Use of constant denaturant capillary electrophoresis of pooled blood samples to identify single-nucleotide polymorphisms in the genes (Scnn1a and Scnn1b) encoding the alpha and beta subunits of the epithelial sodium channel.

BACKGROUND: The epithelial sodium channel (ENaC) is composed of three homologous subunits: alpha, beta, and gamma. Mutations in the Scnn1b and Scnn1g genes, which encode the beta and the gamma subunits of ENaC, cause a severe form of hypertension (Liddle syndrome). The contribution of genetic variants within the Scnn1a gene, which codes for the alpha subunit, has not been investigated. METHODS: We screened for mutations in the COOH termini of the alpha and beta subunits of ENaC. Blood from 184 individuals from 31 families participating in a study on the genetics of hypertension were analyzed. Exons 13 of Scnn1a and Scnn1b, which encode the second transmembrane segment and the COOH termini of alpha- and beta-ENaC, respectively, were amplified from pooled DNA samples of members of each family by PCR. Constant denaturant capillary electrophoresis (CDCE) was used to detect mutations in PCR products of the pooled DNA samples. RESULTS: The detection limit of CDCE for ENaC variants was 1%, indicating that all members of any family or up to 100 individuals can be analyzed in one CDCE run. CDCE profiles of the COOH terminus of alpha-ENaC in pooled family members showed that the 31 families belonged to four groups and identified families with genetic variants. Using this approach, we analyzed 31 rather than 184 samples. Individual CDCE analysis of members from families with different pooled CDCE profiles revealed five genotypes containing 1853G-->T and 1987A-->G polymorphisms. The presence of the mutations was confirmed by DNA sequencing. For the COOH terminus of beta-ENaC, only one family showed a different CDCE profile. Two members of this family (n = 5) were heterozygous at 1781C-->T (T594M). CONCLUSION: CDCE rapidly detects point mutations in these candidate disease genes.

Therapeutisches Drug-Monitoring in der Psychiatrie : Kurze Zusammenfassung des neuen Konsensuspapiers der Arbeitsgruppe TDM der AGNP [Therapeutic drug monitoring in psychiatry : A brief summary of the new consensus paper by the task force on TDM of the AGNP].

In October 2011 the Task Force Therapeutic Drug Monitoring of the Association for Neuropsychopharmacology and Pharmacopsychiatry (AGNP) published an update (Pharmacopsychiatry 2011, 44: 195-235) of the first version of the consensus paper on therapeutic drug monitoring (TDM) published in 2004. This article summarizes the essential statements to make them accessible to a wider readership in German speaking countries.

Study of biomacromolecule conformational changes by Scanning Force Microscopy

L?objectif de ce travail de thèse est l?étude des changements conformationels des biomacromolecules à l?échelle d?une molécule unique. Pour cela on a utilisé la Microscopie à Force Atomique (AFM) appliqué à l?étude des protéines et des acides nucléiques déposés sur une surface. Dans ce type de microscopie, une pointe très fine attachée à l?extrémité d?un levier est balayée au dessus d?une surface. L?interaction de la pointe avec la surface de l?échantillon induit la déflection du levier et ce phénomène permet de reconstruire la topographie de l?échantillon. Très importante dans cette technique est la possibilité de travailler en liquide. Cela permet de étudier les biomolécules en conditions quasi-physiologiques sans qu?elles perdent leur activité. On a étudié GroEL, la chaperonin de E.coli, qui est un homo oligomère avec une structure à double anneau qui joue un rôle très important dans le repliement des protéines dénaturées et celles qui viennent d?être synthétisées. En particulier on a focalisé notre attention sur la stabilité mécanique et sur les changements conformationels qui ont lieu pendant l?activité de GroEL. Une analyse détaillée des changements dans la stabilité mécanique et des effets produits par la liaison et l?hydrolyse de l?ATP est présentée dans ce travail. On a montré que le point le plus faible dans la structure de GroEL est l?interface entre les deux anneaux et que l?étape critique dans l?affaiblissement de la structure est l?hydrolyse de l?ATP. En ce qui concerne le changement conformationel, le passage d?une surface hydrophobe à hydrophile, induit par l?hydrolyse de l?ATP, a été montré. Ensuite on a étudié le changement dans la conformation et dans la topologie de l?ADN résultant de l?interaction avec des molécules spécifiques et en réponse à l?exposition des cellules de E.coli à des conditions de stress. Le niveau de surenroulement est un paramètre très sensible, de façon variée, à tous ces facteurs. Les cellules qui ont crus à de températures plus élevées que leur température optimale ont la tendance à diminuer le nombre de surenroulements négatif pour augmenter la stabilité thermique de leur plasmides. L?interaction avec des agents intercalant induit une transition d?un surenroulement négatif à un surenroulement positif d?une façon dépendante de la température. Finalement, l?effet de l?interaction de l?ADN avec des surfaces différentes a été étudié et une application pratique sur les noeuds d?ADN est présentée.<br/><br/>The aim of the present thesis work is to study the conformational changes of biomacromolecules at the single molecule level. To that end, Atomic Force Microcopy (AFM) imaging was performed on proteins and nucleic acids adsorbed onto a surface. In this microcopy technique a very sharp tip attached at the end of a soft cantilever is scanned over a surface, the interaction of the tip with the sample?s surface will induce the deflection of the cantilever and thus it will make possible to reconstruct the topography. A very important feature of AFM is the possibility to operate in liquid, it means with the sample immersed in a buffer solution. This allows one to study biomolecules in quasi-physiological conditions without loosing their activity. We have studied GroEL, the chaperonin of E.coli, which is a double-ring homooligomer which pays a very important role in the refolding of unfolded and newly synthetized polypeptides. In particular we focus our attention on its mechanical stability and on the conformational change that it undergoes during its activity cycle. A detailed analysis of the change in mechanical stability and how it is affected by the binding and hydrolysis of nucleotides is presented. It has been shown that the weak point of the chaperonin complex is the interface between the two rings and that the critical step to weaken the structure is the hydrolysis of ATP. Concerning the conformational change we have directly measured, with a nanometer scale resolution, the switching from a hydrophobic surface to a hydrophilic one taking place inside its cavity induced by the ATP hydrolysis. We have further studied the change in the DNA conformation and topology as a consequence of the interaction with specific DNA-binding molecules and the exposition of the E.coli cells to stress conditions. The level of supercoiling has been shown to be a very sensitive parameter, even if at different extents, to all these factors. Cells grown at temperatures higher than their optimum one tend to decrease the number of the negative superhelical turns in their plasmids in order to increase their thermal stability. The interaction with intercalating molecules induced a transition from positive to negative supercoiling in a temperature dependent way. The effect of the interaction of the DNA with different surfaces has been investigated and a practical application to DNA complex knots is reported.<br/><br/>Observer les objets biologiques en le touchant Schématiquement le Microscope a Force Atomique (AFM) consiste en une pointe très fine fixée a l?extrémité d?un levier Lors de l?imagerie, la pointe de l?AFM gratte la surface de l?échantillon, la topographie de celui-ci induit des déflections du levier qui sont enregistrées au moyen d?un rayon laser réfléchi par le levier. Ces donnés sont ensuit utilisés par un ordinateur pour reconstituer en 3D la surface de l?échantillon. La résolution de l?instrument est fonction entre autre de la dureté, de la rugosité de l?échantillon et de la forme de la pointe. Selon l?échantillon et la pointe utilisée la résolution de l?AFM peut aller de 0.1 A (sur des cristaux) a quelque dizaine de nanomètres (sur des cellules). Cet instrument est particulierment intéressant en biologie en raison de sa capacité à imager des échantillons immergés dans un liquide, c?est à dire dans des conditions quasiphysiologiques. Dans le cadre de ce travail nous avons étudié les changements conformationels de molécules biologiques soumises à des stimulations externes. Nous avons essentielment concentré notre attention sur des complexes protéiques nommé Chaperons Moléculaires et sur des molécules d?ADN circulaire (plasmides). Les Chaperons sont impliqués entre autre dans la résistance des organismes vivants aux stress thermiques et osmotiques. Leur activité consiste essentielment à aider les autres protéines à être bien pliés dans leur conformation finale et, en conséquence, à eviter que ils soient dénaturées et que ils puissent s?agréger. L?ADN, quant à lui est la molécule qui conserve, dans sa séquence, l?information génétique de tous les organismes vivants. Ce travail a spécifiquement concerné l?étude des changements conformationels des chaperonins suit a leur activation par l?ATP. Ces travaux ont montrés a l?échelle de molécule unique la capacité de ces protéines de changer leur surface de hydrophobique a hydrophilique. Nous avons également utilisé l?AFM pour étudier le changement du nombre des surenroulements des molécules d?ADN circulaire lors d?une exposition à un changement de température et de force ionique. Ces travaux ont permis de montrer comment la cellule regle le nombre de surenroulements dans ces molécules pour répondre et contrôler l?expression génétique même dans de conditions extrêmes. Pour les deux molécules en général, c?était très important d?avoir la possibilité de observer leur transitions d?une conformation a l?autre directement a l?échelle d?une seul molécule et, surtout, avec une résolution largement au dessous des la longueur d?onde de la lumière visible que représente le limite pour l?imagerie optique.

Mekanismien dynamiikan simuloinnissa sovellettavia numeerisia- ja mallinnusmenetelmiä

Koneet voidaan usein jakaa osajärjestelmiin, joita ovat ohjaus- ja säätöjärjestelmät, voimaa tuottavat toimilaitteet ja voiman välittävät mekanismit. Eri osajärjestelmiä on simuloitu tietokoneavusteisesti jo usean vuosikymmenen ajan. Osajärjestelmien yhdistäminen on kuitenkin uudempi ilmiö. Usein esimerkiksi mekanismien mallinnuksessa toimilaitteen tuottama voimaon kuvattu vakiona, tai ajan funktiona muuttuvana voimana. Vastaavasti toimilaitteiden analysoinnissa mekanismin toimilaitteeseen välittämä kuormitus on kuvattu vakiovoimana, tai ajan funktiona työkiertoa kuvaavana kuormituksena. Kun osajärjestelmät on erotettu toisistaan, on niiden välistenvuorovaikutuksien tarkastelu erittäin epätarkkaa. Samoin osajärjestelmän vaikutuksen huomioiminen koko järjestelmän käyttäytymissä on hankalaa. Mekanismien dynamiikan mallinnukseen on kehitetty erityisesti tietokoneille soveltuvia numeerisia mallinnusmenetelmiä. Useimmat menetelmistä perustuvat Lagrangen menetelmään, joka mahdollistaa vapaasti valittaviin koordinaattimuuttujiin perustuvan mallinnuksen. Numeerista ratkaisun mahdollistamiseksi menetelmän avulla muodostettua differentiaali-algebraaliyhtälöryhmää joudutaan muokkaamaan esim. derivoimalla rajoiteyhtälöitä kahteen kertaan. Menetelmän alkuperäisessä numeerisissa ratkaisuissa kaikki mekanismia kuvaavat yleistetyt koordinaatit integroidaan jokaisella aika-askeleella. Tästä perusmenetelmästä johdetuissa menetelmissä riippumattomat yleistetyt koordinaatit joko integroidaan ja riippuvat koordinaatit ratkaistaan rajoiteyhtälöiden perusteella tai yhtälöryhmän kokoa pienennetään esim. käyttämällä nopeus- ja kiihtyvyysanalyyseissä eri kiertymäkoordinaatteja kuin asema-analyysissä. Useimmat integrointimenetelmät on alun perin tarkoitettu differentiaaliyhtälöiden (ODE) ratkaisuunjolloin yhtälöryhmään liitetyt niveliä kuvaavat algebraaliset rajoiteyhtälöt saattavat aiheuttaa ongelmia. Nivelrajoitteiden virheiden korjaus, stabilointi, on erittäin tärkeää mekanismien dynamiikan simuloinnin onnistumisen ja tulosten oikeellisuuden kannalta. Mallinnusmenetelmien johtamisessa käytetyn virtuaalisen työn periaatteen oletuksena nimittäin on, etteivät rajoitevoimat tee työtä, eli rajoitteiden vastaista siirtymää ei tapahdu. Varsinkaan monimutkaisten järjestelmien pidemmissä analyyseissä nivelrajoitteet eivät toteudu tarkasti. Tällöin järjestelmän energiatasapainoei toteudu ja järjestelmään muodostuu virtuaalista energiaa, joka rikkoo virtuaalisen työn periaatetta, Tästä syystä tulokset eivät enää pidäpaikkaansa. Tässä raportissa tarkastellaan erityyppisiä mallinnus- ja ratkaisumenetelmiä, ja vertaillaan niiden toimivuutta yksinkertaisten mekanismien numeerisessa ratkaisussa. Menetelmien toimivuutta tarkastellaan ratkaisun tehokkuuden, nivelrajoitteiden toteutumisen ja energiatasapainon säilymisen kannalta.

Experimental and Numerical Analysis of Different Volutes in a Centrifugal Compressor

In a centrifugal compressor the flow around the diffuser is collected and led to the pipe system by a spiral-shaped volute. In this study a single-stage centrifugal compressor with three different volutes is investigated. The compressorwas first equipped with the original volute, the cross-section of which was a combination of a rectangle and semi-circle. Next a new volute with a fully circular cross-section was designed and manufactured. Finally, the circular volute wasmodified by rounding the tongue and smoothing the tongue area. The overall performance of the compressor as well as the static pressure distribution after the impeller and on the volute surface were measured. The flow entering the volute was measured using a three-hole Cobra-probe, and flow visualisations were carriedout in the exit cone of the volute. In addition, the radial force acting on theimpeller was measured using magnetic bearings. The complete compressor with thecircular volute (inlet pipe, full impeller, diffuser, volute and outlet pipe) was also modelled using computational fluid dynamics (CFD). A fully 3-D viscous flow was solved using a Navier-Stokes solver, Finflo, developed at Helsinki University of Technology. Chien's k-e model was used to take account of the turbulence. The differences observed in the performance of the different volutes were quite small. The biggest differences were at low speeds and high volume flows,i.e. when the flow entered the volute most radially. In this operating regime the efficiency of the compressor with the modified circular volute was about two percentage points higher than with the other volutes. Also, according to the Cobra-probe measurements and flow visualisations, the modified circular volute performed better than the other volutes in this operating area. The circumferential static pressure distribution in the volute showed increases at low flow, constant distribution at the design flow and decrease at high flow. The non-uniform static pressure distribution of the volute was transmitted backwards across the vaneless diffuser and observed at the impeller exit. At low volume flow a strong two-wave pattern developed into the static pressure distribution at the impeller exit due to the response of the impeller to the non-uniformity of pressure. The radial force of the impeller was the greatest at the choke limit, the smallest atthe design flow, and moderate at low flow. At low flow the force increase was quite mild, whereas the increase at high flow was rapid. Thus, the non-uniformityof pressure and the force related to it are strong especially at high flow. Theforce caused by the modified circular volute was weaker at choke and more symmetric as a function of the volume flow than the force caused by the other volutes.

Potentiometric titration as a method of determining the stoichiometric dissociation constants of weak acids from the thermodynamic dissociation constants of aqueous solutions at 298.15 K

The simple single-ion activity coefficient equation originating from the Debye-Hückel theory was used to determine the thermodynamic and stoichiometric dissociation constants of weak acids from data concerning galvanic cells. Electromotive force data from galvanic cells without liquid junctions, which was obtained from literature, was studied in conjuction with the potentiometric titration data relating to aqueous solutions at 298.15 K. The dissociation constants of weak acids could be determined by the presented techniques and almost all the experimental data studied could be interpreted within the range of experimental error. Potentiometric titration has been used here and the calculation methods were developed to obtain the thermodynamic and stoichiometric dissociation constants of some weak acids in aqueous solutions at 298.15 K. The ionic strength of titrated solutions were adjusted using an inert electrolyte, namely, sodium or potassium chloride. Salt content alonedetermines the ionic strength. The ionic strength of the solutions studied varied from 0.059 mol kg-1 to 0.37 mol kg-1, and in some cases up to 1.0 mol kg-1. The following substances were investigated using potentiometric titration: aceticacid, propionic acid, L-aspartic acid, L-glutamic acid and bis(2,2-dimethyl-3-oxopropanol) amine.