Characterization of cerebral glucose dynamics in vivo with a four-state conformational model of transport at the blood-brain barrier.

Determination of brain glucose transport kinetics in vivo at steady-state typically does not allow distinguishing apparent maximum transport rate (T(max)) from cerebral consumption rate. Using a four-state conformational model of glucose transport, we show that simultaneous dynamic measurement of brain and plasma glucose concentrations provide enough information for independent and reliable determination of the two rates. In addition, although dynamic glucose homeostasis can be described with a reversible Michaelis-Menten model, which is implicit to the large iso-inhibition constant (K(ii)) relative to physiological brain glucose content, we found that the apparent affinity constant (K(t)) was better determined with the four-state conformational model of glucose transport than with any of the other models tested. Furthermore, we confirmed the utility of the present method to determine glucose transport and consumption by analysing the modulation of both glucose transport and consumption by anaesthesia conditions that modify cerebral activity. In particular, deep thiopental anaesthesia caused a significant reduction of both T(max) and cerebral metabolic rate for glucose consumption. In conclusion, dynamic measurement of brain glucose in vivo in function of plasma glucose allows robust determination of both glucose uptake and consumption kinetics.

Regulation of sodium transport in the cortical collecting duct : physiological role of GILZ in vitro and in vivo : characterisation of Na+ transport in the mCCDcl1 cell line

SUMMARY Regulation of sodium excretion by the kidney is a key mechanism in the long term regulation of blood pressure, and when altered it constitutes a risk factor for the appearance of arterial hypertension. Aldosterone, which secretion depends upon salt intake in the diet, is a steroid hormone that regulates sodium reabsorption in the distal part of the nephron (functional unit of the kidney) by modulating gene transcription. It has been shown that it can act synergistically with the peptidic hormone insulin through the interaction of their signalisation pathways. Our work consisted of two distinct parts: 1) the in vitro and in vivo characterisation of Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper (GILZ) (an aldosterone-induced gene) mechanism of action; 2) the in vitro characterisation of insulin mechanism of action and its interaction with aldosterone. GILZ mRNA, coded by the TSC22D3 gene, is strongly induced by aldosterone in the cell line of principal cells of the cortical collecting duct (CCD) mpkCCDc14, suggesting that GILZ is a mediator of aldosterone response. Co-expression of GILZ and the amiloride-sensitive epithelial sodium channel ENaC in vitro in the Xenopus oocyte expression system showed that GILZ has no direct effect on the ENaC-mediated Na+ current in basal conditions. To define the role of GILZ in the kidney and in other organs (colon, heart, skin, etc.), a conditional knock-out mouse is being produced and will allow the in vivo study of its role. Previous data showed that insulin induced a transepithelial sodium transport at supraphysiological concentrations. Insulin and the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) are able to bind to each other receptor with an affinity 50 to 100 times lower than to their cognate receptor. Our starting hypothesis was that the insulin effect observed at these supraphysiological concentrations is actually mediated by the IGF receptor type 1 (IGF-1R). In a new cell line that presents all the characteristics of the principal cells of the CCD (mCCDc11) we have shown that both insulin and IGF-1 induce a physiologically significant increase of Na+ transport through the activation of IGF-1R. Aldosterone and insulin/IGF-1 have an additive effect on Na+ transport, through the activation of the PI3-kinase (PI3-K) pathway and the phosphorylation of the serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (Sgk1) by the IGF-1R, and the induction of Sgk1 expression by aldosterone. Thus, Sgk1 integrates IGF-1/insulin and aldosterone effects. We suggest that IGF-1 is physiologically relevant in the modulation of sodium balance, while insulin can only regulate Na+ transport at supraphysiological conditions. Both hormones would bind to the IGF-1R and induce Na+ transport by activating the PI3-K PDK1/2 - Sgk1 pathway. We have shown for the first time that Sgk1 is expressed and phosphorylated in principal cells of the CCD in basal conditions, although the mechanism that maintains Sgk1 phosphorylation is not known. This new role for IGF-1 suggests that it could be a salt susceptibility gene. In effect, IGF-1 stimulates Na+ and water transport in the kidney in vivo. Moreover, 35 % of the acromegalic patients (overproduction of growth hormone and IGF-1) are hypertensives (higher proportion than in normal population), and genetic analysis suggest a link between the IGF-1 gene locus and blood pressure. RÉSUMÉ La régulation de l'excrétion rénale de sodium (Na+) joue un rôle principal dans le contrôle à long terme de la pression sanguine, et ses altérations constituent un facteur de risque de l'apparition d'une hypertension artérielle. L'aldosterone, dont la sécrétion dépend de l'apport en sel dans la diète, est une hormone stéroïdienne qui régule la réabsorption de Na+ dans la partie distale du nephron (unité fonctionnelle du rein) en contrôlant la transcription de gènes. Elle peut agir de façon synergistique avec l'hormone peptidique insuline, probablement via l'interaction de leurs voies de signalisation cellulaire. Le but de notre travail comportait deux volets: 1) caractériser in vitro et in vivo le mécanisme d'action du Glucocorticoid Induced Leucine Zipper (GILZ) (un gène induit par l'aldosterone); 2) caractériser in vitro le mécanisme d'action de l'insuline et son interaction avec l'aldosterone. L'ARNm de GILZ, codé par le gène TSC22D3, est induit par l'aldosterone dans la lignée cellulaire de cellules principales du tubule collecteur cortical (CCD) mpkCCDc14, suggérant que GILZ est un médiateur potentiel de la réponse à l'aldosterone. La co-expression in vitro de GILZ et du canal à Na+ sensible à l'amiloride ENaC dans le système d'expression de l'oocyte de Xénope a montré que GILZ n'a pas d'effet sur les courants sodiques véhiculées par ENaC en conditions basales. Une souris knock-out conditionnelle de GILZ est en train d'être produite et permettra l'étude in vivo de son rôle dans le rein et d'autres organes. Des expériences préliminaires ont montré que l'insuline induit un transport transépithelial de Na+ à des concentrations supraphysiologiques. L'insuline et l'insulin-like growth factor 1 (IGF-1) peuvent se lier à leurs récepteurs réciproques avec une affinité 50 à 100 fois moindre qu'à leur propre récepteur. Nous avons donc proposé que l'effet de l'insuline soit médié par le récepteur à l'IGF type 1 (IGF-1R). Dans une nouvelle lignée cellulaire qui présente toutes les caractéristiques des cellules principales du CCD (mCCDc11) nous avons montré que les deux hormones induisent une augmentation physiologiquement significative du transport du Na+ par l'activation des IGF-1 R. Aldosterone et insuline/IGF-1 ont un effet additif sur le transport de Na+, via l'activation de la voie de la PI3-kinase et la phosphorylation de la serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (Sgk1) par l'IGF-1R, dont l'expression est induite par l'aldosterone. Sgk1 intègre les effets de l'insuline et l'aldosterone. Nous proposons que l'IGF-1 joue un rôle dans la modulation physiologique de la balance sodique, tandis que l'insuline régule le transport de Na+ à des concentrations supraphysiologiques. Les deux hormones agissent en se liant à l'IGF-1R et induisent le transport de Na+ en activant la cascade de signalisation PI3-K - PDK1/2 - Sgk1. Nous avons montré pour la première fois que Sgk1 est exprimée et phosphorylée dans des conditions basales dans les cellules principales du CCD, mais le mécanisme qui maintient sa phosphorylation n'est pas connu. Ce nouveau rôle pour l'IGF-1 suggère qu'il pourrait être un gène impliqué de susceptibilité au sel. Aussi, l'IGF-1 stimule le transport rénal de Na+ in vivo. De plus, 35 % des patients atteints d'acromégalie (surproduction d'hormone de croissance et d'IGF-1) sont hypertensifs (prévalence plus élevée que la population normale), et des analyses génétiques suggèrent un lien entre le locus du gène de l'IGF-1 et la pression sanguine. RÉSUMÉ GRAND PUBLIC Nos ancêtres se sont génétiquement adaptés pendant des centaines de millénaires à un environnement pauvre en sel (chlorure de sodium) dans la savane équatoriale, où ils consommaient moins de 0,1 gramme de sel par jour. On a commencé à ajouter du sel aux aliments avec l'apparition de l'agriculture (il y a 5000 à 10000 années), et aujourd'hui une diète omnivore, qui inclut des plats préparés, contient plusieurs fois la quantité de sodium nécessaire pour notre fonction physiologique normale (environ 10 grammes par jour). Le corps garde sa concentration constante dans le sang en s'adaptant à une consommation très variable de sel. Pour ceci, il module son excrétion soit directement, soit en sécrétant des hormones régulatrices. Le rein joue un rôle principal dans cette régulation puisque l'excrétion urinaire de sel change selon la diète et peut aller d'une quantité dérisoire à plus de 36 grammes par jour. L'attention qu'on prête au sel est liée à sa relation avec l'hypertension essentielle. Ainsi, le contrôle rénal de l'excrétion de sodium et d'eau est le principal mécanisme dans la régulation de la pression sanguine, et une ingestion excessive de sel pourrait être l'un des facteurs-clé déclenchant l'apparition d'un phénotype hypertensif. L'hormone aldosterone diminue l'excrétion de sodium par le rein en modulant l'expression de gènes qui pourraient être impliqués dans la sensibilité au sel. Dans une lignée cellulaire de rein l'expression du gène TSC22D3, qui se traduit en la protéine Glucocorticoid Induced Leucine Zipper (GILZ), est fortement induite par l'aldosterone. Ceci suggère que GILZ est un médiateur potentiel de l'effet de l'aldosterone, et pourrait être impliqué dans la sensibilité au sel. Pour analyser la fonction de GILZ dans le rein plusieurs approches ont été utilisées. Par exemple, une souris dans laquelle GILZ est spécifiquement inactivé dans le rein est en train d'être produite et permettra l'étude du rôle de GILZ dans l'organisme. De plus, on a montré que GILZ, en conditions basales, n'a pas d'effet direct sur la protéine transportant le sodium à travers la membrane des cellules, le canal sodique épithélial ENaC. On a aussi essayé de trouver des protéines qui interagissent directement avec GILZ utilisant une technique appelée du « double-hybride dans la levure », mais aucun candidat n'a émergé. Des études ont montré que, à de hautes concentrations, l'insuline peut aussi diminuer l'excrétion de sodium. A ces concentrations, elle peut activer son récepteur spécifique, mais aussi le récepteur d'une autre hormone, l'Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1). En plus, l'infusion d'IGF-1 augmente la rétention rénale de sodium et d'eau, et des mutations du gène codant pour l'IGF-1 sont liées aux différents niveaux de pression sanguine. On a utilisé une nouvelle lignée cellulaire de rein développée dans notre laboratoire, appelée mCCDc11, pour analyser l'importance relative des deux hormones dans l'induction du transport de sodium. On a montré que les deux hormones induisent une augmentation significative du transport de sodium par l'activation de récepteurs à l'IGF-1 et non du récepteur à l'insuline. On a montré qu'à l'intérieur de la cellule leur activation induit une augmentation du transport sodique par le biais du canal ENaC en modifiant la quantité de phosphates fixés sur la protéine Serumand Glucocorticoid-induced Kinase 1 (Sgk1). On a finalement montré que l'IGF-1 et l'aldosterone ont un effet additif sur le transport de sodium en agissant toutes les deux sur Sgk1, qui intègre leurs effets dans le contrôle du transport de sodium dans le rein.

In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.

The molecular mechanisms that control how progenitors generate distinct subtypes of neurons, and how undifferentiated neurons acquire their specific identity during corticogenesis, are increasingly understood. However, whether postmitotic neurons can change their identity at late stages of differentiation remains unknown. To study this question, we developed an electrochemical in vivo gene delivery method to rapidly manipulate gene expression specifically in postmitotic neurons. Using this approach, we found that the molecular identity, morphology, physiology and functional input-output connectivity of layer 4 mouse spiny neurons could be specifically reprogrammed during the first postnatal week by ectopic expression of the layer 5B output neuron-specific transcription factor Fezf2. These findings reveal a high degree of plasticity in the identity of postmitotic neocortical neurons and provide a proof of principle for postnatal re-engineering of specific neural microcircuits in vivo.

Streptozotocin induces a shift towards T regulatory cell responses in vivo

Objectives: Streptozotocin (STZ) induced diabetes is currently the most commonly used animalmodel for islet transplantation.However, STZtreatment and the ensuing hyperglycemia were both shown to affect the immune response, including an apparent induction of lymphopenia. The aim of this study was to evaluate the respective effect of STZ and hyperglycemia on the immune system in STZ induced diabetic C57BL/6 mice. Methods: Phenotypes and levels of T and B cells were analyzed by flow cytometry in blood and spleen over time. The effect of hyperglycemia was further characterized by insulin replacement, islet transplantation and by using Rip (rat insulin promoter) DTR (dipheteria tocin receptor) transgenic mice. Results: STZ but not hyperglycemia was toxic for splenocytes in vitro, whereas hyperglycemia correlated with diabetes associated blood and spleen lymphopenia in vivo. Moreover, independently of hyperglycemia, STZ lead to a relative increase of T regulatory cells which retained their suppressive capacity in vitro. Conclusion: These data suggest thatSTZand the ensuing acute hyperglycemia have major direct and indirect effects on immune homeostasis. Thus, high caution needs to be exercised in the interpretation of the results of tolerance induction and/or immunosuppressive protocols in STZ-induced diabetes and islet transplantation models.

Tolerogenic dendritic cells and their role in induction of immune tolerance

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui permettent d'instruire les lymphocytes T, autres cellules de ce système, pour mettre en place une réponse immunitaire adaptée afin de combattre et vaincre une infection. Ces cellules dendritiques vont reconnaître des motifs spécifiquement exprimés par des pathogènes par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à leur surface. En détectant ces molécules, elles vont s'activer et subir diverses modifications pour pouvoir activer les lymphocytes T. Elles vont alors interagir avec les lymphocytes Τ et transférer les informations nécessaires pour que ces cellules s'activent à leur tour et produisent différentes protéines de façon à éliminer le pathogène. En fonction du type de pathogène, les informations transférées entre les cellules dendritiques et les lymphocytes seront différentes de manière à produire la réponse immunitaire la mieux adaptée pour supprimer l'élément infectieux. Dans le corps, les cellules dendritiques circulent continuellement afin de détecter les éléments étrangers. Quand elles reconnaissent une protéine étrangère, elles la phagocytent, c'est-à-dire qu'elles la mangent afin de pouvoir la présenter aux lymphocytes T. Mais quand elles phagocytent un élément étranger, elles peuvent également prendre des éléments du soi, comme par exemple quand elles phagocytent une cellule infectée par un virus. Les cellules dendritiques doivent alors être capables de différentier les molécules du soi et du non-soi de façon à ne pas induire une réponse en présentant un antigène du soi aux lymphocytes T. D'autant plus que lors de leur développement, les lymphocytes Τ qui sont capables de reconnaître le soi sont éliminés mais ce système n'est pas parfait et donc certains lymphocytes Τ auto-reactifs peuvent se trouver dans le corps. Il existe ainsi d'autres mécanismes en périphérie du site de développement pour inhiber ces lymphocytes Τ auto-reactifs. Ce sont les mécanismes de tolérance. Quand les lymphocytes Τ induisent une réponse aux antigènes du soi, cela résulte à des maladies auto-immunes. Dans mon projet de recherche, nous avons travaillé avec des lignées de cellules dendritiques, c'est-à-dire des cellules dendritiques semblables à celles que l'on peut trouver in vivo mais qui sont immortalisées, elles peuvent donc être cultiver et manipuler in vitro. Nous avons génétiquement modifiées ces lignées cellulaires pour qu'elles expriment des molécules immunosuppressives afin d'étudier comment induire une tolérance immunitaire, c'est-à-dire si l'expression de ces molécules permet d'éviter de générer une réponse immunitaire. Pour cela, nous avons utilisé des modèles murins de tumeurs et de maladies auto-immunes. Nous avons démontré que ces lignées de cellules dendritiques peuvent être un grand outil de recherche pour étudier les bénéfices de différentes molécules immuno-modulatrices afin d'induire une tolérance immunitaire à différents antigènes. - Les cellules dendritiques sont responsables de l'induction des réponses immunitaires adaptatives. Suite à une infection microbienne, les cellules dendritiques s'activent, elles induisent l'expression de molécules de costimulation à leur surface, sécrètent des cytokines et induisent la différentiation des cellules Τ effectrices et mémoires. De plus, les cellules dendritiques ont un rôle important dans l'induction et la maintenance de la tolérance immunitaire au niveau du thymus et en périphérie, en induisant l'anergie, la délétion ou la conversion des cellules Τ naïves en cellules régulatrices. Dans notre groupe, une nouvelle lignée de cellules dendritiques appelée MuTu a été crée par la culture de cellules dendritiques tumorales isolées à partir d'une rate d'une souris transgénique, dans laquelle l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP sont sous le contrôle du promoteur CD1 le, et sont ainsi spécifiquement exprimés dans les cellules dendritiques. Ces nouvelles lignées appartiennent au sous-type des cellules dendritiques conventionnelles exprimant CD8a. Elles ont conservé leur capacité d'augmenter l'expression des marqueurs de costimulation à leur surface ainsi que le production de cytokines en réponse à des ligands des récepteurs Toll, ainsi que leur capacité à présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II pour activer la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. En utilisant un système de transduction de lentivirus de seconde génération, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques ont été génétiquement modifiées pour sur-exprimer des molécules immunosuppressives (IL-10, TGFP latent, TGFp actif, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC et CTLA4). Ces lignées permettent d'étudier de manière reproductible le rôle de ces molécules potentiellement tolérogènes sur les réponses immunitaires in vitro et in vivo. Ces lignées potentiellement tolérogènes ont été testées, tout d'abord, in vitro, pour leur capacité à inhiber l'activation des cellules dendritiques, à bloquer la prolifération des cellules Τ ou à modifier leur polarisation. Nos résultats démontrent qu'en réponse à une stimulation, la sur-expression des molécules costimulatrices et la sécrétion de molécules pro- inflammatoires est réduite quand les cellules dendritiques sur-expriment l'IL-10. La sur¬expression de TGFp sous sa forme active induit le développement de cellules régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ et bloque la réponse CD8 cytotoxique tandis que la sur-expression de CTLA4 à la surface des cellules dendritiques inhibe une réponse Thl et induit des lymphocytes Τ anergiques. Ces lignées ont également été utilisées pour étudier l'induction de tolérance in vivo. Tout d'abord, nous avons étudié l'induction de tolérance dans un modèle de développement de tumeurs. En effet, quand les lignées tumorales sont transférées dans les lignées de souris C57BL/6, elles sont reconnues comme du non-soi du à l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP et sont éliminées. Ce mécanisme d'élimination a été étudié en utilisant une lignée de cellules dendritiques modifiée pour exprimer la luciférase et qui a permis de suivre le développement des tumeurs par de l'imagerie in vivo dans des animaux vivants. Ces lignées de cellules dendritiques MuTu sont éliminées dans la souris C57BL/6 par les lymphocytes CD8 et l'action cytotoxique de la perforine. Après plusieurs injections, les cellules dendritiques sur-exprimant CTLA4 ou l'actif TGFp peuvent casser cette réponse immunitaire inhérente aux antigènes de la lignée et induire le développement de la tumeur dans la souris C57BL/6. Le développement tumoral a pu être suivi en mesurant la bioluminescence émise par des cellules dendritiques modifiées pour exprimer à la fois l'actif TGFp et la luciférase. Ces tumeurs ont pu se développer grâce à la mise en place d'un microenvironnement suppressif pour échapper à l'immunité en recrutant des cellules myéloïde suppressives, des lymphocytes CD4 régulateurs et en induisant l'expression d'une molécule inhibitrice PD-1 à la surface des lymphocytes CD8 infiltrant la tumeur. Dans un deuxième temps, ces lignées tolérogènes ont également été testées dans un modèle murin de maladies auto-immunes, appelé l'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE), qui est un modèle pour la sclérose en plaques. L'EAE a été induite dans la souris par le transfert de cellules de ganglions prélevées d'une souris donneuse préalablement immunisée avec une protéine du système nerveux central, la glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG) émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund. La vaccination des souris donneuses et receveuses avec les cellules sur-exprimant l'actif TGFP préalablement chargées avec la protéine MOG bloque l'induction de l'EAE. Nous sommes actuellement en train de définir les mécanismes qui permettent de protéger la souris du développement de la maladie auto-immune. Dans cette étude, nous avons ainsi démontré la possibilité d'induire la tolérance in vivo et in vitro à différents antigènes en utilisant nos nouvelles lignées de cellules dendritiques et en les modifiant pour exprimer des molécules immunosuppressives. En conséquence, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques représentent un outil pour explorer les bénéfices de différentes molécules ayant des propriétés immuno-modulatrices pour manipuler le système immunitaire vers un phénotype tolérogène. - Dendritic cells (DC) are widely recognized as potent inducers of the adaptive immune responses. Importantly, after microbial infections, DC become activated, induce co- stimulation, secrete cytokines and induce effector and memory Τ cells. DC furthermore play an important role in inducing and maintaining central and peripheral tolerance by inducing anergy, deletion or commitment of antigen-specific naïve Τ cells into regulatory Τ cells. In our group, stable MuTu DC lines were generated by culture of splenic DC tumors from transgenic mice expressing the SV40 large Τ oncogene and the GFP under DC-specific CDllc promoter. These transformed DC belong to the CD8a+ conventional DC subtype and have fully conserved their capacity to upregulate co-stimulatory markers and produce cytokines after activation with Toll Like Receptors-ligands, and to present Major Histocompatibility class-I or MHCII-restricted antigens to activate Τ cell expansion and differentiation. Using a second- generation lentiviral transduction system, these newly developed MuTu DC lines were genetically modified to overexpress immunosuppressive molecules (IL-10, latent TGFp, active TGFp, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC and CTLA4). This allows to reproducibly investigate the role of these potentially tolerogenic molecules on in vitro and in vivo immune responses. These potentially tolerogenic DC were tested in vitro for their ability to inhibit DC activation, to prevent Τ cell proliferation and to modify Τ cell polarization. Our results show that the upregulation of costimulatory molecules and the secretion of pro-inflammatory cytokines were reduced upon stimulation of DC overexpressing IL-10. The overexpression of active TGFP induced the development of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and inhibited the cytotoxic CD8 Τ cell response as shown by using the OT-II Τ cell system whereas the surface expression of CTLA-4 on DC prevented the Thl response and prompted an anergic antigen-specific Τ cell response. These MuTu DC lines were also used in vivo in order to study the induction of tolerance. First we addressed the induction of tolerance in a model of tumorogenesis. The adoptively transferred tumor cell lines were cleared in C57BL/6 mice due to the foreign expression of SV40 LargeT and GFP. The mechanism of clearance of MuTu DC line into C57BL/6 mice was investigated by using luciferase-expressing DC line. These DC line allowed to follow, by in vivo imaging, the tumor development in living animals and determined that MuTu DC lines were eliminated in a perforin-mediated CD8 Τ cell dependent and CD4 Τ cell independent response. After multiple injections, DC overexpressing CTLA4 or active TGFp could break the immune response to these inherent antigens and induced DC tumorogenesis in wild type mice. The tumor outgrowth in C57BL/6 mice was nicely observed by double-transduced DC lines to express both luciferase and active TGFp. actTGFp-DC tumor was shown to recruit myeloid-derived suppressor cells, induce CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and induce the expression of the inhibitory receptor PD-1 on tumor- infiltrating CD8+ Τ cells in order to escape tumor immunity. Tolerogenic DC lines were also tested for the induction of tolerance in a murine model of autoimmune disease, the experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for human multiple sclerosis. EAE was induced in C57BL/6 mice by the adoptive transfer of lymph node cells isolated from donor mice previously immunized by a protein specific to the central nervous system, the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in the complete freund adjuvant. The vaccination of donor and recipient mice with MOG-pulsed actTGFP-DC line prevented EAE induction. We are still investigating how the active TGFP protect mice from EAE development. We generated tolerogenic DC lines inducing tolerance in vitro and in vivo. Thereby these MuTu DC lines represent a great tool to explore the benefits of various immuno-modulatory molecules to manipulate the immune system toward a tolerogenic phenotype.

Four novel Loci (19q13, 6q24, 12q24, and 5q14) influence the microcirculation in vivo.

There is increasing evidence that the microcirculation plays an important role in the pathogenesis of cardiovascular diseases. Changes in retinal vascular caliber reflect early microvascular disease and predict incident cardiovascular events. We performed a genome-wide association study to identify genetic variants associated with retinal vascular caliber. We analyzed data from four population-based discovery cohorts with 15,358 unrelated Caucasian individuals, who are members of the Cohort for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology (CHARGE) consortium, and replicated findings in four independent Caucasian cohorts (n  =  6,652). All participants had retinal photography and retinal arteriolar and venular caliber measured from computer software. In the discovery cohorts, 179 single nucleotide polymorphisms (SNP) spread across five loci were significantly associated (p<5.0×10(-8)) with retinal venular caliber, but none showed association with arteriolar caliber. Collectively, these five loci explain 1.0%-3.2% of the variation in retinal venular caliber. Four out of these five loci were confirmed in independent replication samples. In the combined analyses, the top SNPs at each locus were: rs2287921 (19q13; p  =  1.61×10(-25), within the RASIP1 locus), rs225717 (6q24; p = 1.25×10(-16), adjacent to the VTA1 and NMBR loci), rs10774625 (12q24; p  =  2.15×10(-13), in the region of ATXN2,SH2B3 and PTPN11 loci), and rs17421627 (5q14; p = 7.32×10(-16), adjacent to the MEF2C locus). In two independent samples, locus 12q24 was also associated with coronary heart disease and hypertension. Our population-based genome-wide association study demonstrates four novel loci associated with retinal venular caliber, an endophenotype of the microcirculation associated with clinical cardiovascular disease. These data provide further insights into the contribution and biological mechanisms of microcirculatory changes that underlie cardiovascular disease.

MHC Class II Transactivator Is an In Vivo Regulator of Osteoclast Differentiation and Bone Homeostasis Co-opted From Adaptive Immunity.

The molecular networks controlling bone homeostasis are not fully understood. The common evolution of bone and adaptive immunity encourages the investigation of shared regulatory circuits. MHC Class II Transactivator (CIITA) is a master transcriptional co-activator believed to be exclusively dedicated for antigen presentation. CIITA is expressed in osteoclast precursors, and its expression is accentuated in osteoporotic mice. We thus asked whether CIITA plays a role in bone biology. To this aim, we fully characterized the bone phenotype of two mouse models of CIITA overexpression, respectively systemic and restricted to the monocyte-osteoclast lineage. Both CIITA-overexpressing mouse models revealed severe spontaneous osteoporosis, as assessed by micro-computed tomography and histomorphometry, associated with increased osteoclast numbers and enhanced in vivo bone resorption, whereas osteoblast numbers and in vivo bone-forming activity were unaffected. To understand the underlying cellular and molecular bases, we investigated ex vivo the differentiation of mutant bone marrow monocytes into osteoclasts and immune effectors, as well as osteoclastogenic signaling pathways. CIITA-overexpressing monocytes differentiated normally into effector macrophages or dendritic cells but showed enhanced osteoclastogenesis, whereas CIITA ablation suppressed osteoclast differentiation. Increased c-fms and receptor activator of NF-κB (RANK) signaling underlay enhanced osteoclast differentiation from CIITA-overexpressing precursors. Moreover, by extending selected phenotypic and cellular analyses to additional genetic mouse models, namely MHC Class II deficient mice and a transgenic mouse line lacking a specific CIITA promoter and re-expressing CIITA in the thymus, we excluded MHC Class II expression and T cells from contributing to the observed skeletal phenotype. Altogether, our study provides compelling genetic evidence that CIITA, the molecular switch of antigen presentation, plays a novel, unexpected function in skeletal homeostasis, independent of MHC Class II expression and T cells, by exerting a selective and intrinsic control of osteoclast differentiation and bone resorption in vivo. © 2014 American Society for Bone and Mineral Research.

The histone-interacting domain of nuclear factor I activates simian virus 40 DNA replication in vivo.

Efficient initiation of SV40 DNA replication requires transcription factors that bind auxiliary sequences flanking the minimally required origin. To evaluate the possibility that transcription factors may activate SV40 replication by acting on the chromatin structure of the origin, we used an in vivo replication system in which we targeted GAL4 fusion proteins to the minimally required origin. We found that the proline-rich transcriptional activation domain of nuclear factor I (NF-I), which has been previously shown to interact with histone H3, specifically activates replication. Evaluation of a series of deletion and point mutants of NF-I indicates that the H3-binding domain and the replication activity coincide perfectly. Assays with other transcription factors, such as Sp1, confirmed the correlation between the interaction with H3 and the activation of replication. These findings imply that transcription factors such as NF-I can activate SV40 replication via direct interaction with chromatin components, thereby contributing to the relief of nucleosomal repression at the SV40 origin.

Simulação e análise econômica da produção in vivo e in vitro de embriões em bovinos

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das variáveis número de receptoras, protocolo de sincronização, indicadores de eficiência reprodutiva e custo da prenhez na eficiência econômica da produção in vivo e in vitro de embriões, em bovinos. Elaborou-se um aplicativo de simulação que permite ao usuário inserir os parâmetros das variáveis de entrada. Um cenário base, originado a partir de taxas tradicionais de eficiência das técnicas de produção in vivo (TE) e in vitro (PIVE) de embriões bovinos, foi introduzido no aplicativo de simulação como critério para comparação dos resultados. O aplicativo desenvolvido foi capaz de reproduzir os cenários de TE e PIVE. A produção de embriões foi simulada com o uso de simulação estocástica. Posteriormente determinou-se o número ótimo de receptoras por análise de sensibilidade. O valor presente líquido e o custo por prenhez foram utilizados como parâmetros de decisão. A sincronização para inovulação em tempo fixo reduziu a ociosidade de receptoras e, consequentemente, o custo final da prenhez em comparação à metodologia tradicional. A sexagem fetal deve estar associada à produção in vivo de embriões bovinos. Além disso, o número ótimo de receptoras por doadora é variável e dependente dos parâmetros de entrada do sistema.

Plac8 is required for white adipocyte differentiation in vitro and cell number control in vivo.

Plac8 belongs to an evolutionary conserved family of proteins, mostly abundant in plants where they control fruit weight through regulation of cell number. In mice, Plac8 is expressed both in white and brown adipose tissues and we previously showed that Plac8(-/-) mice develop late-onset obesity, with abnormal brown fat differentiation and reduced thermogenic capacity. We also showed that in brown adipocytes, Plac8 is an upstream regulator of C/EBPβ expression. Here, we first assessed the role of Plac8 in white adipogenesis in vitro. We show that Plac8 is induced early after induction of 3T3-L1 adipocytes differentiation, a process that is prevented by Plac8 knockdown; similarly, embryonic fibroblasts obtained from Plac8 knockout mice failed to form adipocytes upon stimulation of differentiation. Knockdown of Plac8 in 3T3-L1 was associated with reduced expression of C/EBPβ, Krox20, and Klf4, early regulators of the white adipogenic program, and we show that Plac8 could transactivate the C/EBPβ promoter. In vivo, we show that absence of Plac8 led to increased white fat mass with enlarged adipocytes but reduced total number of adipocytes. Finally, even though Plac8(-/-) mice showed impaired thermogenesis due to brown fat dysfunction, this was not associated with changes in glycemia or plasma free fatty acid and triglyceride levels. Collectively, these data indicate that Plac8 is an upstream regulator of C/EBPβ required for adipogenesis in vitro. However, in vivo, Plac8 is dispensable for the differentiation of white adipocytes with preserved fat storage capacity but is required for normal fat cell number regulation.

Recent advances in tumour antigen-specific therapy: in vivo veritas.

Modern cancer therapies should strive not only to eliminate malignant tissues but also to preserve healthy tissues and the patient's quality of life. Antigen-specific immunotherapy approaches are promising for either aspect since they are designed to only act against tissues expressing 1 or more specified tumour antigens. In order to develop successful vaccine and adoptive transfer protocols, longitudinal monitoring of cancer patients taking part in clinical trials is mandatory. Here, in vivo expansion of antigen-specific cells, as well as their ex vivo functional status represent important parameters to be analysed. To obtain results that most closely reflect the cells' in vivo status, functional assays must be carried out with as little in vitro culturing as possible. The present minireview discusses recent advances in these domains.