Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines

Métodos moleculares têm sido utilizados para caracterizar a diversidade entre isolados de Fusarium spp. patogênicos e não patogênicos a uma cultura e, para determinar relações genéticas entre formae speciales. Testes de patogenicidade realizados em soja (Glycine max) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris) com 17 isolados de Fusarium solani não demonstraram especificidade de hospedeiros. Utilizou-se a técnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para analisar a região ITS1 - 5,8S rDNA - ITS2, amplificada com os primers ITS5 e ITS4. Os produtos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição Hae III e Msp I. Os padrões de bandas gerados pela digestão com a enzima Hae III permitiram diferenciar três grupos entre os isolados de F. solani, sendo um grupo específico para isolados de F. solani f. sp. phaseoli com 100% de similaridade entre os 11 isolados. Entre os isolados de F. solani f. sp glycines foram observados dois padrões distintos de restrição. A técnica de ARDRA utilizando a enzima Hae III apresenta, portanto, potencial para utilização como um marcador para diferenciação entre as formae specialesphaseoli e glycines, dentro do complexo F. solani.

Reação de genótipos de Phaseolus vulgaris à podridão do colo e ao oídio

A podridão do colo (Sclerotium rolfsii) e o oídio (Erysiphe polygoni) são de constante ocorrência na cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) no estado de Santa Catarina. O uso de genótipos com resistência genética é uma das alternativas de manejo destas doenças. Avaliou-se a reação a podridão e ao oídio em 80 e 75 genótipos de feijão respectivamente. Os testes foram conduzidos em casa de vegetação em um delineamento em blocos ao acaso. Para os testes com a podridão do colo, cada semente dos genótipos foi inoculada com dois esclerócios de S. rolfsii. A infecção por oídio ocorreu naturalmente. Usou-se a cv. Rio Tibagi como padrão de média resistência à podridão ou de média susceptibilidade ao oídio. Os genótipos menos afetados pela podridão do colo e que diferiram da 'Rio Tibagi' foram: grupo preto - LA 95105428, FT 646 e Acesso 57; grupo colorido - BAF 50. A maioria dos genótipos não diferiu da 'Rio Tibagi', porém o mais afetado pela podridão do colo foi o BAF 10. Os genótipos mais susceptíveis ao oídio foram o Acesso 57 (Preto) e o FGP CF 101 (Preto). Os genótipos menos afetados pelo oídio foram: grupo preto - Acessos 60 e 36, FGP CF 058, TB 95-03, LM95103904 e LP 96-58; grupo colorido - Akitã, LP 94-1 e LP 96-162.

Caracterização da região 5'-terminal de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 5'-terminal de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar cerca de 590 nt da região 5'-terminal do RNA viral. Foi obtido um fragmento de tamanho esperado que, após clonagem e seqüenciamento, mostrou a existência de uma região não codificadora com 92 nt e a primeira ORF, começando no primeiro AUG (posição 93) e terminando no códon UGA na posição 534. Na região não codificadora foi detectado um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal 18S. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada de 17080 Da. A extremidade 3' da ORF1 sobrepõe a extremidade 5' da ORF2 em 34 nucleotídeos. Os resultados obtidos indicam que a região 5'-terminal do RNA do SBMV-SP é similar ao isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito na América do Norte.

Avaliação de meios de cultura no crescimento micelial e esporulação de Alternaria brasiliensis

O crescimento micelial e a esporulação de Alternaria brasiliensis foram avaliados em 20 meios de cultura. Para tanto, discos de 5 mm de diâmetro retirados da borda de colônia desenvolvida em V-8A3, após seis dias de incubação, a 25 ºC, no escuro, foram repicados para placas de Petri contendo 15 ml de cada meio. Sete dias após, mediu-se o crescimento micelial e quantificou-se a esporulação. Verificou-se crescimento micelial de A. brasiliensis em todos os meios testados, embora esporulação só tenha ocorrido nos meios V-8A3, STA5 e SVA6. A maior quantidade de conídios foi produzida no meio V-8A3.

Efeito de exsudatos radiculares em endósporos de Pasteuria penetrans e em juvenis do segundo estádio de Meloidogyne incognita

Juvenis do segundo estádio (J2) de Meloidogyne incognita foram incubados nos exsudatos radiculares de soja (Glycine max), tomateiro (Lycopersicon esculentum), cafeeiro (Coffea arabica), feijoeiro (Phaseolus vulgaris), mostarda (Brassica rapa), Crotalaria juncea e C. spectabilis e em água por 12 h. Em seguida, realizou-se o teste de adesão por centrifugação ou por borbulhamento. Em outro ensaio, endósporos de Pasteuria penetrans foram incubados por quatro dias a 26 ºC nos exsudatos e submetidos à adesão em J2 de M. incognita, sob borbulhamento constante por 24 h em tubos contendo água. Os J2 com endósporos aderidos pelo teste de borbulhamento foram inoculados em mudas de tomateiro. Verificou-se que a incubação dos J2 por 12 h nos exsudatos radiculares testados reduziu o número de endósporos de P. penetrans por J2 independentemente do método de adesão empregado. Os J2 incubados nos exsudatos radiculares testados proporcionaram menor número de fêmeas parasitadas em tomateiro em relação à testemunha (água), bem como menor número de galhas com exceção dos J2 incubados em exsudato do próprio tomateiro. A reprodução dos J2 incubados nos exsudatos radiculares não foi afetada quando comparada à testemunha. A incubação dos endósporos nos exsudatos das plantas testadas reduziu a adesão e a infetividade em J2, em relação à testemunha. Após 28 dias da inoculação, observou-se redução no número de fêmeas parasitadas resultantes da infecção desses J2 com endósporos incubados em exsudatos radiculares comparada com aqueles incubados em água. O parasitismo do J2 com endósporos tratados com exsudatos radiculares e a reprodutividade de fêmeas oriundas da infetividade desses J2 foram semelhantes aos incubados em água.

Análise comparativa da variabilidade patogênica de Uromyces appendiculatus em algumas regiões brasileiras

A ferrugem do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris), incitada pelo fungo Uromyces appendiculatus, é uma das mais importantes doenças que afetam essa cultura. Trabalhos anteriores demonstraram a ampla variabilidade patogênica de U. appendiculatus no Brasil. No entanto, o uso de distintos grupos de cultivares diferenciadoras em tais trabalhos dificulta a análise comparativa e a identificação de fontes de resistência de amplo espectro. Assim, os objetivos deste trabalho foram: 1) caracterizar sete isolados de U. appendiculatus, coletados em diferentes regiões do estado de Minas Gerais, frente às 19 cultivares diferenciadoras para ferrugem, adotadas no "The Bean Rust Workshop", realizado em 1983, em Porto Rico, e 2) comparar os padrões de resistência/suscetibilidade obtidos, com aqueles apresentados frente a patótipos isolados nos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Goiás, visando identificar fontes de resistência de amplo espectro. Os sete isolados coletados em Minas Gerais foram classificados com sete patótipos distintos. As cultivares diferenciadoras com os maiores espectros de resistência foram 'Redlands Pioneer', 'California Small White 643', 'Brown Beauty', 'AxS 37' e 'Compuesto Negro Chimaltenango'. Portanto, apesar da exclusão das cultivares California Small White 643, AxS 37 e Brown Beauty da nova série diferenciadora internacional proposta em 2002, na África do Sul, recomenda-se adicionar estas cultivares nas futuras caracterizações de patótipos a serem realizadas no Brasil, como um modo de monitorar a variabilidade patogênica de populações de U. appendiculatus nas regiões produtoras.

Sobrevivência e viabilidade de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão armazenadas sob condições controladas

O estabelecimento de bancos de sementes para conservação ex situ de germoplasma vegetal é largamente utilizado, mas a contaminação das mesmas por fitopatógenos pode comprometer sua integridade. Este trabalho teve por objetivo monitorar a sobrevivência de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, em um lote de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris) cv. Roxão)submetido a três condições de temperatura, durante 60 meses de armazenamento: -18 e 5 ºC, condições preconizadas para a conservação de material genético vegetal a longo e médio prazo, respectivamente, e à temperatura ambiente (20-30 ºC). A sobrevivência da bactéria foi avaliada pela percentagem de sementes contaminadas e a viabilidade pela manutenção da patogenicidade dos isolados. A população de X. axonopodis pv. phaseoli nas sementes foi quantificada ao final de cinco anos de armazenamento. Os resultados mostraram que a percentagem de sementes contaminadas decresceu de 64 para 36-37% nos primeiros seis meses, para os três tratamentos. A partir de 30 meses observou-se que as sementes conservadas a -18 e 5 ºC apresentaram níveis de contaminação (58 e 72%) que diferiram significativamente das conservadas à temperatura ambiente (20%), e aos 60 meses taxas de 46%, 46% e 8%, respectivamente. A temperatura mais propícia à sobrevivência da bactéria foi 5 ºC em que se encontrou uma população máxima de 1,2 x 10(8) ufc/semente. Constatou-se, igualmente, a manutenção do poder infetivo dos isolados durante todo o armazenamento. Pode-se concluir que as condições ótimas para a conservação de sementes são as mesmas para a manutenção da longevidade de X. axonopodis pv. phaseoli.

Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 3'-terminal do genoma de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar 972 nt da região 3'-terminal do RNA viral. Foi obtido fragmento de tamanho esperado que inclui o gene da proteína capsidial e a região 3'-terminal não codificadora. O gene da proteína capsidial (ORF4) contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. O "sinal de localização nuclear", encontrado dentro do "Domínio R" na região 5'-terminal da ORF4 de alguns sobemovírus, não foi identificado no SBMV-SP. Esse dado pode explicar a ausência de partículas virais do SBMV-SP no núcleo celular. A seqüência do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado "Arkansas" (SBMV-ARK) descrito nos EUA. Os resultados obtidos indicam que o SBMV-SP e o SBMV-ARK são isolados muito proximamente relacionados.

Variabilidade patogênica de Phaeoisariopsis griseola na Costa Rica

Devido ao consistente aumento na incidência e severidade da mancha angular do feijoeiro (Phaseolus vulgaris), causada por Phaeoisariopsis griseola, na América Latina nos últimos anos, esta doença vem sendo considerada como uma das que provocam maiores perdas na cultura do feijoeiro comum. Normalmente, a infecção ocorre depois da quarta semana de cultivo, causando lesões necróticas nas folhas, cloroses e desfolhação precoce, pelo qual o rendimento é diminuido significativamente. As populações deste fungo mostram grande variabilidade patogênica, a qual apresenta patótipos com alto grau de adaptação ao acervo genético do hospedeiro, como resultado de um processo de co-evolução. O presente trabalho teve como objetivo estudar a variabilidade patogênica do fungo P. griseola a partir de isolamentos monospóricos provenientes das zonas produtoras de feijão na Costa Rica. Uma população de 61 isolamentos foi inoculada no grupo de diferenciadoras de P. griseola, o qual é composto de genótipos andinos e mesoamericanos. Com base na reação das diferenciadoras aos isolados inoculados, confirmou-se a variabilidade do fungo na Costa Rica; foram identificados 21 patótipos, dos quais o 0-0 e o 0-53 foram os mais freqüentes e de ampla distribuição geográfica. Os patótipos 20-21, 8-0, 42-57 e 52-57 foram os menos frequentes. As diferenciadoras mesoamericanas foram mais suscetíveis ao patógeno; no entanto, não foi detectada especificidade dos isolamentos, já que várias das diferenciadoras andinas também foram suscetíveis à doença. Os resultados sugerem a importância de se conhecer a variabilidade do fungo P. griseola, e de se incorporar genes de resistência em novos genotipos desenvolvidos através de programas de melhoramento.

Geoestatística como metodologia para estudar a dinâmica espaço-temporal de doenças associadas a Colletotrichum spp. transmitidos por sementes

Objetivou-se no presente trabalho caracterizar o progresso espaço-temporal da severidade da antracnose do feijoeiro comum e da ramulose do algodoeiro por meio da Geoestatística. Os experimentos foram conduzidos no campo, durante o período das águas, em diferentes épocas. Sementes inoculadas pelo método da restrição hídrica foram semeadas no centro de parcelas experimentais constituindo fonte de inóculo do tipo ponto. Foram realizadas semanalmente seis avaliações da severidade das doenças com base em escalas de notas. Pelos modelos de semivariograma isotrópicos esféricos e gaussianos ajustados aos dados, verificou-se o padrão de distribuição agregado e a dependência espacial de ambos os patossistemas. Com o mapeamento da severidade das doenças pelo método da krigagem ordinária em blocos, verificou-se menor severidade das doenças nos primeiros estádios, com aumento gradual ao longo do tempo. A antracnose apresentou formação inicial de focos de inóculo secundário, além do foco com inóculo inicial, que coalesceram com o tempo. A severidade da ramulose diminuiu gradualmente de forma radial e contínua do centro da parcela para as extremidades, com maior capacidade de infecção de plantas vizinhas, quando comparada à antracnose, possivelmente pela maior agressividade do patógeno e hábito de crescimento arbustivo do algodoeiro.

Dimorfismo de ascósporos em Glomerella cingulata f.sp. phaseoli

O objetivo deste trabalho foi caracterizar linhagens de Glomerella cingulata f. sp. phaseoli quanto ao crescimento micelial, formação de peritécio e dimorfismo de ascósporos. Foram avaliadas quatro linhagens nos meios de cultura de folhas de feijoeiro e meio M3 e em condições com e sem fotoperíodo. O comprimento dos ascósporos da linhagem normal e da mutante foi determinado. Houve diferença significativa quanto ao crescimento micelial e tamanho dos ascósporos. Constatou-se, pela primeira vez, em Glomerella cingulata f. sp. phaseoli dimorfismo de ascósporos sem indução.

Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão em meio de cultura semi seletivo

Para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em extratos de sementes inteiras e moídas de feijão, naturalmente contaminadas e sadias foram utilizados os meio de cultura semi-seletivos XCP1 e MT e o não seletivo 523 de Kado & Hesket. Os extratos de sementes foram também inoculados em folhas primárias de feijoeiro. O meio de cultura semi-seletivo XCP1 foi o mais eficiente na quantificação e detecção de Xap em extratos de sementes inteiras de feijão. Os extratos de sementes contaminadas, inoculados nas folhas primárias de feijoeiro produziram sintomas do crestamento bacteriano comum.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Metodologias de preparação de amostras de ferrugem para estudos morfológicos de urediniósporos por meio de microscopia eletrônica de varredura

Amostras de urediniósporos de ferrugens das espécies Melampsora epitea Thum., Melampsora medusae Thuem., Hemileia vastatrix Berk., Uromyces appendiculatum Pers., Puccinia sorghi Schwein., Tranzschelia discolor Fuckel e Phakopsora euvitis Ono, coletadas dos hospedeiros, chorão (Salix sp.), álamo (Populus deltoides Bartr. Ex. Marsh), cafeeiro (Coffea arabica L.), feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), milho (Zea mays L.), pessegueiro (Prunus persicae L.) e videira (Vitis vinifera L.) respectivamente, foram processadas de 3 formas: a) método convencional (fixação em glutaraldeído e tetróxido de ósmio, desidratação em acetona e secagem ao ponto crítico); b) método do vapor de ósmio e metalização com ouro; c) metalização direta de amostras (utilizado para esporos soltos). A técnica de fratura de amostra congelada em nitrogênio líquido também foi testada para o estudo do interior de pústulas da ferrugem da videira (P. euvitis). As amostras foram visualizadas em microscópio eletrônico de varredura no NAP/MEPA da ESALQ/USP. Procedeu-se à mensuração dos esporos e as imagens obtidas foram capturadas pelo software LeoUserInterface e processadas utilizando-se o programa de computador "Corel Draw". Em todos os métodos analisados obteve-se uma boa preservação da estrutura possibilitando imagens de alta qualidade. No entanto, para esporos livres (mantidos em cápsula de gelatina) o método da metalização direta foi mais prático e rápido. Para observação das pústulas em tecido vegetal os dois métodos de processamento de amostras avaliados proporcionaram resultados satisfatórios. A técnica de fratura em nitrogênio líquido também permitiu perfeita visualização do interior das pústulas da ferrugem da videira.

Método do rolo de papel toalha modificado para a detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de feijão

O mofo branco do feijoeiro, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, é uma das principais doenças da cultura. O patógeno pode ser disseminado por sementes infectadas, que têm um importante papel na infestação de novas áreas de plantio e no estabelecimento da doença no início do ciclo da cultura. Este trabalho apresenta uma adaptação do método do rolo de papel toalha, originalmente desenvolvido para a detecção de Colletotrichum lindemuthianum, com o objetivo de detectar a presença de S. sclerotiorum em sementes de feijão. Neste método, as sementes foram incubadas por 7 dias a 20 ºC em rolos de papel toalha para germinação, sendo mantidas sob condições de 100% de umidade relativa. Após esse período, as plântulas infeccionadas e as sementes mortas, circundadas por micélio característico de S. sclerotiorum, foram transportadas para caixas tipo gerbox, sobre duas folhas de papel de filtro umedecido. Após 3 a 4 dias de incubação a 20 ºC e sob regime de 12 horas de luz por 12 horas de escuro, os escleródios foram observados nas sementes e plântulas. O método foi relativamente rápido, simples e barato, além de apresentar a vantagem de possibilitar a detecção simultânea de S. sclerotiorum e de outros importantes patógenos transmitidos por sementes de feijão, como C. lindemuthianum, Macrophomina phaseolina e Rhizoctonia solani.