Aborto ovino associado com infecção por Sarcocystis sp

Infecções por protozoários têm distribuição mundial e podem causar aborto, nascimentos prematuros e ou morte fetal em diversas espécies animais. Em julho de 2004, oito ovinos Corriedale apresentaram problemas reprodutivos caracterizados por aborto e natimortalidade no terço final da gestação. Dessas oito perdas, um natimorto macho foi enviado ao Setor de Patologia Veterinária para necropsia. Alterações macroscópicas não foram observadas durante a necropsia. Lesões histológicas foram observadas principalmente no cérebro e coração e se caracterizaram por encefalite não-supurativa multifocal acentuada associada à presença de protozoários no interior de células endoteliais e vasos sanguíneos e miocardite não-supurativa focal leve. Alguns desses organismos apresentaram formato de roseta. O teste de imunoistoquímica anti-Toxoplasma gondii foi negativo, mas houve reação cruzada com anticorpo anti-Neospora caninum. O exame de imunofluorescência direta para Leptospira sp. foi negativo. A bacteriologia aeróbica e micro-aeróbica não revelou crescimento significativo. Esses achados foram compatíveis com o diagnóstico de Sarcocystis sp.

Inquérito sorológico para toxoplasmose e leptospirose em mamíferos selvagens neotropicais do Zoológico de Aracaju, Sergipe

Os zoológicos modernos são instituições destinadas à manutenção da fauna selvagem com o objetivo de promover a conservação, pesquisa científica, lazer, recreação e educação ambiental. A ampla variedade de espécies selvagens, vivendo em condições diferentes do seu habitat natural, representa um ambiente propício à disseminação de doenças, muitas delas zoonóticas. Devido à escassez de dados e à relevância dos mamíferos selvagens neste contexto epidemiológico, tanto na toxoplasmose, quanto na leptospirose, foi efetuado o inquérito sorológico para toxoplasmose e leptospirose em mamíferos selvagens neotropicais do Zoológico de Aracaju, Sergipe, Brasil. Para tanto foram colhidas amostras sanguíneas de 32 animais, adultos, de ambos os sexos incluindo: 14 macacos-prego (Cebus libidinosus), quatro macacos-prego-do-peito-amarelo (Cebus xanthosternus), três onças-suçuaranas (Puma concolor), uma onça-pintada (Pantheraonca), uma raposa (Cerdocyon thous), seis guaxinins (Procyon cancrivorus), dois quatis (Nasua nasua) e um papa-mel (Eira barbara). Para a pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii foi utilizado o Teste de Aglutinação Modificada (MAT ³"1:25) e para pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. foi utilizado o teste de Soroaglutinação Microscópica (ponto de corte ³1:100) com uma coleção de antígenos vivos que incluiu 24 variantes sorológicas de leptospiras patogênicas e duas leptospiras saprófitas. Dentre os 32 mamíferos, 17 (53,1%) apresentaram anticorpos anti-T. gondii e quatro (12,5%) foram positivos para anticorpos anti-Leptospira spp. De acordo com o sexo, 60% (9/15) dos machos e 47,1% (8/17) das fêmeas foram soropositivos para T. gondii e 26,7% (4/15) dos machos apresentaram anticorpos anti-Leptospira spp. Dos mamíferos que apresentaram anticorpos anti-T. gondii, 47% (8/17) nasceram no zoológico, 41,2% (7/17) foram oriundos de outras instituições e dois (11,8%) foram provenientes da natureza. Em relação aos quatro mamíferos soropositivos para Leptospira spp., três (75%) foram procedentes da natureza e um (25%) nasceu no zoológico. Este foi o primeiro inquérito sorológico de anticorpos anti-Leptospira spp. em primatas e carnívoros neotropicais em um zoológico do Nordeste do Brasil e descreveu pela primeira vez a ocorrência de anticorpos anti-T. gondii e anti-Leptospira spp. com sorovar mais provável Copenhageni no primata ameaçado de extinção macaco-prego-de-peito-amarelo (C. xanthosternus) em Aracaju, SE.

Soroepidemiologia da toxoplasmose em caprinos e ovinos de três municípios do estado do Rio de Janeiro

A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial, causada pelo Toxoplasma gondii. O estudo da prevalência desta infecção em animais produtores de carne e leite é de interesse à saúde pública, devido ao fato desses produtos oriundos de animais infectados serem importantes vias de transmissão para o homem, quando consumidos in natura. Além disso, há o aspecto econômico, uma vez que pode causar aborto, retardo no crescimento e animais debilitados, levando prejuízos ao pecuarista. Este trabalho objetivou estimar a soroprevalência da infecção por T. gondii, por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) em caprinos e ovinos de três municípios do estado do Rio de Janeiro, provenientes de 10 propriedades. A prevalência de anticorpos IgG anti-T.gondii foi de 29,12% (60/206) nos caprinos e de 38,05% (137/360) nos ovinos, sendo observada nessa última espécie associação (p<0,05) entre sexo (fêmeas), idade adulta, sistema de criação extensivo, dieta de pastagem e água de beber de açude com a soropositividade. Os títulos variaram de 64 a 256, podendo ser sugestivos de infecção crônica. Melhorias nas técnicas de criação podem reduzir as fontes de infecção por T. gondii nos rebanhos.

Toxoplasmose em primatas neotropicais: estudo retrospectivo de sete casos

A toxoplasmose é considerada uma doença parasitária fatal em primatas neotropicais. O objetivo deste trabalho foi descrever, através de um estudo retrospectivo, os casos de toxoplasmose em primatas neotropicais. No período de 1999-2009 foram realizados 86 exames anatomopatológicos em primatas e a toxoplasmose foi a enfermidade mais comum (7/86), relatando-se um caso em sagui-do-tufo-preto (Callithrix penicillata) e seis em bugio-ruivo (Alouatta guariba). Dois animais foram encontrados mortos e cinco morreram em poucos dias. Os sinais clínicos mais frequentes foram apatia e anorexia (5/7), distensão abdominal (4/7) e febre (3/7). Na necropsia observou-se esplenomegalia (4/7), hemorragia do trato digestório, linfonodos e bexiga (4/7), pulmões avermelhados (3/7) e hepatomegalia (2/7). No exame histopatológico evidenciou-se hepatite (7/7), esplenite (3/7), miocardite (2/7), enterite (2/7), linfadenite (1/7) e sialite (1/7) necróticas e, pneumonia intersticial (4/7). Em fígado, pulmões, baço, coração, linfonodos e glândula salivar havia taquizoítos de Toxoplasma gondii que foram também detectados pelo exame de imuno-histoquímica anti-T. gondii em fígado, baço e pulmões (5/7). A toxoplasmose pode causar alta mortalidade em colônias de primatas neotropicais e representar mais uma ameaça à conversação dessas espécies em cativeiro. Sendo assim, medidas preventivas devem ser tomadas para evitar a contaminação desses animais.

The use of confocal laser scanning microscopy to analyze the process of parasitic protozoon-host cell interaction

In this communication we review the results obtained with the confocal laser scanning microscope to characterize the interaction of epimastigote and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi and tachyzoites of Toxoplasma gondii with host cells. Early events of the interaction process were studied by the simultaneous localization of sites of protein phosphorylation, revealed by immunocytochemistry, and sites of actin assembly, revealed by the use of labeled phaloidin. The results obtained show that proteins localized in the interaction sites are phosphorylated. The process of formation of the parasitophorous vacuole was monitored by labeling the host cell surface with fluorescent probes for lipids (PKH26), proteins (DTAF) and sialic acid (FITC-thiosemicarbazide) before interaction with the parasites. Evidence was obtained indicating transfer of components of the host cell surface to the parasite surface in the beginning of the interaction process. We also analyzed the distribution of cytoskeletal structures (microtubules and microfilaments visualized with specific antibodies), mitochondria (visualized with rhodamine 123), the Golgi complex (visualized with C6-NBD-ceramide) and the endoplasmic reticulum (visualized with anti-reticulin antibodies and DIOC6) during the evolution of intracellular parasitism. The results obtained show that some, but not all, structures change their position during evolution of the intracellular parasitism.

Enucleated L929 mouse fibroblasts support invasion and multiplication of Shigella flexneri 5a

Invasive bacteria can induce their own uptake and specify their intracellular localization; hence it is commonly assumed that proximate modulation of host cell transcription is not required for infection. However, bacteria can also modulate, directly or indirectly, the transcription of many host cell genes, whose role in the infection may be difficult to determine by global gene expression. Is the host cell nucleus proximately required for intracellular infection and, if so, for which pathogens and at what stages of infection? Enucleated cells were previously infected with Toxoplasma gondii, Chlamydia psittaci, C. trachomatis, or Rickettsia prowazekii. We enucleated L929 mouse fibroblasts by centrifugation in the presence of cytochalasin B, and compared the infection with Shigella flexneri M90T 5a of nucleated and enucleated cells. Percent infection and bacterial loads were estimated with a gentamicin suppression assay in cultures fixed and stained at different times after infection. Enucleation reduced by about half the percent of infected cells, a finding that may reflect the reduced endocytic ability of L929 cytoplasts. However, average numbers of bacteria and frequency distributions of bacterial numbers per cell at different times were similar in enucleated and nucleated cells. Bacteria with actin-rich tails were detected in both cytoplasts and nucleated cells. Lastly, cytoplasts were similarly infected 2 and 24 h after enucleation, suggesting that short-lived mRNAs were not involved in the infection. Productive S. flexneri infection could thus take place in cells unable to modulate gene transcription, RNA processing, or nucleus-dependent signaling cascades.

Inmunología : diagnóstico e interpretación de pruebas de laboratorio

El acelerado avance de la inmunología ha generado el desarrollo de técnicas que permiten resultados más precisos y de métodos de separación, tanto de componentes celulares como humorales, útiles en el diagnóstico. La presente edición tiene como objetivo proveer las herramientas necesarias para entender estos avances, junto con los mecanismos implicados en el desarrollo de algunas técnicas de diagnóstico inmunológico e interpretación clínica. Entre los temas tratados se encuentra el estudio de la estructura y fisiología de Toxoplasma gondii, que sirve de modelo para la elaboración de péptidos sintéticos de proteínas inmunogénicas y, además, puede ser aplicado en el desarrollo de métodos de diagnóstico en otros parásitos de importancia clínica. El presente manual ha sido elaborado con el fin de proporcionar una ayuda en el desarrollo de prácticas de laboratorio en inmunología y está dirigido, principalmente, a estudiantes universitarios y trabajadores de las diferentes áreas de la salud como medicina, bacteriología, biología y química.

Caracterización de la proteína del cuello de las roptrias 5 en plasmodium falciparum (PfRON5)

El conocimiento de las proteínas implicadas en el proceso de invasión de los merozoitos a los eritrocitos por Plasmodium es el punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias para controlar la malaria. Muchas de estas proteínas han sido estudiadas en Toxoplasma gondii, donde se han identificado las proteínas que pertenecen al Tight Junction (TJ), el cual permite una interacción fuerte entre las membranas de la célula huésped y el parásito, necesaria para la invasión parasitaria. En este género, cuatro proteínas del cuello de las roptrias (RON2, RON4, RON5 y RON8) y una proteína de micronemas (TgAMA-1) se han encontrado como parte del TJ. En Plasmodium falciparum, se han caracterizado las proteínas PfRON2 y PfRON4. En el presente estudio se realiza la identificación de la proteína PfRON5, una proteína de ~110 kDa que se expresa en las etapas de merozoitos y esquizontes de la cepa FCB-2 utilizando técnicas de biología molecular, bioinformática e inmuoquímica.

Annotation and characterization of the Plasmodium vivax rhoptry neck protein 4 (PvRON4)

Background: The tight junction (TJ) is one of the most important structures established during merozoite invasion of host cells and a large amount of proteins stored in Toxoplasma and Plasmodium parasites’ apical organelles are involved in forming the TJ. Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii apical membrane antigen 1 (AMA-1) and rhoptry neck proteins (RONs) are the two main TJ components. It has been shown that RON4 plays an essential role during merozoite and sporozoite invasion to target cells. This study has focused on characterizing a novel Plasmodium vivax rhoptry protein, RON4, which is homologous to PfRON4 and PkRON4. Methods: The ron4 gene was re-annotated in the P. vivax genome using various bioinformatics tools and taking PfRON4 and PkRON4 amino acid sequences as templates. Gene synteny, as well as identity and similarity values between open reading frames (ORFs) belonging to the three species were assessed. The gene transcription of pvron4, and the expression and localization of the encoded protein were also determined in the VCG-1 strain by molecular and immunological studies. Nucleotide and amino acid sequences obtained for pvron4 in VCG-1 were compared to those from strains coming from different geographical areas. Results: PvRON4 is a 733 amino acid long protein, which is encoded by three exons, having similar transcription and translation patterns to those reported for its homologue, PfRON4. Sequencing PvRON4 from the VCG-1 strain and comparing it to P. vivax strains from different geographical locations has shown two conserved regions separated by a low complexity variable region, possibly acting as a “smokescreen”. PvRON4 contains a predicted signal sequence, a coiled-coil α-helical motif, two tandem repeats and six conserved cysteines towards the carboxyterminus and is a soluble protein lacking predicted transmembranal domains or a GPI anchor. Indirect immunofluorescence assays have shown that PvRON4 is expressed at the apical end of schizonts and co-localizes at the rhoptry neck with PvRON2.

Identification of plasmodium vivax proteins with potential role in invasion using sequence redundancy reduction and profile hidden markov models

Background: This study describes a bioinformatics approach designed to identify Plasmodium vivax proteins potentially involved in reticulocyte invasion. Specifically, different protein training sets were built and tuned based on different biological parameters, such as experimental evidence of secretion and/or involvement in invasion-related processes. A profile-based sequence method supported by hidden Markov models (HMMs) was then used to build classifiers to search for biologically-related proteins. The transcriptional profile of the P. vivax intra-erythrocyte developmental cycle was then screened using these classifiers. Results: A bioinformatics methodology for identifying potentially secreted P. vivax proteins was designed using sequence redundancy reduction and probabilistic profiles. This methodology led to identifying a set of 45 proteins that are potentially secreted during the P. vivax intra-erythrocyte development cycle and could be involved in cell invasion. Thirteen of the 45 proteins have already been described as vaccine candidates; there is experimental evidence of protein expression for 7 of the 32 remaining ones, while no previous studies of expression, function or immunology have been carried out for the additional 25. Conclusions: The results support the idea that probabilistic techniques like profile HMMs improve similarity searches. Also, different adjustments such as sequence redundancy reduction using Pisces or Cd-Hit allowed data clustering based on rational reproducible measurements. This kind of approach for selecting proteins with specific functions is highly important for supporting large-scale analyses that could aid in the identification of genes encoding potential new target antigens for vaccine development and drug design. The present study has led to targeting 32 proteins for further testing regarding their ability to induce protective immune responses against P. vivax malaria.

Prevenção da toxoplasmose congénita em Portugal

A toxoplasmose congénita é uma doença infecciosa, causada pelo parasita Toxoplasma gondii e, adquirida por transmissão materno-fetal, a qual pode acarretar sequelas neurológicas e oculares muito graves, no recém-nascido. O presente estudo incide sobre as linhas de prevenção da doença, em Portugal. A base da prevenção define-se como primária, através da determinação do estatuto imunológico da mulher, do aconselhamento e adopção de medidas higiénico-dietéticas das mulheres seronegativas, de forma a evitar a infecção materna. A vigilância serológica, na detecção de uma possível infecção materna, e a instituição da terapêutica de profilaxia, constituem a prevenção secundária, de modo a evitar a infecção fetal. A prevenção terciária recai, sobre o estabelecimento de um novo esquema terapêutico, dotado de alguma teratogenicidade, com o intuito de minimizar as sequelas da infecção. Em Portugal, existem muitas mulheres seronegativas, mal informadas acerca da doença, e que não tomam medidas preventivas correctas, para evitar a infecção. Esta problemática é decrescente, de norte para sul do país. A prevenção da doença pode ser bem-sucedida, através da implementação de directrizes específicas, dirigidas aos diferentes grupos de risco e da orientação correcta, pelos profissionais de saúde. A realização de estudos, em várias áreas de intervenção da doença, optimiza a sua prevenção e a sua relação de custo-benefício.

Identification of Hammondia heydorni oocysts by a heminested-PCR (hnPCR-AP10) based on the H-heydorni RAPD fragment AP10

Toxoplasma gondii, Hammondia hammondi, Neospora caninum, Neospora hughesi and Hammondia heydorni are members of the Toxoplasmatinae sub-family. They are closely related coccidians with similarly sized oocysts. Molecular diagnostic techniques, especially those based on polymerase chain reaction (PCR), can be successfully applied for the differentiation of Hammondia-like oocysts. In this paper, we describe a rapid and simple method for the identification of H. heydorni oocysts among other members of the Toxoplasmatinae sub-family, using a heminested-PCR (hnPCR-AP10) based on a H. heydorni RAPD fragment available in molecular database. DNA of oocysts of H. heydorni yielded a specific fragment of 289-290 bp in the heminested-PCR assay. No product was yielded when the primers were used for the amplification of DNA extracted from T. gondii, N. caninum, N. hughesi and H. hammondi, thus allowing the differentiation of H. heydorni among other members of the Toxoplasmatinae sub-family. The hnPCR-AP10 was capable of detecting H. heydorni genetic sequences from suspensions with at least 10 oocysts. In conclusion, the hnPCR-AP10 proved to be a reliable method to be used in the identification of H. heydorni oocysts from feces of dogs. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Melatonin and IP(3)-induced Ca(2+) Release from Intracellular Stores in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum within Infected Red Blood Cells

IP(3)-dependent Ca(2+) signaling controls a myriad of cellular processes in higher eukaryotes and similar signaling pathways are evolutionarily conserved in Plasmodium, the intracellular parasite that causes malaria. We have reported that isolated, permeabilized Plasmodium chabaudi, releases Ca(2+) upon addition of exogenous IP(3). In the present study, we investigated whether the IP(3) signaling pathway operates in intact Plasmodium falciparum, the major disease-causing human malaria parasite. P. falciparum-infected red blood cells (RBCs) in the trophozoite stage were simultaneously loaded with the Ca(2+) indicator Fluo-4/AM and caged-IP(3). Photolytic release of IP(3) elicited a transient Ca(2+) increase in the cytosol of the intact parasite within the RBC. The intracellular Ca(2+) pools of the parasite were selectively discharged, using thapsigargin to deplete endoplasmic reticulum (ER) Ca(2+) and the antimalarial chloroquine to deplete Ca(2+) from acidocalcisomes. These data show that the ER is the major IP(3)-sensitive Ca(2+) store. Previous work has shown that the human host hormone melatonin regulates P. falciparum cell cycle via a Ca(2+)-dependent pathway. In the present study, we demonstrate that melatonin increases inositol-polyphosphate production in intact intraerythrocytic parasite. Moreover, the Ca(2+) responses to melatonin and uncaging of IP(3) were mutually exclusive in infected RBCs. Taken together these data provide evidence that melatonin activates PLC to generate IP(3) and open ER-localized IP(3)-sensitive Ca(2+) channels in P. falciparum. This receptor signaling pathway is likely to be involved in the regulation and synchronization of parasite cell cycle progression.

In Vitro and In Vivo Antiplasmodial Activities of Risedronate and Its Interference with Protein Prenylation in Plasmodium falciparum

The increasing resistance of malarial parasites to almost all available drugs calls for the identification of new compounds and the detection of novel targets. Here, we establish the antimalarial activities of risedronate, one of the most potent bisphosphonates clinically used to treat bone resorption diseases, against blood stages of Plasmodium falciparum (50% inhibitory concentration [IC(50)] of 20.3 +/- 1.0 mu M). We also suggest a mechanism of action for risedronate against the intraerythrocytic stage of P. falciparum and show that protein prenylation seems to be modulated directly by this drug. Risedronate inhibits the transfer of the farnesyl pyrophosphate group to parasite proteins, an effect not observed for the transfer of geranylgeranyl pyrophosphate. Our in vivo experiments further demonstrate that risedronate leads to an 88.9% inhibition of the rodent parasite Plasmodium berghei in mice on the seventh day of treatment; however, risedronate treatment did not result in a general increase of survival rates.

Sequence-specific reconstruction from fragmentary databases using seed sequences: implementation and validation on SAGE, proteome and generic sequencing data

Motivation: DNA assembly programs classically perform an all-against-all comparison of reads to identify overlaps, followed by a multiple sequence alignment and generation of a consensus sequence. If the aim is to assemble a particular segment, instead of a whole genome or transcriptome, a target-specific assembly is a more sensible approach. GenSeed is a Perl program that implements a seed-driven recursive assembly consisting of cycles comprising a similarity search, read selection and assembly. The iterative process results in a progressive extension of the original seed sequence. GenSeed was tested and validated on many applications, including the reconstruction of nuclear genes or segments, full-length transcripts, and extrachromosomal genomes. The robustness of the method was confirmed through the use of a variety of DNA and protein seeds, including short sequences derived from SAGE and proteome projects.