Use of tomato and cucumber horticulture by-products in goat diets: effects o nrumen fermentation and microbial communities in batch and continuous cultures

Two in vitro experiments were conducted to analyse the effects of replacing dietary barley grain with wastes of tomato and cucumber fruits and a 1 : 1 tomato : cucumber mixture on rumen fermentation characteristics and microbial abundance. The control (CON) substrate contained 250 g/kg of barley grain on a dry matter (DM) basis, and another 15 substrates were formulated by replacing 50, 100, 150, 200 or 250 g of barley grain/kg with the same amount (DM basis) of tomato or cucumber fruits or 1 : 1 tomato : cucumber mixture. In Expt 1, all substrates were incubated in batch cultures with rumen micro-organisms from goats for 24 h. Increasing amounts of tomato, cucumber and the mixture of both fruits in the substrate increased final pH and gas production, without changes in final ammonia-nitrogen (NH3-N) concentrations, substrate degradability and total volatile fatty acid (VFA) production, indicating that there were no detrimental effects of any waste fruits on rumen fermentation. Therefore, in Expt 2 the substrates including 250 g of waste fruits (T250, C250 and M250 for tomato, cucumber and the mixture of both fruits, respectively) and the CON substrate were incubated in single-flow continuous-culture fermenters for 8 days. Total VFA production did not differ among substrates, but there were differences in VFA profile. Molar proportions of propionate, isobutyrate and isovalerate were lower and acetate : propionate ratio was greater for T250 compared with CON substrate. Fermentation of substrates containing cucumber (C250 and M250) resulted in lower proportions of acetate, isobutyrate and isovalerate and acetate : propionate ratio, but greater butyrate proportions than the CON substrate. Carbohydrate degradability and microbial N synthesis tended to be lower for substrates containing cucumber than for the CON substrate, but there were no differences between CON and T250 substrates. Abundance of total bacteria, Fibrobacter succinogenes and Ruminococcus flavefaciens, fungi, methanogenic archaea and protozoa were similar in fermenters fed T250 and CON substrates, but fermenters fed C250 and M250 substrates had lower abundances of R. flavefaciens, fungi and protozoa than those fed the CON substrate. Results indicated that tomato fruits could replace dietary barley grain up to 250 g/kg of substrate DM without noticeable effects on rumen fermentation and microbial populations, but the inclusion of cucumber fruits at 250 g/kg of substrate DM negatively affected some microbial populations as it tended to reduce microbial N synthesis and changed the VFA profile. More studies are needed to identify the dietary inclusion level of cucumber which produces no detrimental effects on rumen fermentation and microbial growth.

Análisis de las poblaciones microbianas en fermentadores de flujo continuo: efecto de modificacioens técnicas para la retención de protozoos en el sistema

The objective of this work was to study the effect of two technical modifications (supplemented with sponge materials (ES) and provided with a filter system (FIL))in continuous-culture fermenters on the microbial populations and ruminal fermentation parameters over the sampling period. Six fermenters fed a 50:50 alfalfa hay: concentrate diet, inoculated with rumen liquor from sheep fed the same diet, were used in two incubation runs of 14 days each. On days 10 and 14, samples were taken for analysis of fermentation parameters (volatile fatty acids, ammonia-N and lactate) and microbial populations. None of the technical modification affected (P>0.05) concentrations of bacterial DNA and the relative abundance of fungi and archaea, but protozoal DNA concentrations were higher (P>0.05) in ES and FIL fermenters than in the control ones. However, values of protozoal DNA were about 50 times lower than in the rumen fluid used as inoculum for the ermenters. The tested technical modifications did not affect (P>0.05) any fermentation parameter, and there were no differences in fermentation parameters between days 10 and 14, with the exception of lactate production which was higher (P=0.009) on day 14 than on day 10. In conclusion, the technical modifications tested maintained protozoa in continuous culture fermenters without any effect on fermentation parameters and other microbial populations, but protozoa concentrations were still lower than those in the rumen.

Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is correlated with chromosome condensation during mitosis and meiosis in Tetrahymena

H3 phosphorylation has been correlated with mitosis temporally in mammalian cells and spatially in ciliated protozoa. In logarithmically growing Tetrahymena thermophila cells, for example, H3 phosphorylation can be detected in germline micronuclei that divide mitotically but not in somatic macronuclei that divide amitotically. Here, we demonstrate that micronuclear H3 phosphorylation occurs at a single site (Ser-10) in the amino-terminal domain of histone H3, the same site phosphorylated during mitosis in mammalian cells. Using an antibody specific for Ser-10 phosphorylated H3, we show that, in Tetrahymena, this modification is correlated with mitotic and meiotic divisions of micronuclei in a fashion that closely coincides with chromosome condensation. Our data suggest that H3 phosphorylation at Ser-10 is a highly conserved event among eukaryotes and is likely involved in both mitotic and meiotic chromosome condensation.

Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency

Millions of people worldwide suffer from nutritional imbalances of essential metals like zinc. These same metals, along with pollutants like cadmium and lead, contaminate soils at many sites around the world. In addition to posing a threat to human health, these metals can poison plants, livestock, and wildlife. Deciphering how metals are absorbed, transported, and incorporated as protein cofactors may help solve both of these problems. For example, edible plants could be engineered to serve as better dietary sources of metal nutrients, and other plant species could be tailored to remove metal ions from contaminated soils. We report here the cloning of the first zinc transporter genes from plants, the ZIP1, ZIP2, and ZIP3 genes of Arabidopsis thaliana. Expression in yeast of these closely related genes confers zinc uptake activities. In the plant, ZIP1 and ZIP3 are expressed in roots in response to zinc deficiency, suggesting that they transport zinc from the soil into the plant. Although expression of ZIP2 has not been detected, a fourth related Arabidopsis gene identified by genome sequencing, ZIP4, is induced in both shoots and roots of zinc-limited plants. Thus, ZIP4 may transport zinc intracellularly or between plant tissues. These ZIP proteins define a family of metal ion transporters that are found in plants, protozoa, fungi, invertebrates, and vertebrates, making it now possible to address questions of metal ion accumulation and homeostasis in diverse organisms.

Insulin-like growth factor I is a growth-promoting factor for Leishmania promastigotes and amastigotes

Leishmaniases are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania that affect more than 20 million people in the world. The initial phase of the infection is fundamental for either the progression or control of the disease. The Leishmania parasites are injected in the skin as promastigotes and then, after been phagocytized by the host macrophages, rapidly transform into amastigotes. In this phase different nonspecific cellular and humoral elements participate. We have shown previously that insulin-like growth factor (IGF)-I that is constitutively present in the skin induces growth of Leishmania promastigotes. In the present paper we show further evidence for the importance of this factor: (i) IGF-I also can induce a growth response in Leishmania (Leishmania) mexicana amastigotes; (ii) IGF-I binds specifically to a putative single-site receptor on both promastigotes and amastigotes; (iii) IGF-I induces a rapid tyrosine phosphorylation of parasite proteins with different molecular mass in promastigotes and amastigotes of L. (L.) mexicana; and, finally, (iv) the cutaneous lesion in the mice when challenged by IGF-I-preactivated Leishmania (Viannia) panamensis is increased significantly because of inflammatory process and growth of parasites. We thus suggest that IGF-I is another important host factor participating in the Leishmania–host interplay in the early stage during the establishment of the infection and presumably also in the later stages.

Structure of the glycosylphosphatidylinositol anchor of an arabinogalactan protein from Pyrus communis suspension-cultured cells

Arabinogalactan proteins (AGPs) are proteoglycans of higher plants, which are implicated in growth and development. We recently have shown that two AGPs, NaAGP1 (from Nicotiana alata styles) and PcAGP1 (from Pyrus communis cell suspension culture), are modified by the addition of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. However, paradoxically, both AGPs were buffer soluble rather than membrane associated. We now show that pear suspension cultured cells also contain membrane-bound GPI-anchored AGPs. This GPI anchor has the minimal core oligosaccharide structure, d-Manα(1–2)-d-Manα(1–6)-d-Manα(1–4)-d-GlcN-inositol, which is consistent with those found in animals, protozoa, and yeast, but with a partial β(1–4)-galactosyl substitution of the 6-linked Man residue, and has a phosphoceramide lipid composed primarily of phytosphingosine and tetracosanoic acid. The secreted form of PcAGP1 contains a truncated GPI lacking the phosphoceramide moiety, suggesting that it is released from the membrane by the action of a phospholipase D. The implications of these findings are discussed in relation to the potential mechanisms by which GPI-anchored AGPs may be involved in signal transduction pathways.

Trypanosome spliced leader RNA genes contain the first identified RNA polymerase II gene promoter in these organisms

Typical general transcription factors, such as TATA binding protein and TFII B, have not yet been identified in any member of the Trypanosomatidae family of parasitic protozoa. Interestingly, mRNA coding genes do not appear to have discrete transcriptional start sites, although in most cases they require an RNA polymerase that has the biochemical properties of eukaryotic RNA polymerase II. A discrete transcription initiation site may not be necessary for mRNA synthesis since the sequences upstream of each transcribed coding region are trimmed from the nascent transcript when a short m7G-capped RNA is added during mRNA maturation. This short 39 nt m7G-capped RNA, the spliced leader (SL) sequence, is expressed as an ∼100 nt long RNA from a set of reiterated, though independently transcribed, genes in the trypanosome genome. Punctuation of the 5′ end of mRNAs by a m7G cap-containing spliced leader is a developing theme in the lower eukaryotic world; organisms as diverse as Euglena and nematode worms, including Caenorhabditis elegans, utilize SL RNA in their mRNA maturation programs. Towards understanding the coordination of SL RNA and mRNA expression in trypanosomes, we have begun by characterizing SL RNA gene expression in the model trypanosome Leptomonas seymouri. Using a homologous in vitro transcription system, we demonstrate in this study that the SL RNA is transcribed by RNA polymerase II. During SL RNA transcription, accurate initiation is determined by an initiator element with a loose consensus of CYAC/AYR(+1). This element, as well as two additional basal promoter elements, is divergent in sequence from the basal transcription elements seen in other eukaryotic gene promoters. We show here that the in vitro transcription extract contains a binding activity that is specific for the initiator element and thus may participate in recruiting RNA polymerase II to the SL RNA gene promoter.

Galactosides in the rhizosphere: Utilization by Sinorhizobium meliloti and development of a biosensor

Identifying the types and distributions of organic substrates that support microbial activities around plant roots is essential for a full understanding of plant–microbe interactions and rhizosphere ecology. We have constructed a strain of the soil bacterium Sinorhizobium meliloti containing a gfp gene fused to the melA promoter which is induced on exposure to galactose and galactosides. We used the fusion strain as a biosensor to determine that galactosides are released from the seeds of several different legume species during germination and are also released from roots of alfalfa seedlings growing on artificial medium. Galactoside presence in seed wash and sterile root washes was confirmed by HPLC. Experiments examining microbial growth on α-galactosides in seed wash suggested that α-galactoside utilization could play an important role in supporting growth of S. meliloti near germinating seeds of alfalfa. When inoculated into microcosms containing legumes or grasses, the biosensor allowed us to visualize the localized presence of galactosides on and around roots in unsterilized soil, as well as the grazing of fluorescent bacteria by protozoa. Galactosides were present in patches around zones of lateral root initiation and around roots hairs, but not around root tips. Such biosensors can reveal intriguing aspects of the environment and the physiology of the free-living soil S. meliloti before and during the establishment of nodulation, and they provide a nondestructive, spatially explicit method for examining rhizosphere soil chemical composition.

T-cell alpha beta + and gamma delta + deficient mice display abnormal but distinct phenotypes toward a natural, widespread infection of the intestinal epithelium.

Vertebrate immune systems contain T cells bearing either alpha beta or gamma delta T-cell antigen receptors (TCRs). alpha beta T cells perform all well-characterized T-cell effector functions, while the biological functions of gamma delta + cells remain unclear. Of particular interest is the role of gamma delta + cells during epithelial infections, since gamma delta + cells are commonly abundant within epithelia. Eimeria spp. are intracellular protozoa that infect epithelia of most vertebrates, causing coccidiosis. This study shows that in response to Eimeria vermiformis, mice lacking alpha beta T cells display defects in protective immunity, while mice lacking gamma delta + cells display exaggerated intestinal damage, apparently due to a failure to regulate the consequences of the alpha beta T cell response. An immuno-downregulatory role during infection, and during autoimmune disease, may be a general one for gamma delta + cells.

Cholesterol starvation induces differentiation of the intestinal parasite Giardia lamblia.

Giardia lamblia, like most human intestinal parasitic protozoa, sustains fundamental morphological and biochemical changes to survive outside the small intestine of its mammalian host by differentiating into an infective cyst. However, the stimulus that triggers this differentiation remains totally undefined. In this work, we demonstrate the induction of cyst formation in vitro when trophozoites are starved for cholesterol. Expression of cyst wall proteins was detected within encystation-specific secretory vesicles 90 min after the cells were placed in lipoprotein-deficient TYI-S-33 medium. Four cloned lines derived from two independent Giardia isolates were tested, and all formed cysts similarly. Addition of cholesterol, low density or very low density lipoproteins to the lipoprotein-deficient culture medium, inhibited the expression of cyst wall proteins, the generation of encystation-specific vesicles, and cyst wall biogenesis. In contrast, high density lipoproteins, phospholipids, bile salts, or fatty acids had little or no effect. These results indicate that cholesterol starvation is necessary and sufficient for the stimulation of Giardia encystation in vitro and, likely, in the intestine of mammalian hosts.

Sex proportions of Haemoproteus blood parasites and local mate competition.

Recent genetic evidence suggests that parasitic protozoa often reproduce by "selfing," defined as sexual stages from a single, clonal lineage fertilizing each other. Selfing favors production of an excess of female over male progeny. We tested whether the proportion of male gametocytes of blood parasites of the genus Haemoproteus was affected by variables that could influence the probability of selfing. Proportions of male Haemoproteus gametocytes from 11 passerine host populations were not affected by the age of the parasites' avian hosts, date in season, sex of host, intensity of host's infection, or prevalence of parasites within host populations.

Molecular and cytotoxic effects of camptothecin, a topoisomerase I inhibitor, on trypanosomes and Leishmania.

Parasites pose a threat to the health and lives of many millions of human beings. Among the pathogenic protozoa, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, and Leishmania donovani are hemoflagellates that cause particularly serious diseases (sleeping sickness, Chagas disease, and leishmaniasis, respectively). The drugs currently available to treat these infections are limited by marginal efficacy, severe toxicity, and spreading drug resistance. Camptothecin is an established antitumor drug and a well-characterized inhibitor of eukaryotic DNA topoisomerase I. When trypanosomes or leishmania are treated with camptothecin and then lysed with SDS, both nuclear and mitochondrial DNA are cleaved and covalently linked to protein. This is consistent with the existence of drug-sensitive topoisomerase I activity in both compartments. Camptothecin also inhibits the incorporation of [3H]thymidine in these parasites. These molecular effects are cytotoxic to cells in vitro, with EC50 values for T. brucei, T. cruzi, and L. donovani, of 1.5, 1.6, and 3.2 microM, respectively. For these parasites, camptothecin is an important lead for much-needed new chemotherapy, as well as a valuable tool for studying topoisomerase I activity.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Avaliação de diversos métodos de detecção de cistos de Giardia spp. e Oocistos de Cryptosporidium parvum presentes no resíduo gerado após o tratamento de água de abastecimento com turbidez elevada

Este trabalho teve como objetivo avaliar diversos métodos de detecção e recuperação de cistos de Giardia spp. e de oocistos de Cryptosporidium parvum em resíduos gerados no tratamento de águas de abastecimento com turbidez elevada tendo como padrão o Método 1623.1 da USEPA (2012 ). Para tanto, ensaios utilizando aparelho Jarteste (coagulação, floculação, decantação e filtração ) foram realizados utilizando o coagulante cloreto de polialumínio - PAC. Em todos os métodos avaliados foi utilizada a técnica de purificação por separação imunomagnética - IMS. A adaptação do método floculação em carbonato de cálcio FCCa elaborado por Vesey et al. (1993) e adaptado por Feng et al. (2011), repercutiu nos melhores resultados para a amostra de resíduo sedimentado, com recuperações de 68 ± 17 % para oocisto de C. parvum e de 42 ± 7 % para cisto de Giardia spp. Entretanto, as recuperações para a amostra de água de lavagem dos filtros - ALF foram inferiores à 1 %, não sendo possível determinar um método adequado. A presença dos patógenos indica que o reuso da ALF em ETA convencionais ou o descarte em mananciais sem um tratamento prévio, pode representar problemas de contaminação. A adaptação dos métodos de Boni de Oliveira (2012) e Keegan et al. (2008), também repercutiram em porcentagens de recuperação expressivas para a amostra de resíduo sedimentado, sendo de: 41 ± 35 % para oocisto de C. parvum e 11 ± 70 % para cisto de Giardia spp., e 38 ± 26 % para oocisto de C. parvum e 26 ± 13 % para cisto de Giardia spp., respectivamente. A análise estatística não resultou em diferença significativa entre estes dois métodos, entretanto, as elevadas recuperações indicam que estes métodos podem ser melhor avaliados em pesquisas futuras.