A study on the phylogeny and the ecology of ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene amoB

L'agricultura i la industrialització han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presència de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqüència, la nitrificació s'ha convertit en un procés global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) són els responsables de l'oxidació de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen. Els primers oxidadors d'amoni foren aïllats a finals del segle XIX, però la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assolís un coneixement complert d'aquest grup bacterià. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb seqüències corresponents a AOB. L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines útils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals. En aquest treball primer descrivim la utilització de la hibridació in situ amb fluorescència (FISH), mitjançant l'aplicació de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacterià; no obstant, aquest mètode no permetia la detecció de noves seqüències, pel que es necessitava una nova eina. Amb aquesta intenció vam aplicar la seqüència de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar específicament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presència i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqüències pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren també obtingudes amb aquesta tècnica. Així mateix, un dels inconvenients de l'ús del 16SrDNA com a marcador és la impossibilitat de detectar simultàniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris. El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores àmpliament utilitzat com a marcador per a la detecció dels AOB. En aquest treball també descrivim la utilització d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqüències de AOB en la mostra, però la necessitat de detectar amoA mitjançant clonatge fa que l'ús d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilització com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtenció de seqüències de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE. Amb la finalitat d'obtenir una eina ràpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucleòtids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenètiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat. En aquest treball també presentem una anàlisi de RT-PCR basada en la detecció del gen amoB per a la quantificació del gènere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucleòtids dissenyat permet una enumeració altament específica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts. Finalment, vam realitzar un estudi poligènic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vàrem construir un arbre filogenètic combinat. Com a resultat concloem que amoB és un marcador adequat per a la detecció i identificació dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferències filogenètiques. Per altra banda, la seqüència sencera del gen 16S rDNA és indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonòmiques i filogenètiques en treballar amb cultius purs de AOB.

The role of fungi and bacteria on the organic matter decomposition process in streams: interaction and relevance in biofilms

L'objectiu d'aquest estudi és el d'investigar sobre l'ús de matèria orgànica per part dels fongs i bacteris que colonitzen diferents substrats bentònics en rius Mediterranis i analitzar l'efecte dels factors ambientals i antròpics sobre l'estabilitat estructural i funcional de les comunitats del biofilm. La metodologia emprada en aquest estudi consisteix en: i) anàlisi de la biomassa bacteriana i fúngica, ii) anàlisi de la composició de les comunitats bentòniques (identificació d'hifomicets aquàtics i anàlisi del 16S rDNA bacterià), i iii) anàlisi de l'activitat enzimàtica extracel·lular relacionada amb el reciclatge de matèria orgànica en rius.

Developing a desertification indicator system for a small Mediterranean catchment: a case study from the Serra de Rodes, Alt Empordà, Catalunya, NE Spain

La desertificació és un problema de degradació de sòls de gran importància en regions àrides, semi-àrides i sub-humides, amb serioses conseqüències ambientals, socials i econòmiques com a resultat de l'impacte d'activitats humanes en combinació amb condicions físiques i medi ambientals desfavorables (UNEP, 1994). L'objectiu principal d'aquesta tesi va ser el desenvolupament d'una metodologia simple per tal de poder avaluar de forma precisa l'estat i l'evolució de la desertificació a escala local, a través de la creació d'un model anomenat sistema d'indicators de desertificació (DIS). En aquest mateix context, un dels dos objectius específics d'aquesta recerca es va centrar en l'estudi dels factors més importants de degradació de sòls a escala de parcel.la, comportant un extens treball de camp, analisi de laboratori i la corresponent interpretació i discussió dels resultats obtinguts. El segon objectiu específic es va basar en el desenvolupament i aplicació del DIS. L'àrea d'estudi seleccionada va ser la conca de la Serra de Rodes, un ambient típic Mediterràni inclòs en el Parc Natural del Cap de Creus, NE Espanya, el qual ha estat progressivament abandonat pels agricultors durant el segle passat. Actualment, els incendis forestals així com el canvi d'ús del sòl i especialment l'abandonament de terres són considerats els problemes ambientals més importants a l'àrea d'estudi (Dunjó et al., 2003). En primer lloc, es va realitzar l'estudi dels processos i causes de la degradació dels sòls a l'àrea d'interés. En base a aquest coneixement, es va dur a terme la identificació i selecció dels indicadors de desertificació més rellevants. Finalment, els indicadors de desertificació seleccionats a escala de conca, incloent l'erosió del sòl i l'escolament superficial, es van integrar en un model espaial de procés. Ja que el sòl és considerat el principal indicador dels processos d'erosió, segons la FAO/UNEP/UNESCO (1979), tant el paisatge original així com els dos escenaris d'ús del sòl desenvolupats, un centrat en el cas hipotétic del pas d'un incendi forestal, i l'altre un paisatge completament cultivat, poden ser ambients classificats sota baixa o moderada degradació. En comparació amb l'escenari original, els dos escenaris creats van revelar uns valors més elevats d'erosió i escolament superficial, i en particular l'escenari cultivat. Per tant, aquests dos hipotètic escenaris no semblen ser una alternativa sostenible vàlida als processos de degradació que es donen a l'àrea d'estudi. No obstant, un ampli ventall d'escenaris alternatius poden ser desenvolupats amb el DIS, tinguent en compte les polítiques d'especial interés per la regió de manera que puguin contribuir a determinar les conseqüències potencials de desertificació derivades d'aquestes polítiques aplicades en aquest escenari tan complexe espaialment. En conclusió, el model desenvolupat sembla ser un sistema força acurat per la identificació de riscs presents i futurs, així com per programar efectivament mesures per combatre la desertificació a escala de conca. No obstant, aquesta primera versió del model presenta varies limitacions i la necessitat de realitzar més recerca en cas de voler desenvolupar una versió futura i millor del DIS.

Aislamiento, identificación y conservación de cultivos de bacterias lácticas antagonistas de microbiota contaminante de sangre de matadero

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas. Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs. Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae. En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación.

Lactic acid bacteria as bioprotective agents against foodborne pathogens and spoilage microorganisms in fresh fruits and vegetables

La present tesi doctoral es centra en l'aplicació dels bacteris de l'àcid lactic (BAL) com a agents bioprotectors davant microorganismes patògens i deteriorants.Es van aïllar i seleccionar BAL de fruites i hortalisses fresques i es van assajar in vitro davant 5 microorganismes fitopatògens i 5 patògens humans.Es van realitzar assajos d'eficàcia en pomes Golden Delicious amb tots els aïllats enfront les infeccions causades pel fong Penicillium expansum. La soca més eficaç era Weissella cibaria TM128, que reduïa el diàmetre de les infeccions en un 50%.Les soques seleccionades es van assajar enfront els patògens Salmonella typhimurium, Escherichia coli i Listeria monocytogenes en enciams Iceberg i pomes Golden Delicious.Els BAL interferien eficientment amb el creixemet de S. typhimurium, and L. monocytogenes, però van mostrar poc efecte enfront E. coli.Finalment, es van realitzar assajos dosi-resposta amb les soques Leuconostoc mesenteroides CM135, CM160 and PM249 enfront L. monocytogenes. De totes les soques assajades, la soca CM160 va ser la més efectiva.

The stapedial reflex as an early indicator of cis-platinum ototoxicity

This paper discusses a study to determine whether changes in stapedial reflex thresholds can be utilized as an early indicator of cochlear damage with ongoing cid-platinum therapy.

The construction of a thyratron inflection indicator, its behaviour with certain vowels, and its use in instructing deaf children

This paper discusses the construction of an apparatus, Thyratron Inflection Indicator, to help hearing impaired children learn speech.

The analysis of ranked observations of soil structure using indicator geostatistics

Structure is an important physical feature of the soil that is associated with water movement, the soil atmosphere, microorganism activity and nutrient uptake. A soil without any obvious organisation of its components is known as apedal and this state can have marked effects on several soil processes. Accurate maps of topsoil and subsoil structure are desirable for a wide range of models that aim to predict erosion, solute transport, or flow of water through the soil. Also such maps would be useful to precision farmers when deciding how to apply nutrients and pesticides in a site-specific way, and to target subsoiling and soil structure stabilization procedures. Typically, soil structure is inferred from bulk density or penetrometer resistance measurements and more recently from soil resistivity and conductivity surveys. To measure the former is both time-consuming and costly, whereas observations made by the latter methods can be made automatically and swiftly using a vehicle-mounted penetrometer or resistivity and conductivity sensors. The results of each of these methods, however, are affected by other soil properties, in particular moisture content at the time of sampling, texture, and the presence of stones. Traditional methods of observing soil structure identify the type of ped and its degree of development. Methods of ranking such observations from good to poor for different soil textures have been developed. Indicator variograms can be computed for each category or rank of structure and these can be summed to give the sum of indicator variograms (SIV). Observations of the topsoil and subsoil structure were made at four field sites where the soil had developed on different parent materials. The observations were ranked by four methods and indicator and the sum of indicator variograms were computed and modelled for each method of ranking. The individual indicators were then kriged with the parameters of the appropriate indicator variogram model to map the probability of encountering soil with the structure represented by that indicator. The model parameters of the SIVs for each ranking system were used with the data to krige the soil structure classes, and the results are compared with those for the individual indicators. The relations between maps of soil structure and selected wavebands from aerial photographs are examined as basis for planning surveys of soil structure. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Localization of eIF4A-III in the nucleolus and splicing speckles is an indicator of plant stress

The mechanisms of long-term adaptation to low oxygen environment are quite well studied, but little is known about the sensing of oxygen shortage, the signal transduction and the short-term effects of hypoxia in plant cells. We have found that an RNA helicase eIF4A-III, a putative component of the Exon Junction Complex, rapidly changes its pattern of localisation in the plant nucleus under hypoxic conditions. In normal cell growth conditions GFP- eIF4A-III was mainly nucleoplasmic, but in hypoxia stress conditions it moved to the nucleolus and splicing speckles. This transition occurred within 15-20 min in Arabidopsis culture cells and seedling root cells, but took more than 2 h in tobacco BY-2 culture cells. Inhibition of respiration, transcription or phosphorylation in cells and ethanol treatment had similar effects to hypoxia. The most likely consequence is that a certain mRNA population will remain bound to the eIF4A-III and other mRNA processing proteins, rather than being transported from the nucleus to the cytoplasm, and thus its translation will be suspended.