Études de type structure fonction du couplage électromécanique et de la coopérativité sous-unitaire chez les canaux potassiques dépendants du voltage

Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique.

Rôles des kinases IKK et IKK-related dans les maladies inflammatoires chroniques : implications dans l’athérosclérose et la réponse hypoxique

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts.

Étude génétique et fonctionnelle de variantes de la région chromosomique 3p21 associée aux maladies inflammatoires de l'intestin

Des études de liaison et d’association génétiques ont permis d’identifier certains des facteurs de risque génétiques aux maladies inflammatoires de l’intestin (MII) dans la région chromosomique 3p21. Dans cette région, le polymorphisme nucléotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gène MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a été associé et répliqué à la fois à la colite ulcéreuse (CU) et à la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrélé à des SNP codants non-synonymes du gène MST1R, a également été associé à la MC. Afin de déterminer si d’autres variantes des gènes MST1 et MST1R sont associés à la CU, nous avons testé pour association des SNP de ces gènes. Seul un proxy de R689C a montré un signal d’association significatif aux MII, ce qui suggère que R689C est la variante causale aux MII dans le gène MST1. En cherchant à déterminer si la région 3p21 contenait plusieurs signaux d’association mutuellement indépendants, trois SNP ont été identifiés comme possible facteurs de risque indépendants, et ont été génotypés dans des cas de CU et de MC et des témoins, puis nos résultats d’association ont été combinés à ceux provenant de trois autres cohortes indépendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associés aux MII, mais une étude d’association conditionnelle suggère qu’il existe en fait deux signaux d’association mutuellement indépendants dans la région 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protéine MSP. Cette protéine a un rôle dans l’inflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules épithéliales. Dans cette étude, le rôle de la MSP a été investigué dans des modèles de macrophages humains et de cellules épithéliales de côlon, et seule la phosphorylation d’AKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a été modulée par la MSP dans nos modèles. Ce projet a donc permis d’apporter des connaissances sur les facteurs de risques génétiques aux MII dans la région 3p21, en identifiant 2 signaux d’association indépendants, et en nous informant sur le rôle de MST1, duquel provient le signal d’association principal, chez les cellules humaines.

Signalisation par les récepteurs des œstrogènes : mécanismes de reconnaissance de l’ADN et nouvelles approches pharmacologiques d’inhibition

Malgré les progrès des traitements des cancers du sein, ceux-ci demeurent la seconde cause de mortalité par cancer au Canada. Parmi les gènes associés aux cancers du sein, le récepteur des œstrogènes ERα est exprimé dans plus de 70% des tumeurs mammaires, qui prolifèrent en réponse aux œstrogènes, faisant de lui une cible de choix. ERα est un facteur de transcription ligand-dépendant, liant des éléments de réponse PuGGTCAnnnTGACCPy. Afin d’examiner la capacité des récepteurs nucléaires à reconnaitre de nouveaux motifs ADN, des mutants aux capacités de liaison modifiées ont été générés. Parmi les quatre résidus interagissant avec l’ADN, R211 ne peut pas être modifiée sans perdre complètement la liaison du récepteur à l’ADN. Néanmoins, les mutations combinées de plusieurs acides aminés contactant les bases de l’ERE ont généré des récepteurs capables de reconnaitre de nouveaux motifs, tout en conservant des niveaux de transactivation efficaces. L’utilisation potentielle des récepteurs nucléaires comme outils de thérapie génique hormono-dépendant, repose sur la prédiction des motifs de liaison efficaces. Étant donné son importance dans la carcinogenèse mammaire, ERα est une cible cruciale des thérapies anti-néoplastiques. L’anti-œstrogène total, ICI, induit la dégradation de ERα et l’arrêt de la croissance des cellules tumorales mammaires ERα-positives. De plus, la nouvelle drogue anti-tumorale HDACi, SAHA, module la voie de signalisation des œstrogènes et possède des propriétés prometteuses en association avec d’autres traitements anti-tumoraux. En effet, le co-traitement ICI et SAHA a un impact synergique sur l’inhibition de la prolifération des cellules mammaires tumorales ERα-positives. Cette synergie repose sur la coopération des effets de ICI et SAHA pour réduire les niveaux protéiques de ERα et bloquer la progression du cycle cellulaire via la modulation de la transcription des gènes cibles des œstrogènes. En fait, les fortes doses de HDACis masquent rapidement et complètement la signalisation transcriptionnelle des œstrogènes. De plus, les gènes cibles primaires des œstrogènes, contenant des EREs, présentent la même régulation transcriptionnelle en réponse aux fortes doses de SAHA ou du co-traitement, avec des doses utilisables en clinique de ICI et SAHA. En fait, ICI mime l’impact des fortes doses de SAHA, en dégradant ERα, potentialisant ainsi la répression de la transcription ERE-dépendante par SAHA. Finalement, la synergie des effets de ICI et SAHA pourrait augmenter l’efficacité des traitements des tumeurs mammaires.

Développement d’une méthode de simulation multi-échelle pour l’étude des grandes transformations dans les protéines

Les films de simulations qui accompagnent le document ont été réalisés avec Pymol.

Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

Importance de la phosphorylation de la ligase Itch dans la reconnaissance et l'ubiquitylation des protéines à domaine SH3

Itch est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans la reconnaissance et la dégradation des protéines par le protéasome. Itch contient trois sites phosphorylés par JNK et il a été démontré que la phosphorylation de ces résidus est nécessaire pour que Itch puisse reconnaître et ubiquityler les protéines c-Jun et JunB. Ces sites de phosphorylation se retrouvent dans le domaine PRD responsable des interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3. Si la phosphorylation de Itch par JNK est importante pour réguler son activité avec c-Jun et JunB, on connaît peu de choses sur les interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3 ainsi que l’implication de la phosphorylation dans leur régulation. Nous avons donc créé des mutants de Itch par mutagenèse dirigée où les sites de phosphorylation étaient remplacés par des alanines (mutant non phosphorylable) et où l’un des trois sites était remplacé par un acide aspartique (mutant constitutivement phosphorylé). Ces mutants sont utilisés dans des tests d’interaction et d’ubiquitylation, dans le but de déterminer l’impact de la phosphorylation de Itch dans la reconnaissance et l’ubiquitylation des protéines SH3. Nos résultats montrent que, contrairement au modèle proposé, la phosphorylation de Itch n’est pas essentielle à l’interaction de Itch avec l’endophiline, mais la phosphorylation de Itch module l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de l’endophiline. La régulation de l’interaction de Itch avec ses substrats est donc différente selon le substrat.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

Influence de l'initiation de la traduction sur le changement programmé du cadre de lecture en -1 responsable de la synthèse des enzymes du virus de l’immunodéficience humaine de type 1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.

Étude de la voie de signalisation de l’insuline chez la drosophile par une approche phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance.

Effet de la transmission cholinergique sur la cartographie fonctionnelle du cortex visuel du rongeur

La transmission cholinergique, et notamment muscarinique, joue un rôle déterminant dans le système nerveux central au niveau de la modulation de la plasticité neuronale. La libération d'ACh dans le cortex visuel est concomitante à la présentation de stimuli visuels. Par son action sur la transmission neuronale corticale, l'ACh module à long terme les réponses à de nouveaux stimuli sensoriels. Dans la présente étude, l'implication du système cholinergique au niveau du développement cortical et de la plasticité inductible chez l'adulte a été étudiée par les techniques d'imagerie optique des signaux intrinsèques et d'immunohistochimie chez le rongeur. Ces deux techniques de cartographie de l'activité corticale nous ont permis d'évaluer, d'une part, l'impact modulatoire de l'acétylcholine (ACh) et de ses récepteurs muscariniques (mAChRs, M1 à M5) sur l'organisation fonctionnelle du cortex visuel chez des souris déficitaires pour les mAChRs et, d'autre part, l'impact de la libération d'ACh lors d'un entraînement visuel, sur le nombre, la nature neurochimique et la localisation au niveau des couches corticales des neurones corticaux activés. L'implication du système cholinergique sur la cartographie du cortex visuel primaire a été étudiée sur les souris génétiquement modifiées délétères (knock out : KO) pour différentes combinaisons de sous-types de mAChRs. L'imagerie des signaux intrinsèques, basée sur les changements de réflectance corticale de la lumière survenant lors de la consommation d'oxygène par les neurones activés, a permis de déterminer, lors de stimulations visuelles, les différentes composantes des propriétés des neurones du cortex visuel. La taille des champs récepteurs des neurones est diminuée lors de l'absence du récepteur M1 ou de la combinaison M1/M3. Le champ visuel apparent est augmenté chez les souris M2/M4-KO mais diminué chez les M1-KO. La finesse des connectivités neuronales (évaluée par la mesure du scatter du signal) est réduite lors de l'absence des récepteurs M2/M4. Finalement, chez les animaux M1/M3-KO, une diminution de l'acuité visuelle est observée. L'effet à long-terme d'un entraînement visuel couplé à une stimulation des neurones cholinergiques sur la distribution et la nature des neurones immunoréactifs au c-Fos, c'est-à-dire les neurones activés, a été évalué. Puisque cette stimulation combinée est en mesure de produire des modifications comportementales, notamment au niveau de l'acuité visuelle, il devenait intéressant de s'attarder aux modifications neuroanatomiques et de déterminer quels éléments de l'équilibre excitateur/inhibiteur sont compromis chez ces animaux. Les résultats obtenus démontrent que les animaux ayant reçu une combinaison de l'entraînement cholinergique et visuel présentent une augmentation du marquage c-Fos comparativement aux animaux n'ayant reçu que la stimulation cholinergique. D'autre part, chez ces animaux, il est possible d'observer des modifications de l'équilibre excitateur/inhibiteur qui correspond au potentiel plastique de la région. En conclusion, ces études démontrent un rôle important du système cholinergique dans le développement, la maturation et la plasticité du système visuel cérébral.

Novel non phospholipid liposomes with high sterol content : development and characterization

Les liposomes sont des nanovecteurs polyvalents et prometteurs quant à leur utilisation dans plusieurs domaines. Il y a une décennie, un nouveau type de liposome constitué d’amphiphiles monoalkylés et de stérols est né fortuitement dans notre groupe. Ils sont nommés Stérosomes puisqu’ils contiennent une grande proportion de stérols, entre 50 et 70 mol %. Les objectifs de cette thèse sont de développer de nouvelles formulations de Stérosomes ayant des caractéristiques spécifiques et d’acquérir une compréhension plus profonde des règles physicochimiques qui dictent leur comportement de phase. Nous avons spécifiquement examiné le rôle de motifs moléculaires des stérols, de la charge interfaciale et de la capacité à former des liaisons H dans les interactions intermoléculaires menant à l’autoassemblage. Le comportement de phase a été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), par spectroscopie infrarouge (IR) et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du deutérium (²H NMR). Premièrement, nous avons établi certaines corrélations entre la structure des stérols, leur tendance à former des bicouches fluides en présence d'amphiphile monoalkylé et la perméabilité des grandes vésicules unilamellaires (LUV) formées. La nature des stérols module les propriétés de mélange avec de l’acide palmitique (PA). Les stérols portant une chaîne volumineuse en position C17 sont moins aptes à induire des bicouches fluides que ceux qui ont une chaîne plus simple, comme celle du cholestérol. Un grand ordre de la chaîne alkyle de PA est un effet commun à tous les stérols investigués. Il a été démontré que la perméabilité des LUV peut être contrôlée en utilisant des stérols différents. Cependant, ces stérols n’ont aucun impact significatif sur la sensibilité des Stérosomes au pH. Afin de créer des liposomes qui sont sensibles au pH et qui ont une charge positive à la surface, des Stérosomes composés de stéarylamine et de cholestérol (Chol) ont été conçus et caractérisés. Il a été conclu que l’état de protonation de l’amine, dans ce travail, ou du groupe carboxylique, dans un travail précédent, confère une sensibilité au pH et détermine la charge à la surface du liposome. Les premiers Stérosomes complètement neutres ont été fabriqués en utilisant un réseau de fortes liaisons H intermoléculaires. Le groupe sulfoxyde est capable de former de fortes liaisons H avec le cholestérol et les molécules d’eau. Une bicouche fluide métastable a été obtenue, à la température de la pièce, à partir d'un mélange équimolaire d’octadécyl méthyl sulfoxyde (OMSO) et de Chol. Ce comportement distinct a permis d’extruder le mélange pour former des LUV à la température de la pièce. Après 30 h, le temps de vie de la phase métastable, des Stérosomes stables et imperméables existaient toujours sous une forme solide. Un diagramme de température-composition a été proposé afin de résumer le comportement de phase des mélanges d’OMSO/Chol. Finalement, nous avons élaboré des Stérosomes furtifs en incorporant du polyéthylène glycol (PEG) avec une ancre de cholestérol (PEG-Chol) à l’interface de Stérosomes de PA/Chol. Jusqu’à 20 mol % de PEG-Chol peut être introduit sans perturber la structure de la bicouche. La présence du PEG-Chol n’a aucun impact significatif sur la perméabilité de la LUV. L'encapsulation active de la doxorubicine, un médicament contre le cancer, a été réalisée malgré la faible perméabilité de ces LUV et la présence du PEG à l’interface. L’inclusion de PEG a modifié considérablement les propriétés de l’interface et a diminué la libération induite par la variation de pH observée avec des LUV nues de PA/Chol. Cette formulation inédite est potentiellement utile pour l’administration intraveineuse de médicaments.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Étude des mécanismes cellulaires activés par l'Angiopoïétine-1 et le VEGF régulant la perméabilité et la migration endothéliales

L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques.

The anti-inflammatory properties of intravenous immunoglobulin in a murine model of allergic airway disease ; effects on the development of regulatory T-cells

Les immunoglobulines intraveineuses (IVIg) constituent une préparation polyclonale d’IgG isolée et regroupée à partir du plasma sanguin de multiples donneurs. Initialement utilisé comme traitement de remplacement chez les patients souffrant d’immunodéficience primaire ou secondaire, les IVIg sont maintenant largement utilisées dans le traitement de plusieurs conditions auto-immunes, allergiques ou inflammatoires à une dose élevée, dite immunomodulatrice. Différents mécanismes d’action ont été postulés au fil des années pour expliquer l’effet thérapeutique des IVIg dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Entre autre, un nombre grandissant de données issues de modèles expérimentaux chez l’animal et l’humain suggère que les IVIg induisent l’expansion et augmentent l’action suppressive des cellules T régulatrices (Tregs), par un mécanisme qui demeure encore inconnu. Également, les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires présentent souvent un nombre abaissé de Tregs par rapport aux individus sains. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les IVIg modulent les cellules T régulatrices est requise afin de permettre un usage plus rationnel de ce produit sanguin en tant qu’alternative thérapeutique dans le traitement des maladies auto-immunes et inflammatoires. Par le biais d’un modèle expérimental d’allergie respiratoire induite par un allergène, nous avons démontré que les IVIg diminuaient significativement l’inflammation au niveau des voies aériennes ce, en association avec une différenciation des Tregs à partir des cellules T non régulatrices du tissu pulmonaire. Nous avons également démontré qu’au sein de notre modèle expérimental, l’effet anti-inflammatoire des IVIg était dépendant des cellules dendritiques CD11c+ (CDs) pulmonaires, puisque cet effet pouvait être complètement reproduit par le transfert adoptif de CDs provenant de souris préalablement traitées par les IVIg. À cet effet, il est déjà établi que les IVIg peuvent moduler l’activation et les propriétés des CDs pour favoriser la tolérance immunitaire et que ces cellules seraient cruciales pour l’induction périphérique des Tregs. C’est pourquoi, nous avons cherché à mieux comprendre comment les IVIg exercent leur effet sur ces cellules. Pour la première fois, nous avons démontré que la fraction d’IgG riche en acide sialique (SA-IVIg) (constituant 2-5% de l’ensemble des IgG des donneurs) interagit avec un récepteur dendritique inhibiteur de type lectine C (DCIR) et active une cascade de signalement intracellulaire initiée par la phosphorylation du motif ITIM qui est responsable des changements observés en faveur de la tolérance immunitaire auprès des cellules dendritiques et des Tregs. L’activité anti-inflammatoire de la composante SA-IVIg a déjà été décrite dans des études antérieures, mais encore une fois le mécanisme par lequel ce traitement modifie la fonction des CDs n’a pas été établi. Nous avons finalement démontré que le récepteur DCIR facilite l’internalisation des molécules d’IgG liées au récepteur et que cette étape est cruciale pour permettre l’induction périphérique des Tregs. En tant que produit sanguin, les IVIg constitue un traitement précieux qui existe en quantité limitée. La caractérisation des mécanismes d’action des IVIg permettra une meilleure utilisation de ce traitement dans un vaste éventail de pathologies auto-immunes et inflammatoires.