here we analyzed the effect of receptor mutant clones on the Dpp profile in quantitative mathematical models representing transport by either RMT or RED. We then, using novel genetic tools, experimentally monitored the actual Dpp gradient in wing discs containing receptor gain-of-function and loss-of-function clones. Gain-of-function clones reveal that Dpp binds in vivo strongly to the type I receptor Thick veins, but not to the type II receptor Punt. Importantly, results with the loss-of-function clones then refute the RMT model for Dpp gradient formation, while supporting the RED model in which the majority of Dpp is not bound to Thick veins. Together our results show that receptor-mediated transcytosis cannot account for Dpp gradient formation, and support restricted extracellular diffusion as the main mechanism for Dpp dispersal. The properties of this mechanism, in which only a minority of Dpp is receptor-bound, may facilitate long-range distribution.

Improving the sensitivity of the sequence profile method.

The sequence profile method (Gribskov M, McLachlan AD, Eisenberg D, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84:4355-4358) is a powerful tool to detect distant relationships between amino acid sequences. A profile is a table of position-specific scores and gap penalties, providing a generalized description of a protein motif, which can be used for sequence alignments and database searches instead of an individual sequence. A sequence profile is derived from a multiple sequence alignment. We have found 2 ways to improve the sensitivity of sequence profiles: (1) Sequence weights: Usage of individual weights for each sequence avoids bias toward closely related sequences. These weights are automatically assigned based on the distance of the sequences using a published procedure (Sibbald PR, Argos P, 1990, J Mol Biol 216:813-818). (2) Amino acid substitution table: In addition to the alignment, the construction of a profile also needs an amino acid substitution table. We have found that in some cases a new table, the BLOSUM45 table (Henikoff S, Henikoff JG, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919), is more sensitive than the original Dayhoff table or the modified Dayhoff table used in the current implementation. Profiles derived by the improved method are more sensitive and selective in a number of cases where previous methods have failed to completely separate true members from false positives.

Signal search analysis server.

Signal search analysis is a general method to discover and characterize sequence motifs that are positionally correlated with a functional site (e.g. a transcription or translation start site). The method has played an instrumental role in the analysis of eukaryotic promoter elements. The signal search analysis server provides access to four different computer programs as well as to a large number of precompiled functional site collections. The programs offered allow: (i) the identification of non-random sequence regions under evolutionary constraint; (ii) the detection of consensus sequence-based motifs that are over- or under-represented at a particular distance from a functional site; (iii) the analysis of the positional distribution of a consensus sequence- or weight matrix-based sequence motif around a functional site; and (iv) the optimization of a weight matrix description of a locally over-represented sequence motif. These programs can be accessed at: http://www.isrec.isb-sib.ch/ssa/.

VARIABILITY OF PHENOTYPIC, PROTEOMIC AND TRANSCRIPTOMIC EXPRESSION OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS SURFACE ADHESINS

Staphylococcus aureus is a highly successful pathogen responsible of a wide variety of diseases, from minor skin infection to life-threatening sepsis or infective endocarditis, as well as food poisoning and toxic shock syndrome. This heterogeneity of infections and the ability of S. aureus to develop antibiotic-resistance to virtually any available drugs reflect its extraordinary capacity to adapt and survive in a great variety of environments. The pathogenesis of S. aureus infection involves a wide range of cell wall-associated adhesins and extracellular toxins that promote host colonization and invasion. In addition, S. aureus is extremely well equipped with regulatory systems that sense environmental conditions and respond by fine tuning the expression of metabolic and virulence determinants. Surface adhesins referred to MSCRAMMs - for Microbial Surface Component Recognizing Adherence Matrix Molecules - mediate binding to the host extracellular matrix or serum components, including fibrinogen, fibronectin, collagen and elastin, and promote tissue colonization and invasion. Major MSCRAMMs include a family of surface-attached proteins covalently bound to the cell wall peptidoglycan via a conserved LPXTG motif. Genomic analyses indicate that S. aureus contain up to 22 LPXTG surface proteins, which could potentially act individually or in synergy to promote infection. In the first part of this study we determined the range of adherence phenotypes to fibrinogen and fibronectin among 30 carriage isolates of S. aureus and compared it to the adherence phenotypes of 30 infective endocarditis and 30 blood culture isolates. Overall there were great variations in in vitro adherence, but no differences were observed between carriage and infection strains. We further determined the relation between in vitro adherence and in vivo infectivity in a rat model of experimental endocarditis, using 4 isolates that displayed either extremely low or high adherence phenotypes. Unexpectedly, no differences were observed between the in vivo infectivity of isolates that were poorly and highly adherent in vitro. We concluded that the natural variability of in vitro adherence to fibrinogen and fibronectin did not correlate with in vivo infectivity, and thus that pathogenic differences between various strains might only be expressed in in vivo conditions, but not in vitro. Therefore, considering the importance of adhesins expression for infection, direct measurement of those adhesins present on the bacterial surface were made by proteomic approach. 5 In the second series of experiments we assessed the physical presence of the LPXTG species at the staphylococcal surface, as measured at various time points during growth in different culture media. S. aureus Newman was grown in either tryptic soy broth (TSB) or in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) culture medium, and samples were removed from early exponential growth phase to late stationary phase. Experiments were performed with mutants in the global accessory-gene regulator (agr), surface protein A (Spa) and clumping factor A (ClfA). Peptides of surface proteins were recovered by "trypsin-shaving" of live bacteria, and semi-quantitative proteomic analysis was performed by tandem liquid-chromatography and mass-spectrometry (LC-MS). We also determined in parallel the mRNA expression by microarrays analysis, as well as the phenotypic adherence of the bacteria to fibrinogen in vitro. The surface proteome was highly complex and contained numerous proteins theoretically not belonging to the bacterial envelope, including ribosomal proteins and metabolic enzymes. Sixteen of the 21 known LPXTG species were detected, but were differentially expressed. As expected, 9 known agr-regulated proteins (e.g. including Spa, FnBPA, ClfA, IsdA, IsdB, SasH, SasD, SasG and FmtB) increased up to the late exponential growth phase, and were abrogated in agr-negative mutants. However, only Spa and SasH modified their proteomic and mRNA profiles in parallel in the parent and its agr negative mutant, while all other LPXTG proteins modified their proteomic profiles independently of their mRNA. Moreover, ClfA became highly transcribed and active in in vitro fibrinogen adherence tests during late growth (24h), whereas it remained poorly detected by proteomics. Differential expression was also detected in iron-rich TSB versus iron-poor RPMI. Proteins from the iron-regulated surface determinant (isd) system, including IsdA, IsdB and IsdH were barely expressed in iron-rich TSB, whereas they increased their expression by >10 time in iron-poor RPMI. We conclude that semi-quantitative proteomic analysis of specific protein species is feasible in S. aureus and that proteomic, transcriptomic and adherence phenotypes demonstrated differential profiles in S. aureus. Furthermore, peptide signatures released by trypsin shaving suggested differential protein domain exposures in various environments, which might be relevant for antiadhesins vaccines. A comprehensive understanding of the S. aureus physiology should integrate all these approaches.

Tomosyn-1 is involved in a post-docking event required for pancreatic beta-cell exocytosis.

Although the assembly of a ternary complex between the SNARE proteins syntaxin-1, SNAP25 and VAMP2 is known to be crucial for insulin exocytosis, the mechanisms controlling this key event are poorly understood. We found that pancreatic beta-cells express different isoforms of tomosyn-1, a syntaxin-1-binding protein possessing a SNARE-like motif. Using atomic force microscopy we show that the SNARE-like domain of tomosyn-1 can form a complex with syntaxin-1 and SNAP25 but displays binding forces that are weaker than those observed for VAMP2 (237+/-13 versus 279+/-3 pN). In pancreatic beta-cells tomosyn-1 was found to be concentrated in cellular compartments enriched in insulin-containing secretory granules. Silencing of tomosyn-1 in the rat beta-cell line INS-1E by RNA interference did not affect the number of secretory granules docked at the plasma membrane but led to a reduction in stimulus-induced exocytosis. Replacement of endogenous tomosyn-1 with mouse tomosyn-1, which differs in the nucleotide sequence from its rat homologue and escapes silencing, restored a normal secretory rate. Taken together, our data suggest that tomosyn-1 is involved in a post-docking event that prepares secretory granules for fusion and is necessary to sustain exocytosis of pancreatic beta-cells in response to insulin secretagogues.

On the receiver pays principle

This paper extends the theory of network competition betweentelecommunications operators by allowing receivers to derive a surplusfrom receiving calls (call externality) and to affect the volume ofcommunications by hanging up (receiver sovereignty). We investigate theextent to which receiver charges can lead to an internalization of thecalling externality. When the receiver charge and the termination(access) charge are both regulated, there exists an e±cient equilibrium.Effciency requires a termination discount. When reception charges aremarket determined, it is optimal for each operator to set the prices foremission and reception at their off-net costs. For an appropriately chosentermination charge, the symmetric equilibrium is again effcient. Lastly,we show that network-based price discrimination creates strong incentivesfor connectivity breakdowns, even between equal networks.