Atividades amilolítica e pectinolítica de Alternaria solani e a relação com a agressividade em tomateiro

As atividades amilolítica e pectinolítica de 45 isolados de Alternaria solani, provenientes de diferentes hospedeiros, foram estimadas por meio da difusão enzimática em meio sólido específico e mensuração do halo de degradação do substrato. Todos os isolados degradaram pectina. Apenas 17 isolados apresentaram atividade amilolítica, sendo nove isolados provenientes de batateira. Somente o isolado AS18 se destacou como bom produtor de ambas as enzimas. Uma vez que a atividade pectinolítica foi mais evidente, avaliou-se a influência de pectinases na agressividade de A. solani ao tomateiro. Para isso, cinco isolados (2 de berinjela, 2 de tomateiro e 1 de batateira) contrastantes quanto à produção de pectinases foram selecionados para testes em folíolos destacados e plantas inteiras. Quatro isolados foram utilizados no teste em folíolos destacados (AS6, AS7, AS12 e AS26), e constatou-se haver variabilidade patogênica. A correlação obtida entre o tamanho das lesões e a atividade pectinolítica foi de r = 0,963 (P = 0,087). Cinco isolados (AS6, AS7, AS12, AS25 e AS26) foram inoculados em plantas inteiras de tomate. Os isolados não diferiram quanto ao número de lesões/cm² de área foliar, porém variaram em agressividade. Houve correlação (r = 0,916; P = 0,042) entre a atividade de pectinases e o índice de doença, sugerindo possível papel para as enzimas pécticas durante a infecção de A. solani em tomateiro. É provável que as diferenças no perfil enzimático dos isolados estejam associadas ao hospedeiro original de onde os mesmos foram obtidos. Os resultados reforçaram evidências de especificidade por hospedeiro em populações de A. solani.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.

Indução de resistência em plantas de berinjela por Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum: aspectos bioquímicos e biomassa vegetal

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é considerada uma doença de importância para a cultura da berinjela, sendo de difícil controle. O controle de doenças através de indução de resistência é um método que vêm se revelando como promissor. Basidiomas de Agaricus blazei e Lentinula edodes possuem substâncias do tipo antibiótico e outras substâncias capazes de atuarem como elicitoras da resposta de resistência em plantas, mostrando-se assim promissores no controle alternativo de fitopatógenos. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de estudar o efeito de extratos aquosos dos fungos e do indutor químico acibenzolar-S-metil (aSm) sobre o crescimento da bactéria in vitro e o controle da murcha bacteriana, bem como investigar seu efeito sobre a atividade de determinadas enzimas da planta. O efeito inibitório sobre o patógeno foi avaliado usando diferentes concentrações dos extratos aquosos. A indução de resistência foi estudada em plantas tratadas com o indutor biológico e químico, medindo-se a intensidade de murcha e determinando-se as alterações de algumas enzimas. Os resultados revelaram que os isolados de A. blazei e L. edodes, utilizados em diversas diluições, não exerceram efeito inibitório in vitro. Em relação à indução de resistência, extratos dos isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei (15%, v/v) e o aSm (0,05 g/L) promoveram redução significativa na ocorrência de folhas murchas, quando aplicados dois dias antes da inoculação. O aumento na atividade de peroxidase foi verificado em plantas tratadas com extratos de Abl-11, Abl-28 e com suspensão de aSm. A atividade de quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase não foi alterada nas plantas tratadas com extrato de Abl-28 e com o aSm. No entanto, plantas de berinjela tratadas com Abl-11 exibiram uma aumento na atividade de fenilalaniana amônia-liase e de polifenoloxidase, enquanto que a atividade de quitinase não foi alterada. Com base nos resultados, ficou evidenciado que o aSm e os isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei apresentam potencial para induzir resistência em berinjela contra R. solanacearum.

Método rápido de extração de DNA de bactérias

Desenvolveu-se um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício (carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de 725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima qualidade.

Alterações metabólicas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas por Pseudomonas sp. e inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Muitas enzimas estão envolvidas em reações de defesa de plantas contra patógenos. O objetivo deste trabalho foi verificar alterações na atividade de algumas destas enzimas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas com um isolado de Pseudomonas do grupo das fluorescentes (isolado DFs842). Sementes de feijão cultivar BRS Valente foram imersas em suspensão salina preparada a partir de crescimento bacteriano com 24 h do isolado de Pseudomonas (OD540=0,5) sabidamente biocontroladora de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Como testemunhas, as sementes foram imersas em solução salina (NaCl 0,85%). Após a microbiolização por 5 h a 10ºC, as sementes foram plantadas em vasos contendo uma mistura de solo não esterilizado, areia e esterco bovino (proporção 3:1:1), mantidos em casa de vegetação. A inoculação do patógeno foi realizada na terceira folha verdadeira de todas as plantas, fazendo-se cortes com tesoura imersa em suspensão salina do patógeno (X. axonopodis pv. phaseoli) preparada a partir de crescimento de 24 h (OD540=0,4). Câmaras úmidas foram mantidas 24 h antes e após a inoculação. Para o preparo do extrato protéico, as três primeiras folhas verdadeiras foram coletadas individualmente em 5 épocas de coleta distintas: uma, momentos antes da inoculação e as demais nos tempos seis, 24, 72 h e 15 dias após a inoculação. Este extrato protéico serviu de fonte para as determinações do teor de proteínas solúveis totais (PST), atividade da polifenol oxidase (PPO) e da peroxidase (PO), as quais foram realizadas por leituras espectrofotométricas. Os resultados demonstraram aumento significativo no teor de PST e na atividade de PPO nas plantas submetidas ao tratamento com isolado DFs842, sendo que, o teor de PST foi o dobro, em relação às plantas não tratadas. Também foi observado que, mesmo antes da inoculação do patógeno o teor de PST e a atividade de PPO nas plantas tratadas estavam bem maiores. Em relação à atividade de PO houve redução da mesma nas plantas tratadas com o isolado de Pseudomonas (DFs842). Esses resultados evidenciaram que a microbiolização das sementes provocou alterações metabólicas nas plantas delas originadas, pelo aumento do teor de PST e atividade de PPO, indicando uma provável participação destas enzimas na indução de resistência ativada pela microbiolização com o isolado de Pseudomonas (DFs842).

Candidatus Phytoplasma brasiliense associado ao superbrotamento do hibisco (Hibiscus rosa-sinensis L.) no Estado de São Paulo

Plantas de hibisco com superbrotamento e definhamento seguido de morte têm sido observadas nos municípios de São Paulo, Campinas e Piracicaba. Como os sintomas são sugestivos daqueles induzidos por fitoplasmas, o presente trabalho buscou identificar o possível fitoplasma associado com a doença. Assim, 14 plantas sintomáticas de hibisco foram coletadas em Piracicaba (SP) e submetidas ao PCR duplo com os primers P1/Tint-R16F2n/R2 e ao exame em microscópio eletrônico de transmissão. A identificação foi realizada por análise de RFLP com as enzimas de restrição BfaI, DraI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MseI, RsaI e TaqI. Testes de transmissão foram conduzidos com enxertia de ramos e uso de Cuscuta subinclusa. Os resultados de nested-PCR revelaram a presença consistente de fitoplasmas em todas as plantas sintomáticas e foram confirmados pela observação de corpúsculos pleomórficos no floema, através da microscopia eletrônica. A análise de RFLP mostrou que o fitoplasma encontrado em hibisco pertence ao grupo 16SrXV, o mesmo grupo do Candidatus Phytoplasma brasiliense. O fitoplasma foi transmitido de planta doente para sadia, tanto pela enxertia como pela C. subinclusa, demonstrando ser o agente do superbrotamento do hibisco.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Indução de resistência em feijoeiro a mancha angular por extratos de micélio de Pycnoporus sanguineus

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) está entre as principais culturas da agricultura nacional e pode ser afetada por várias doenças, como a mancha angular causada por Pseudocercospora griseola. Com o objetivo de desenvolver métodos alternativos ao químico para o controle desta doença, verificou-se o potencial de extratos de micélio de Pycnoporus sanguineus para atividade antimicrobiana in vitro contra P. griseola e para indução de resistência e ativação de enzimas de defesa em feijoeiro, como peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3-glucanase, além de sua influência nos teores de proteínas e clorofilas. Os experimentos in vitro e em casa de vegetação foram constituídos pelos extratos de micélio de P. sanguineus e dos controles água, acibenzolar-S-metil (ASM: 75 mg i.a./L) e fungicida azoxystrobin (40 mg i.a./L). In vitro o extrato de micélio apresentou efeito sobre o crescimento micelial, a esporulação e a germinação de esporos de P. griseola. In vivo a severidade foi reduzida em 93% e 50% em casa de vegetação e a campo respectivamente, em relação ao controle água. A atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase e os teores de proteínas e clorofilas foram maiores nas plantas tratadas com o extrato. Estes resultados indicam a eficiência de P. sanguineus para o controle alternativo da mancha angular do feijoeiro.

Efeito de indutores bióticos e abióticos na atividade de quitinase e peroxidase e no controle da ferrugem causada por Puccinia psidii em eucalipto

Verificou-se o efeito de indutores de resistência bióticos e abióticos nas atividades de quitinase e peroxidase e na redução da severidade da ferrugem do eucalipto causada por Puccinia psidii. Para isso, mudas de dois clones de eucalipto (Eucalyptus grandis x E. urophylla) denominados VR e C0, com sessenta dias de idade, mantidas em casa de vegetação, receberam tratamentos com Bion® (Acibenzolar-S-metil-ASM), Agro-Mos®, Dipel®, Ecolife40®, Crop-set® e uma preparação obtida a partir de Saccharomyces cerevisiae, 5 dias antes da inoculação com o patógeno. Uma suspensão de uredósporos de P. psidii, coletados a partir de plantas naturalmente infectadas, foi calibrada para 5 x 10(4) uredósporos/ mL. A inoculação foi realizada na face abaxial das folhas e a avaliação se deu 15 dias após, estimando-se a severidade da doença por meio de escala de notas. Os tratamentos ASM, preparado de S. cerevisiae e Ecolife® apresentaram os melhores resultados de controle da doença e os demais tratamentos não se mostraram eficazes para o controle. O aumento de atividade das enzimas quitinase e peroxidase foi observado em ambos os clones, previamente tratados com os indutores(ASM e S. cerevisiae), 48 horas após a inoculação com o fungo.

Podridão peduncular em manga: patogenicidade, agressividade e caracterização de isolados pela análise isoenzimática

Trinta e quatro isolados de Lasiodiplodia theobromae coletados de diferentes órgãos de mangueira, em duas épocas sazonais diferentes, em distintas regiões geográficas, foram avaliados quanto à patogenicidade, agressividade e produção de enzimas em substratos sólidos específicos e em sistemas de géis de poliacrilamida. Independente do órgão do qual foram isolados, todos foram patogênicos quando inoculados em manga, diferindo no grau de agressividade, sendo separados em três grupos: altamente, medianamente e fracamente agressivos. As atividades amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica foram estimadas por meio da difusão enzimática em meio sólido específico e mensuração do halo de degradação do substrato. As atividades das enzimas á-esterase, â-esterase, leucina-aminopeptidase, fosfatase ácida e proteínas totais foram analisadas em géis de poliacrilamida com meios de revelação específicos para cada análise. Os padrões eletroforéticos bem como as análises das enzimas extracelulares apresentaram polimorfismo, demonstrando a diversidade na base genética dos isolados, independente da época de coleta, região geográfica e órgão de isolamento.

Modo de ação de fosfitos de potássio no controle da podridão olho de boi em maçã

A podridão olho de boi causada por Cryptosporiopsis perennansé a principal doença de maçãs em pós-colheita no Brasil. Objetivou-se neste trabalho avaliar a) o uso de sais de fosfito de potássio em associação ou não ao fungicida captan no controle da doença em condições de campo e in vitro, b) as modificações físico-químicas nos frutos e, c) o efeito desses sais na atividade da peroxidase e da fenilalanina amonia-liase em maçãs inoculadas artificialmente. As aplicações dos sais de fosfito de potássio e captan foram realizadas na safra 2007/08, município de Vacaria, em pomar da cv. Pink Lady(r) a partir dos 45 dias antes da colheita ou 24 h antes da colheita. A atividade da peroxidase e da fenilalanina amônia-liase foi determinada em frutos 24 h e 14 dias após as inoculações com o patógeno. Aplicações de fosfito de potássio + captan reduziram em 60% os danos pela podridão olho de boi em pós-colheita, além de reduzir 66% da quantidade de inóculo na superfície das maçãs em aplicação realizada no dia anterior à colheita. O fosfito de potássio inibiu o desenvolvimento in vitrodo fungo sem alterar a atividade das enzimas peroxidase e fenilalanina amônia-liase. Os fosfitos de potássio mostraram ação fungicida erradicante, com potencial de uso no manejo integrado da podridão olho de boi.

Alterações fisiológicas em sementes de Tachigalia multijuga (Benth.) (mamoneira) relacionadas aos métodos para a superação da dormência

Este trabalho teve como objetivo estudar as alterações fisiológicas causadas por métodos de quebra da dormência em sementes de Tachigalia multijuga (Benth) provenientes de três matrizes. Compararam-se os efeitos do ácido sulfúrico, da água fervente e do desponte na porcentagem de embebição, na porcentagem e velocidade de germinação, na atividade de alfagalactosidase e betamananase, na síntese de proteína e na alteração da membrana que recobre o embrião. Não houve germinação em sementes tratadas com água quente. Todos os tratamentos resultaram em porcentagem de germinação superior (P<0,05) à da testemunha, com exceção das sementes da matriz Cachoeira, em que o tratamento com ácido sulfúrico por 10 minutos foi semelhante. Entretanto, a velocidade de germinação da testemunha foi diferente (P<0,05) da de todos os tratamentos somente em sementes da matriz Araponga 2. A porcentagem de umidade das sementes tratadas com água quente por 60 segundos foi semelhante àquelas da testemunha e diferente (P<0,05) das tratadas com água quente por 30 minutos e com ácido por 20 minutos. As atividades das enzimas e teores de proteínas durante a germinação foram diferentes (P<0,05) entre os tratamentos com água e ácido.

Purificação e caracterização de alfa-galactosidases de sementes de Platymiscium pubescens Micheli

Este trabalho objetivou foi determinar a composição bioquímica de sementes de espécies florestais e caracterizar a enzima alfa-galactosidase de sementes germinadas de Platymiscium pubescens. Os maiores teores de lipídios foram determinados em sementes de Chorisia speciosa, Caesalpinia peltophoroides, Tabebuia serratifolia e Tabebuia velanedae, enquanto sementes de Enterolobium contortisiliquum, Schizolobium parahyba e Cassia grandis apresentaram os maiores teores protéicos. A alfa-galactosidase catalisa a hidrólise dos oligossacarídeos de rafinose, em sementes de leguminosas, durante a germinação. A maior atividade da alfa-galactosidase foi detectada em sementes de Platymiscium pubescens após 72 h de embebição. Duas formas de alfa-galactosidases, C1 e C2, foram purificadas de sementes germinadas de P. pubescens, usando-se fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de afinidade. Essas enzimas apresentaram atividade máxima em pH 5,5 e a 50-55 ºC. Os valores de Km ap das formas C1 e C2, para o substrato ro-nitrofenil-alfa-D-galactopiranosídeo, foram de 0,54 mM e 0,78 mM, e para a rafinose, de 4,64 mM e 5,09 mM, respectivamente. Essas enzimas exibiram estabilidade térmica moderada, mantendo 70% da atividade original após 3 h de incubação a 45 ºC. A atividade enzimática da C1 e C2 foi totalmente perdida na presença de CuSO4 e dodecil sulfato de sódio (SDS). Tais enzimas também hidrolisaram melibiose, rafinose e estaquiose, indicando potencial para aplicações biotecnológicas.

Eletroforese de proteínas e isoenzimas em sementes de Copaifera Langsdorffii Desf. (leguminosae caesalpinioideae) envelhecidas artificialmente

A eletroforese vem sendo utilizada com a finalidade de auxiliar a avaliação da qualidade fisiológica de sementes de espécies florestais, uma vez que respostas mais rápidas podem ser obtidas usando-se marcadores isoenzimáticos. Sementes de copaíba (Copaifera langsdorffii) foram submetidas a diferentes tempos de envelhecimento artificial (0, 24, 48, 72 e 96 horas), em germinador (42 ºC e 100% de UR), tendo como objetivo avaliar as possíveis mudanças nos padrões eletroforéticos de proteínas e isoenzimas, decorrentes do envelhecimento artificial. O envelhecimento artificial ocasionou redução na germinação e vigor de sementes de C. langsdorffii, sendo o vigor afetado mais rapidamente. Em relação aos padrões eletroforéticos, não houve diferença significativa no conteúdo de proteínas solúveis e de armazenamento, mas, nas enzimas esterase e peroxidase, verificou-se redução na atividade destas, à medida que as sementes foram envelhecidas.

Potencial de Cajanus cajan e Crotalaria spectabilis parafitorremediação: absorção de arsênio e respostas antioxidativas

Neste estudo, avaliaram-se os efeitos tóxicos do arsênio (As) sobre o crescimento e atividade de enzimas antioxidativas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidases (POX), peroxidase do ascorbato peroxidase (APX) e glutationa redutase (GR) em plantas de Cajanus cajan e Crotalaria spectabili. Plantas das duas espécies foram expostas a diferentes concentrações de As, em solução nutritiva de Hoagland, pH 6,5. A taxa de crescimento relativo (TCR) das duas espécies reduziu-se com o aumento da concentração de As na solução nutritiva, sendo de forma mais intensa em C. cajan. A concentração de As na solução capaz de reduzir em 50% a TCR de C. cajan foi de 0,93 mg L-1, enquanto em C. spectabilis foi de 4,80 mg L-1. As duas espécies apresentaram reduzida translocação de As para a parte aérea, sendo em raízes de C. spectabilis observada a maior concentração desse elemento. C. cajan exposto ao As teve as atividades das enzimas CAT, POX e APX reduzidas, ao contrário do que ocorreu em C. spectabilis. Esta espécie, quando submetida ao As, apresentou incremento na atividade de todas as enzimas avaliadas. A maior tolerância ao As observada em C. spectabilis pode estar relacionada à maior capacidade em reter o As nas raízes e à indução das enzimas SOD, CAT, POX, APX e GR. Dessa forma, C. spectabilis é uma espécie com potencial para utilização em programas de revegetação de áreas contaminadas com As.