Posttranscriptional modification of retroviral primers is required for late stages of DNA replication

During reverse transcription of retroviral RNA, synthesis of (−) strand DNA is primed by a cellular tRNA that anneals to an 18-nt primer binding site within the 5′ long terminal repeat. For (+) strand synthesis using a (−) strand DNA template linked to the tRNA primer, only the first 18 nt of tRNA are replicated to regenerate the primer binding site, creating the (+) strand strong stop DNA intermediate and providing a 3′ terminus capable of strand transfer and further elongation. On model HIV templates that approximate the (−) strand linked to natural modified or synthetic unmodified tRNA3Lys, we find that a (+) strand strong stop intermediate of the proper length is generated only on templates containing the natural, modified tRNA3Lys, suggesting that a posttranscriptional modification provides the termination signal. In the presence of a recipient template, synthesis after strand transfer occurs only from intermediates generated from templates containing modified tRNA3Lys. Reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus and avian myoblastosis virus shows the same requirement for a modified tRNA3Lys template. Because all retroviral tRNA primers contain the same 1-methyl-A58 modification, our results suggest that 1-methyl-A58 is generally required for termination of replication 18 nt into the tRNA sequence, generating the (+) strand intermediate, strand transfer, and subsequent synthesis of the entire (+) strand. The possibility that the host methyl transferase responsible for methylating A58 may provide a target for HIV chemotherapy is discussed.

An in vivo membrane fusion assay implicates SpoIIIE in the final stages of engulfment during Bacillus subtilis sporulation

Shortly after the synthesis of the two cells required for sporulation in Bacillus subtilis, the membranes of the larger mother cell begin to migrate around and engulf the smaller forespore cell. At the completion of this process the leading edges of the migrating membrane meet and fuse, releasing the forespore into the mother cell cytoplasm. We developed a fluorescent membrane stain-based assay for this membrane fusion event, and we isolated mutants defective in the final stages of engulfment or membrane fusion. All had defects in spoIIIE, which is required for translocation of the forespore chromosome across the polar septum. We isolated one spoIIIE mutant severely defective in chromosome translocation, but not in membrane fusion; this mutation disrupts the ATP/GTP-binding site of SpoIIIE, suggesting that ATP binding and hydrolysis are required for DNA translocation but not for the late engulfment function of SpoIIIE. We also correlated relocalization of SpoIIIE-green fluorescent protein from the sporulation septum to the forespore pole with the completion of membrane fusion and engulfment. We suggest that SpoIIIE is required for the final steps of engulfment and that it may regulate or catalyze membrane fusion events.

Somatic Cell Mutants Resistant to Retrovirus Replication: Intracellular Blocks during the Early Stages of Infection

To identify cellular functions involved in the early phase of the retroviral life cycle, somatic cell mutants were isolated after selection for resistance to infection. Rat2 fibroblasts were treated with chemical mutagens, and individual virus-resistant clones were recovered after selection for resistance to infection. Two clones were characterized in detail. Both mutant lines were resistant to infection by both ecotropic and amphotropic murine viruses, as well as by human immunodeficiency virus type 1 pseudotypes. One clone showed a strong block to reverse transcription of the retroviral RNA, including formation of the earliest DNA products. The second clone showed normal levels of viral DNA synthesis but did not allow formation of the circular DNAs normally found in the nucleus. Cell fractionation showed that the viral preintegration complex was present in a form that could not be extracted under conditions that readily extracted the complex from wild-type cells. The results suggest that the DNA was trapped in a nonproductive state and excluded from the nucleus of the infected cell. The properties of these two mutant lines suggest that host gene products play important roles both before and after reverse transcription.

Comparison of the early stages of forced unfolding for fibronectin type III modules

The structural changes accompanying stretch-induced early unfolding events were investigated for the four type III fibronectin (FN-III) modules, FN-III7, FN-III8, FN-III9, and FN-III10 by using steered molecular dynamics. Simulations revealed that two main energy barriers, I and II, have to be overcome to initiate unraveling of FN-III's tertiary structure. In crossing the first barrier, the two opposing β-sheets of FN-III are rotated against each other such that the β-strands of both β-sheets align parallel to the force vector (aligned state). All further events in the unfolding pathway proceed from this intermediate state. A second energy barrier has to be overcome to break the first major cluster of hydrogen bonds between adjacent β-strands. Simulations revealed that the height of barrier I varied significantly among the four modules studied, being largest for FN-III7 and lowest for FN-III10, whereas the height of barrier II showed little variation. Key residues affecting the mechanical stability of FN-III modules were identified. These results suggest that FN-III modules can be prestretched into an intermediate state with only minor changes to their tertiary structures. FN-III10, for example, extends 12 Å from the native “twisted” to the intermediate aligned state, and an additional 10 Å from the aligned state to further unfolding where the first β-strand is peeled away. The implications of the existence of intermediate states regarding the elasticity of fibrillar fibers and the stretch-induced exposure of cryptic sites are discussed.

Rates of nucleotide substitution in sexual and anciently asexual rotifers

The class Bdelloidea of the phylum Rotifera is the largest well studied eukaryotic taxon in which males and meiosis are unknown, and the only one for which these indications of ancient asexuality are supported by cytological and molecular genetic evidence. We estimated the rates of synonymous and nonsynonymous substitutions in the hsp82 heat shock gene in bdelloids and in facultatively sexual rotifers of the class Monogononta, employing distance based and maximum likelihood methods. Relative-rate tests, using acanthocephalan rotifers as an outgroup, showed slightly higher rates of nonsynonymous substitution and slightly lower rates of synonymous substitution in bdelloids as compared with monogononts. The opposite trend, however, was seen in intraclass pairwise comparisons. If, as it seems, bdelloids have evolved asexually, an equality of bdelloid and monogonont substitution rates would suggest that the maintenance of sexual reproduction in monogononts is not attributable to an effect of sexual reproduction in limiting the load of deleterious nucleotide substitutions.

Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocrea jecorina.

The relationship of the important cellulase producing asexual fungus Trichoderma reesei to its putative teleomorphic (sexual) ancestor Hypocrea jecorina and other species of the Trichoderma sect. Longibrachiatum was studied by PCR-fingerprinting and sequence analyses of the nuclear ribosomal DNA region containing the internal transcribed spacers (ITS-1 and ITS-2) and the 5.8S rRNA gene. The differences in the corresponding ITS sequences allowed a grouping of anamorphic (asexual) species of Trichoderma sect. Longibrachiatum into Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, and Trichoderma reesei. The sexual species Hypocrea schweinitzii and H. jecorina were also clearly separated from each other. H. jecorina and T. reesei exhibited identical sequences, suggesting close relatedness or even species identity. Intraspecific and interspecific variation in the PCR-fingerprinting patterns supported the differentiation of species based on ITS sequences, the grouping of the strains, and the assignment of these strains to individual species. The variations between T. reesei and H. jecorina were at the same order of magnitude as found between all strains of H. jecorina, but much lower than the observed interspecific variations. Identical ITS sequences and the high similarity of PCR-fingerprinting patterns indicate a very close relationship between T. reesei and H. jecorina, whereas differences of the ITS sequences and the PCR-fingerprinting patterns show a clear phylogenetic distance between T. reesei/H. jecorina and T. longibrachiatum. T. reesei is considered to be an asexual, clonal line derived from a population of the tropical ascomycete H. jecorina.

Development of Valpha4+ NK T cells in the early stages of embryogenesis.

The majority of T lymphocytes start to develop at around day 15 of gestation (d15)-d17 in the thymus and comprise the peripheral repertoire characterized by the expression of polymorphic T-cell antigen receptors (TCRs). Contrary to these conventional T cells, a subset of T cells, called natural killer (NK) T cells (most of them expressing an invariant TCR encoded by the Valpha14Jalpha281 gene with a 1-nt N-region), preferentially differentiates extrathymically and dominates the peripheral T-cell population at a high frequency (5% in splenic T cells and 40% in bone marrow T cells). Here, we investigated the development of NK T cells and found that the invariant Valpha14+ TCR transcripts and the circular DNA created by Valpha14 and Jalpha281 gene rearrangements can be detected in the embryo body at d9.5 of gestation and in the yolk sac and the fetal liver at d11.5-d13.5 of gestation, but not in the thymus, whereas T cells with Valpha1+ TCR expression, a major population in the thymus, were not observed at these early stages of gestation. Fluorescence-activated cell sorter analysis also demonstrated that there exist CD3+ alpha beta+ T cells, almost all of which are Valpha14/Vbeta8+ NK+ T cells, during early embryogenesis. To our knowledge, this demonstrates for the first time that a T lymphocyte subset develops in extrathymic tissues during the early stages of embryogenesis.

The Golgi apparatus of spinal cord motor neurons in transgenic mice expressing mutant Cu,Zn superoxide dismutase becomes fragmented in early, preclinical stages of the disease.

Dominant mutations of the SOD1 gene encoding Cu,Zn superoxide dismutase have been found in members of certain families with familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS). To better understand the contribution of SOD1 mutations in the pathogenesis of familial ALS, we developed transgenic mice expressing one of the mutations found in familial ALS. These animals display clinical and pathological features closely resembling human ALS. Early changes observed in these animals were intra-axonal and dendritic vacuoles due to dilatation of the endoplasmic reticulum and vacuolar degeneration of mitochondria. We have reported that the Golgi apparatus of spinal cord motor neurons in patients with sporadic ALS is fragmented and atrophic. In this study we show that spinal cord motor neurons of transgenic mice for an SOD1 mutation display a lesion of the Golgi apparatus identical to that found in humans with sporadic ALS. In these mice, the stacks of the cisternae of the fragmented Golgi apparatus are shorter than in the normal organelle, and there is a reduction in Golgi-associated vesicles and adjacent cisternae of the rough endoplasmic reticulum. Furthermore, the fragmentation of the Golgi apparatus occurs in an early, presymptomatic stage and usually precedes the development of the vacuolar changes. Transgenic mice overexpressing the wild-type human superoxide dismutase are normal. In familial ALS, an early lesion of the Golgi apparatus of motor neurons may have adverse functional effects, because newly synthesized proteins destined for fast axoplasmic transport pass through the Golgi apparatus.

Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes: mechanisms and evolution.

In nearly all eukaryotes, at least some individuals inherit mitochondrial and chloroplast genes from only one parent. There is no single mechanism of uniparental inheritance: organelle gene inheritance is blocked by a variety of mechanisms and at different stages of reproduction in different species. Frequent changes in the pattern of organelle gene inheritance during evolution suggest that it is subject to varying selective pressures. Organelle genes often fail to recombine even when inherited biparentally; consequently, their inheritance is asexual. Sexual reproduction is apparently less important for genes in organelles than for nuclear genes, probably because there are fewer of them. As a result organelle sex can be lost because of selection for special reproductive features such as oogamy or because uniparental inheritance reduces the spread of cytoplasmic parasites and selfish organelle DNA.

The vertebrate alcohol dehydrogenase system: variable class II type form elucidates separate stages of enzymogenesis.

A mixed-class alcohol dehydrogenase has been characterized from avian liver. Its functional properties resemble the classical class I type enzyme in livers of humans and animals by exhibiting low Km and kcat values with alcohols (Km = 0.7 mM with ethanol) and low Ki values with 4-methylpyrazole (4 microM). These values are markedly different from corresponding parameters of class II and III enzymes. In contrast, the primary structure of this avian liver alcohol dehydrogenase reveals an overall relationship closer to class II and to some extent class III (69 and 65% residue identities, respectively) than to class I or the other classes of the human alcohol dehydrogenases (52-61%), the presence of an insertion (four positions in a segment close to position 120) as in class II but in no other class of the human enzymes, and the presence of several active site residues considered typical of the class II enzyme. Hence, the avian enzyme has mixed-class properties, being functionally similar to class I, yet structurally similar to class II, with which it also clusters in phylogenetic trees of characterized vertebrate alcohol dehydrogenases. Comparisons reveal that the class II enzyme is approximately 25% more variable than the "variable" class I enzyme, which itself is more variable than the "constant" class III enzyme. The overall extreme, and the unusual chromatographic behavior may explain why the class II enzyme has previously not been found outside mammals. The properties define a consistent pattern with apparently repeated generation of novel enzyme activities after separate gene duplications.

Changes in expression of putative antigens encoded by pigment genes in mouse melanomas at different stages of malignant progression.

Cutaneous melanomas of Tyr-SV40E transgenic mice (mice whose transgene consists of the tyrosinase promoter fused to the coding regions of simian virus 40 early genes) strikingly resemble human melanomas in their development and progression. Unlike human melanomas, the mouse tumors all arise in genetically identical individuals, thereby better enabling expression of specific genes to be characterized in relation to advancing malignancy. The products of pigment genes are of particular interest because peptides derived from these proteins have been reported to function as autoantigens with immunotherapeutic potential in some melanoma patients. However, the diminished pigmentation characteristic of many advanced melanomas raises the possibility that some of the relevant products may no longer be expressed in the most malignant cells. We have therefore investigated the contributions of several pigment genes in melanotic vs. relatively amelanotic components of primary and metastatic mouse melanomas. The analyses reveal marked differences within and among tumors in levels of mRNAs and proteins encoded by the wild-type alleles at the albino, brown, slaty, and silver loci. Tyrosinase (the protein encoded by the albino locus) was most often either absent or undetectable as melanization declined. The protein encoded by the slaty locus (tyrosinase-related protein 2) was the only one of those tested that was clearly present in all the tumor samples. These results suggest that sole reliance on targeting tyrosinase-based antigens might selectively favor survival of more malignant cells, whereas targeting the ensemble of the antigens tested might contribute toward a more inclusive and effective antimelanoma strategy.

Priming of tumor-specific T cells in the draining lymph nodes after immunization with interleukin 2-secreting tumor cells: three consecutive stages may be required for successful tumor vaccination.

Although both CD4+ and CD8+ T cells are clearly required to generate long-lasting anti-tumor immunity induced by s.c. vaccination with interleukin 2 (IL-2)-transfected, irradiated M-3 clone murine melanoma cells, some controversy continues about the site and mode of T-cell activation in this system. Macrophages, granulocytes, and natural killer cells infiltrate the vaccination site early after injection into either syngeneic euthymic DBA/2 mice or athymic nude mice and eliminate the inoculum within 48 hr. We could not find T cells at the vaccination site, which argues against the concept that T-cell priming by the IL-2-secreting cancer cells occurs directly at that location. However, reverse transcription-PCR revealed transcripts indicative of T-cell activation and expansion in the draining lymph nodes of mice immunized with the IL-2-secreting vaccine but not in mice vaccinated with untransfected, irradiated M-3 cells. We therefore propose that the antigen-presenting cells, which invade the vaccination site, process tumor-derived antigens and, subsequently, initiate priming of tumor-specific T lymphocytes in lymphoid organs. These findings suggest a three-stage process for the generation of effector T cells after vaccination with IL-2-secreting tumor cells: (i) tumor-antigen uptake and processing at the site of injection by antigen-presenting cells, (ii) migration of antigen-presenting cells into the regional draining lymph nodes, where T-cell priming occurs, and (iii) circulation of activated T cells that either perform or initiate effector mechanisms leading to tumor cell destruction.

La riproduzione nei rettili: nuove prospettive e sviluppi futuri

L’allevamento in cattività dei rettili è in costante crescita negli ultimi anni e richiede conoscenze mediche sempre più specialistiche per far fronte ai numerosi problemi legati a questi animali. Il corretto approccio medico prevede una profonda conoscenza delle specie prese in esame dal momento che la maggior parte delle problematiche riproduttive di questi animali sono legate ad una non corretta gestione dei riproduttori. L’apparato riproduttore dei rettili è estremamente vario a seconda delle specie prese in considerazione. Sauri ed ofidi possiedono due organi copulatori denominati emipeni e posizionati alla base della coda caudalmente alla cloaca che vengono estroflessi alternativamente durante l’accoppiamento per veicolare lo spera all’interno della cloaca della femmina. In questi animali il segmento posteriore renale è chiamato segmento sessuale, perché contribuisce alla formazione del fluido seminale. Tale porzione, durante la stagione dell’accoppiamento, diventa più voluminosa e cambia drasticamente colore, tanto che può essere confusa con una manifestazione patologica. I cheloni al contrario possiedono un unico pene che non viene coinvolto nella minzione. In questi animali. I testicoli sono due e sono situati all’interno della cavità celomatica in posizione cranioventrale rispetto ai reni. I testicoli possono variare notevolmente sia come forma che come dimensione a seconda del periodo dell’anno. Il ciclo estrale dei rettili è regolato, come pure nei mammiferi, dagli ormoni steroidei. La variazione di questi ormoni a livello ematico è stata studiato da diversi autori con il risultato di aver dimostrato come la variazione dei dosaggi degli stessi determini l’alternanza delle varie fasi del ciclo riproduttivo. La relazione tra presenza di uova (anche placentari) ed alti livelli di progesterone suggerisce che questo ormone gioca un ruolo importante nelle riproduzione delle specie ovipare per esempio stimolando la vascolarizzazione degli ovidutti durante i tre mesi in cui si ha lo sviluppo delle uova. Il 17-beta estradiolo è stato descritto come un ormone vitellogenico grazie alla sua capacità di promuovere lo sviluppo dei follicoli e la formazione di strati protettivi dell’uovo. L’aumento del livello di estradiolo osservato esclusivamente nelle femmine in fase vitellogenica è direttamente responsabile della mobilizzazione delle riserve materne in questa fase del ciclo. Va sottolineato come il progesterone sia in effetti un antagonista dell’estradiolo, riducendo la vitellogenesi e intensificando gli scambi materno fetali a livello di ovidutto. Le prostaglandine (PG) costituiscono un gruppo di molecole di origine lipidica biologicamente attive, sintetizzate sotto varie forme chimiche. Sono noti numerosi gruppi di prostaglandine ed è risputo che pesci, anfibi, rettili e mammiferi sintetizzano una o più prostaglandine partendo da acidi grassi precursori. Queste sostanze anche nei rettili agiscono sulla mucosa dell’utero aumentandone le contrazioni e sui corpi lutei determinandone la lisi. La maturità sessuale dei rettili, dipende principalmente dalla taglia piuttosto che dall’età effettiva dell’animale. In cattività, l’alimentazione e le cure dell’allevatore, possono giocare un ruolo fondamentale nel raggiungimento della taglia necessaria all’animale per maturare sessualmente. Spesso, un animale d’allevamento raggiunge prima la maturità sessuale rispetto ai suoi simili in natura. La maggior parte dei rettili sono ovipari, ovvero depongono uova con guscio sulla sabbia o in nidi creati appositamente. La condizione di ovoviviparità è riscontrabile in alcuni rettili. Le uova, in questo caso, vengono ritenute all’interno del corpo, fino alla nascita della progenie. Questa può essere considerata una strategia evolutiva di alcuni animali, che in condizioni climatiche favorevoli effettuano l’ovo deposizione, ma se il clima non lo permette, ritengono le uova fino alla nascita della prole. Alcuni serpenti e lucertole sono vivipari, ciò significa che l’embrione si sviluppa all’interno del corpo dell’animale e che è presente una placenta. I piccoli fuoriescono dal corpo dell’animale vivi e reattivi. La partenogenesi è una modalità di riproduzione asessuata, in cui si ha lo sviluppo dell’uovo senza che sia avvenuta la fecondazione. Trenta specie di lucertole e alcuni serpenti possono riprodursi con questo metodo. Cnemidophorus uniparens, C. velox e C. teselatus alternano la partenogenesi a una riproduzione sessuata, a seconda della disponibilità del maschio. La maggior parte dei rettili non mostra alcuna cura materna per le uova o per i piccoli che vengono abbandonati al momento della nascita. Esistono tuttavia eccezioni a questa regola generale infatti alcune specie di pitoni covano le uova fino al momento della schiusa proteggendole dai predatori e garantendo la giusta temperatura e umidità. Comportamenti di guardia al nido sono poi stati documentati in numerosi rettili, sia cheloni che sauri che ofidi. Nella maggior parte delle tartarughe, la riproduzione è legata alla stagione. Condizioni favorevoli, possono essere la stagione primaverile nelle zone temperate o la stagione umida nelle aree tropicali. In cattività, per riprodurre queste condizioni, è necessario fornire, dopo un periodo di ibernazione, un aumento del fotoperiodo e della temperatura. L’ atteggiamento del maschio durante il corteggiamento è di notevole aggressività, sia nei confronti degli altri maschi, con i quali combatte copiosamente, colpendoli con la corazza e cercando di rovesciare sul dorso l’avversario, sia nei confronti della femmina. Infatti prima della copulazione, il maschio insegue la femmina, la sperona, la morde alla testa e alle zampe e infine la immobilizza contro un ostacolo. Il comportamento durante la gravidanza è facilmente riconoscibile. La femmina tende ad essere molto agitata, è aggressiva nei confronti delle altre femmine e inizia a scavare buche due settimane prima della deposizione. La femmina gravida costruisce il nido in diverse ore. Scava, con gli arti anteriori, buche nel terreno e vi depone le uova, ricoprendole di terriccio e foglie con gli arti posteriori. A volte, le tartarughe possono trattenere le uova, arrestando lo sviluppo embrionale della prole per anni quando non trovano le condizioni adatte a nidificare. Lo sperma, inoltre, può essere immagazzinato nell’ovidotto fino a sei anni, quindi la deposizione di uova fertilizzate può verificarsi senza che sia avvenuto l’accoppiamento durante quel ciclo riproduttivo. I comportamenti riproduttivi di tutte le specie di lucertole dipendono principalmente dalla variazione stagionale, correlata al cambiamento di temperatura e del fotoperiodo. Per questo, se si vuole far riprodurre questi animali in cattività, è necessario valutare per ogni specie una temperatura e un’illuminazione adeguata. Durante il periodo riproduttivo, un atteggiamento caratteristico di diverse specie di lucertole è quello di riprodurre particolari danze e movimenti ritmici della testa. In alcune specie, possiamo notare il gesto di estendere e retrarre il gozzo per mettere in evidenza la sua brillante colorazione e richiamare l’attenzione della femmina. L’aggressività dei maschi, durante la stagione dell’accoppiamento, è molto evidente, in alcuni casi però, anche le femmine tendono ad essere aggressive nei confronti delle altre femmine, specialmente durante l’ovo deposizione. La fertilizzazione è interna e durante la copulazione, gli spermatozoi sono depositati nella porzione anteriore della cloaca femminile, si spostano successivamente verso l’alto, dirigendosi nell’ovidotto, in circa 24-48 ore; qui, fertilizzano le uova che sono rilasciate nell’ovidotto dall’ovario. Negli ofidi il corteggiamento è molto importante e i comportamenti durante questa fase possono essere diversi da specie a specie. I feromoni specie specifici giocano un ruolo fondamentale nell’attrazione del partner, in particolar modo in colubridi e crotalidi. La femmina di queste specie emette una traccia odorifera, percepita e seguita dal maschio. Prima dell’accoppiamento, inoltre, il maschio si avvicina alla femmina e con la sua lingua bifida o con il mento, ne percorre tutto il corpo per captare i feromoni. Dopo tale comportamento, avviene la copulazione vera e propria con la apposizione delle cloache; gli emipeni vengono utilizzati alternativamente e volontariamente dal maschio. Durante l’ovulazione, il serpente aumenterà di volume nella sua metà posteriore e contrazioni muscolari favoriranno lo spostamento delle uova negli ovidotti. In generale, se l’animale è oviparo, avverrà una muta precedente alla ovo deposizione, che avviene prevalentemente di notte. Gli spermatozoi dei rettili sono morfologicamente simili a quelli di forme superiori di invertebrati. La fecondazione delle uova, da parte di spermatozoi immagazzinati nel tratto riproduttivo femminile, è solitamente possibile anche dopo mesi o perfino anni dall’accoppiamento. La ritenzione dei gameti maschili vitali è detta amphigonia retardata e si ritiene che questa caratteristica offra molti benefici per la sopravvivenza delle specie essendo un adattamento molto utile alle condizioni ambientali quando c’è una relativa scarsità di maschi conspecifici disponibili. Nell’allevamento dei rettili in cattività un accurato monitoraggio dei riproduttori presenta una duplice importanza. Permette di sopperire ad eventuali errori di management nel caso di mancata fertilizzazione e inoltre permette di capire quale sia il grado di sviluppo del prodotto del concepimento e quindi di stabilire quale sia il giorno previsto per la deposizione. Le moderne tecniche di monitoraggio e l’esperienza acquisita in questi ultimi anni permettono inoltre di valutare in modo preciso lo sviluppo follicolare e quindi di stabilire quale sia il periodo migliore per l’accoppiamento. Il dimorfismo sessuale nei serpenti è raro e anche quando presente è poco evidente. Solitamente nei maschi, la coda risulta essere più larga rispetto a quella della femmina in quanto nel segmento post-cloacale vi sono alloggiati gli emipeni. Il maschio inoltre, è generalmente più piccolo della femmina a parità di età. Molti cheloni sono sessualmente dimorfici sebbene i caratteri sessuali secondari siano poco apprezzabili nei soggetti giovani e diventino più evidenti dopo la pubertà. In alcune specie si deve aspettare per più di 10 anni prima che il dimorfismo sia evidente. Le tartarughe di sesso maschile tendono ad avere un pene di grosse dimensioni che può essere estroflesso in caso di situazioni particolarmente stressanti. I maschi sessualmente maturi di molte specie di tartarughe inoltre tendono ad avere una coda più lunga e più spessa rispetto alle femmine di pari dimensioni e la distanza tra il margine caudale del piastrone e l’apertura cloacale è maggiore rispetto alle femmine. Sebbene la determinazione del sesso sia spesso difficile nei soggetti giovani molti sauri adulti hanno dimorfismo sessuale evidente. Nonostante tutto comunque anche tra i sauri esistono molte specie come per esempio Tiliqua scincoides, Tiliqua intermedia, Gerrhosaurus major e Pogona vitticeps che anche in età adulta non mostrano alcun carattere sessuale secondario evidente rendendone molto difficile il riconoscimento del sesso. Per garantire un riconoscimento del sesso degli animali sono state messe a punto diverse tecniche di sessaggio che variano a seconda della specie presa in esame. L’eversione manuale degli emipeni è la più comune metodica utilizzata per il sessaggio dei giovani ofidi ed in particolare dei colubridi. I limiti di questa tecnica sono legati al fatto che può essere considerata attendibile al 100% solo nel caso di maschi riconosciuti positivi. L’eversione idrostatica degli emipeni esattamente come l’eversione manuale degli emipeni si basa sull’estroflessione di questi organi dalla base della coda, pertanto può essere utilizzata solo negli ofidi e in alcuni sauri. La procedura prevede l’iniezione di fluido sterile (preferibilmente soluzione salina isotonica) nella coda caudalmente all’eventuale posizione degli emipeni. Questa tecnica deve essere eseguita solo in casi eccezionali in quanto non è scevra da rischi. L’utilizzo di sonde cloacali è il principale metodo di sessaggio per gli ofidi adulti e per i sauri di grosse dimensioni. Per questa metodica si utilizzano sonde metalliche dello spessore adeguato al paziente e con punta smussa. Nei soggetti di genere maschile la sonda penetra agevolmente al contrario di quello che accade nelle femmine. Anche gli esami radiografici possono rendersi utili per il sessaggio di alcune specie di Varani (Varanus achanturus, V. komodoensis, V. olivaceus, V. gouldi, V. salvadorii ecc.) in quanto questi animali possiedono zone di mineralizzazione dei tessuti molli (“hemibacula”) che possono essere facilmente individuate nei maschi. Diversi studi riportano come il rapporto tra estradiolo e androgeni nel plasma o nel liquido amniotico sia un possibile metodo per identificare il genere sessuale delle tartarughe. Per effettuare il dosaggio ormonale, è necessario prelevare un campione di sangue di almeno 1 ml ad animale aspetto che rende praticamente impossibile utilizzare questo metodo di sessaggio nelle tartarughe molto piccole e nei neonati. L’ecografia, volta al ritrovamento degli emipeni, sembra essere un metodo molto preciso, per la determinazione del sesso nei serpenti. Uno studio compiuto presso il dipartimento di Scienze Medico Veterinarie dell’Università di Parma, ha dimostrato come questo metodo abbia una sensibilità, una specificità e un valore predittivo positivo e negativo pari al 100%. La radiografia con mezzo di contrasto e la tomografia computerizzata possono essere utilizzate nel sessaggio dei sauri, con buoni risultati. Uno studio, compiuto dal dipartimento di Scienze Medico Veterinarie, dell’Università di Parma, ha voluto mettere a confronto diverse tecniche di sessaggio nei sauri, tra cui l’ecografia, la radiografia con e senza mezzo di contrasto e la tomografia computerizzata con e senza mezzo di contrasto. I risultati ottenuti, hanno dimostrato come l’ecografia non sia il mezzo più affidabile per il riconoscimento degli emipeni e quindi del sesso dell’animale, mentre la radiografia e la tomografia computerizza con mezzo di contrasto siano tecniche affidabili e accurate in queste specie. Un metodo valido e facilmente realizzabile per il sessaggio dei cheloni anche prepuberi è la cistoscopia. In un recente studio la cistoscopia è stata effettuata su quindici cheloni deceduti e venticinque cheloni vivi, anestetizzati. In generale, questo metodo si è dimostrato non invasivo per le tartarughe, facilmente ripetibile in diversi tipi di tartarughe e di breve durata. Tra le principali patologie riproduttive dei rettili le distocie sono sicuramente quelle che presentano una maggior frequenza. Quando si parla di distocia nei rettili, si intendono tutte quelle situazioni in cui si ha una mancata espulsione e deposizione del prodotto del concepimento entro tempi fisiologici. Questa patologia è complessa e può dipendere da diverse cause. Inoltre può sfociare in malattie sistemiche a volte molto severe. Le distocie possono essere classificate in ostruttive e non ostruttive in base alle cause. Si parla di distocia ostruttiva quando si verificano delle condizioni per cui viene impedito il corretto passaggio delle uova lungo il tratto riproduttivo (Fig.13). Le cause possono dipendere dalla madre o dalle caratteristiche delle uova. Nel caso di distocia non ostruttiva le uova rinvenute sono solitamente di dimensioni normali e la conformazione anatomica della madre è fisiologica. L’eziologia è da ricercare in difetti comportamentali, ambientali e patologici. Non esistono sintomi specifici e patognomonici di distocia. La malattia diviene evidente e conclamata solamente in presenza di complicazioni. Gli approcci terapeutici possibili sono vari a seconda della specie animale e della situazione. Fornire un’area adeguata per la nidiata: se la distocia non è ostruttiva si può cercare di incoraggiare l’animale a deporre autonomamente le uova creando un idoneo luogo di deposizione. Il trattamento medico prevede la stimolazione della deposizione delle uova ritenute mediante l’induzione con ossitocina. L’ossitocina viene somministrata alle dosi di 1/3 UI/kg per via intramuscolare. Uno studio condotto presso l’Università veterinaria di Parma ha comparato le somministrazioni di ossitocina per via intramuscolare e per via intravenosa, confrontando le tempistiche con le quali incominciano le contrazioni e avviene la completa ovodeposizione e dimostrando come per via intravenosa sia possibile somministrare dosi più basse rispetto a quelle riportate solitamente in letteratura ottenendo comunque un ottimo risultato. Nel caso in cui il trattamento farmacologico dovesse fallire o non fosse attuabile, oppure in casi di distocia ostruttiva è possibile ricorrere alla chirurgia. Per stasi follicolare si intende la incapacità di produrre sufficiente quantità di progesterone da corpi lutei perfettamente funzionanti. Come per la distocia, l’eziologia della stasi follicolare è variegata e molto ampia: le cause possono essere sia ambientali che patologiche. La diagnosi clinica viene fatta essenzialmente per esclusione. Come per la distocia, anche in questo caso l’anamnesi e la raccolta del maggior quantitativo di informazioni è fondamentale per indirizzarsi verso il riconoscimento della patologia. Per prolasso si intende la fuoriuscita di un organo attraverso un orifizio del corpo. Nei rettili, diversi organi possono prolassare attraverso la cloaca: la porzione terminale dell’apparato gastroenterico, la vescica urinaria, il pene nel maschio (cheloni) e gli ovidutti nella femmina. In sauri e ofidi gli emipeni possono prolassare dalle rispettive tasche in seguito ad eccesiva attività sessuale97. La corretta identificazione del viscere prolassato è estremamente importante e deve essere effettuata prima di decidere qualsiasi tipologia di trattamento ed intervento. Nei casi acuti e non complicati è possibile la riduzione manuale dell’organo, dopo un accurato lavaggio e attenta pulizia. Se questo non dovesse essere possibile, l’utilizzo di lubrificanti e pomate antibiotiche garantisce all’organo una protezione efficiente. Nel caso in cui non si sia potuto intervenire celermente e l’organo sia andato incontro a infezione e congestione venosa prolungata con conseguente necrosi, l’unica soluzione è l’amputazione