PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino

Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detecção da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detecção de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes de bactérias obtidas através de diluições seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentração inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As diluições foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentrações necessárias para a padronização do teste de multiplex PCR. As extrações de DNA de todas as soluções contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplificação de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detecção simultânea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL vezes da concentração inicial da solução estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detecção de bactérias causadoras de doenças reprodutivas.

Bry sig om : ett vårdvetenskapligt praxisbegrepp

’Bry sig om’ förekommer flitigt i sammanhang där människor vårdar och tar hand om varandra såväl i det vardagliga naturliga vårdandet som i det professionella vårdandet. ’Bry sig om’ är ett språkligt uttryck i människors vardagsspråk som hör samman med ’små vardagliga saker’ som är av betydelse. ’Bry sig om’ har även tydlig förbindelse med vårda och ansa i Erikssons caritativa vårdteori men har inte tidigare varit föremål för klinisk vårdvetenskaplig forskning vilket är bakgrunden till denna studie. Inom Erikssons caritativa vårdteori utgörs grundordningen av kärnbegreppen caritas, enheten människa, hälsa, lidande och vårdande. I den här avhandlingen är syftet att vidga förståelsen för kärnbegreppet vårdandet genom att utforska innebörden i praxisbegreppet ’bry sig om’. Studien har en hermeneutisk ansats och är en sammanläggningsavhandling med fyra delstudier i form av begreppsanalys och tre empiriska studier. Materialet i begreppsutredningen är etymologisk ordbok och svenska ordböcker. I de empiriska delstudierna består materialet av självbiografisk text skrivet av en patient och händelser som patienter och vårdare varit med om vilket förstås som betydelsefullt material för klinisk vårdvetenskaplig forskning. Den nya förståelsen gestaltas i ett tankemönster där ’bry sig om’ framträder som en inre etisk hållning där människan som är på plats kan finnas till och därmed betyda något för en annan människa. Att betyda något för en annan människa är uttryck för det naturliga omsorgsfulla vårdandet där patienten förnimmer en kärleksfull hållning i vårdarens varsamma kärleksfulla händer och varma röst. ’Bry sig om’, har sin grundval i det naturliga omsorgsfulla vårdandet som konstituerar människan som människa. Det som framkommit i avhandlingen är möjligheten att undersöka praxisbegrepp inom vårdvetenskapen där ’bry sig om’ bidragit till att synliggöra vårdandet och därmed innebörden och meningen i ansandet, lekandet och lärandet på ett nytt och annorlunda sätt ur ett kliniskt vårdvetenskapligt perspektiv.

Análise fenotípica e genotípica da virulência de Staphylococcus spp. e de sua dispersão clonal como contribuição ao estudo da mastite bovina

A mastite é uma inflamação da glândula mamária causada principalmente por bactérias, dentre as quais o gênero Staphylococcus ocupa um papel importante. Bactérias pertencentes a este gênero são caracterizadas por expressar fatores de virulência que permitem sua persistência e disseminação no hospedeiro. O presente trabalho teve por objetivo avaliar fenogenotipicamente os fatores de virulência de isolados de Staphylococcus spp. a partir de casos de mastite bovina. Foram analisadas 272 amostras de leite provenientes de oito propriedades da região Sul-Fluminense do Estado do Rio de Janeiro. Após identificação, obteve-se um total de 250 isolados de Staphylococcus spp. Estes foram submetidos às provas fenotípicas de detecção da produção de "slime" em microplaca e em ágar vermelho congo; produção de hemolisinas e sinergismo hemolítico; produção de caseinase e DNase. Posteriormente foram submetidos à técnica de PCR para detecção dos genes de produção de cápsula (cap5 e cap8), fibronectina (fnbA,e fnbB), "slime" (icaA e icaD) e hemolisinas (hla e hlb). Do total avaliado, 58% (145/250) foi identificado como Staphylococcus spp. coagulase-negativos e 42% (105/250) como Staphylococcus spp. coagulase-positivos, destes 36,2% (38/105) foram identificados como S. aureus, 11,4% (12/105) como S. intermedius e 3,8% (4/105) como pertencentes ao grupo SIG. Apenas 6,4% (16/250) dos isolados foram produtores de α-hemólise, 4,8% (12/250) de β-hemólise e, 1,6% (4/250) de α e β-hemólise. A produção de caseinase foi observada em 66,4% (166/250), e a produção de "slime" avaliada pela técnica da microplaca em 76,8% (192/250) dos isolados, respectivamente. A DNase foi detectada em ECNs (38/145) e S. aureus (14/38). Os marcadores genéticos avaliados para a produção de slime, icaA e icaD apresentaram nenhuma ou leve concordância com a produção fenotípica, respectivamente, utilizando o coeficiente Kappa. Tal dado parece indicar que outros marcadores genéticos podem estar envolvidos com a expressão desta característica. Os demais genes detectados com frequência de 4% (10/250) para cap5 e para cap8, 32,8% (82/250) para fnbA, 4,4% (11/250) para fnbB, 19,2% (48/250) para hla e 18% (45/250) para hlb. O perfil circulante nas propriedades foi o 1: isolado produtor de "slime" e caseinase. O gene spaA foi positivo em todos os S. aureus, apresentando amplicons de tamanhos variados, sendo o tamanho prevalente o de 300pb. A amplificação do gene coa apresentou nove tipos polimórficos distintos, sendo prevalente o amplicon de 600pb. O gene agr foi detectado em todos os S. aureus, com amplicon de 200pb. Foi observado que os genes de virulência estudados estavam distribuídos de modo aleatório entreos 6 distintos perfis eletroforéticos obtidos através da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE).

Detecção de fatores de virulência de Escherichia coli e análise de Salmonella spp. em psitacídeos

A flora entérica dos psitacídeos é composta principalmente por bactérias Gram positivas. Bactérias Gram negativas, como Escherichia coli e Salmonella spp., apresentam elevado potencial patogênico, sendo consideradas indicativo de problemas de manejo, que poderão culminar em manifestação de doenças em decorrência de fatores estressantes, dietas deficientes e superlotação, combinados com alta carga bacteriana no ambiente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de Salmonella spp., Escherichia coli e os fatores de virulência dos genes iss e iutA dos isolados de E. coli. Analisou-se um total de 44 amostras provenientes de psitacídeos criados em cativeiro, sendo estas 15 fragmentos de órgãos de aves submetidas a exame de necropsia e também 29 amostras de swabs de cloaca e inglúvio de papagaios-charão (Amazona pretrei) criados em cativeiro. Nenhuma amostra foi positiva para Salmonella spp. Nas amostras de E. coli detectou-se ambos os fatores de virulência pesquisados.

Att berättä sig själv, att förmedla känslor : seminarierapport

The therapeutic uses of storytelling : internationellt symposium vid Åbo Akademi, 13−14.12.2012.

Comparação das técnicas de ELISA indireto e Imunofluorescência indireta na detecção de anticorpos anti-Neospora caninum em búfalas (Bubalus bubalis)

Para comparar dois testes sorológicos na detecção de anticorpos anti-Neospora caninum em soros sanguíneos de búfalas, foram coletados amostras de 288 búfalas entre dois a dez anos de idade. Para identificar a presença de imunoglobulina G anti-N. caninum utilizou-se à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), tendo o título 200 como ponto de corte, e o Ensaio Imunoenzimático indireto (ELISA-indireto), considerando-se positiva as amostras que obtiveram razão S/P>0,5. Observaram-se 153 (53,12%) animais soropositivos para N. caninum, através da RIFI, enquanto que 50 (17,36%) animais foram reagentes no ELISA. A ocorrência de anticorpos anti-N. caninum demonstram que o parasito esta circulando entre búfalas criadas no estado do Pará, sendo que ambos os teste de RIFI e ELISA podem ser utilizados para diagnosticar imunoglobulinas contra este agente. No entanto observou-se uma fraca correlação (Kappa=0,36) entre ambos os testes, considerando a RIFI como padrão ouro.

Lentivírus em caprinos leiteiros do semiárido paraibano: prevalência de anticorpos, fatores de risco e detecção molecular

Os objetivos do presente trabalho foram determinar a prevalência de caprinos leiteiros soropositivos para a infecção por Lentivirus de pequenos ruminantes no semiárido do Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil, identificar fatores de risco associados à prevalência de rebanhos positivos, e realizar a detecção molecular do agente. Foram utilizadas 1047 cabras leiteiras de 110 propriedades selecionadas aleatoriamente no Município de Monteiro, Estado da Paraíba, no período de março de 2009 a dezembro de 2011. Para o diagnóstico da infecção por Lentivirus, foi utilizado o teste de imunodifusão em gel de ágar (AGID). Um ano após foi realizada nova sorologia, e PCR em tempo real foi aplicada em amostras de sangue e leite de 48 cabras procedentes de quatro propriedades com animais soropositivos. As prevalências de propriedades positivas e de animais soropositivos na AGID foram 44,6% (IC 95% = 35,1% - 54,3%) e 8,1% (IC 95% = 5,6% - 16,8%), respectivamente. Realizar corte e desinfecção de umbigo (odds ratio = 2,44; p = 0,048) e condições de aglomeração de animais (odds ratio = 3,45; p = 0,048) foram associadas com a prevalência de propriedades positivas. Um ano após a realização do inquérito sorológico, foi verificada a permanência de animais infectados, detectados por PCR em tempo real a partir de amostras de sangue e leite. A PCR em tempo real das amostras de leucócitos circulantes apresentou boa performance, com sensibilidade de 100%, especificidade de 92,86%, concordância de 93,75% e indicador Kappa de 0,765. Sugere-se que seja realizado um trabalho de educação sanitária junto aos produtores sobre medidas de prevenção com o objetivo de reduzir a disseminação da infecção nos rebanhos.

Pseudobrânquia do guaru Poecilia reticulata (Peter, 1859): análise estrutural, morfométrica e histoquímica para detecção de glicoconjugados

A morfologia, os parâmetros citomorfométricos e os glicoconjugados presentes na pseudobrânquia de guaru, Poecilia reticulata Peter, 1859 (Cyprinodontiformes: Poeciliidae), foram investigados por microscopia de luz acoplada ao sistema de captura e análise de imagens, juntamente por histoquímica com lectinas. A anatomia microscópica indicou que P. reticulata possui pseudobrânquia glandular formada por dois lóbulos, a qual se localiza abaixo do epitélio faringiano. O órgão é constituído por parênquima vascularizado e rico em células pseudobranquiais. Esse tipo celular exibe estado citofisiológico ativo, com abundante sistema de biomembranas e ausência de óstio na superfície apical,que por sua vez é encontrado nas células ricas em mitocôndrias das holobrânquias. Assim, indica-se que as células da pseudobrânquia se distinguem das células das holobrânquias em relação à morfologia, histoquímica e fisiologia. Em decorrência dessas características intrínsecas, a pseudobrânquia de alevinos do guaru pode desempenhar funções não respiratórias nas fases iniciais do desenvolvimento. Além disso, a caracterização da pseudobrânquia do guaru possibilitará estudos futuros sobre o efeito de poluentes aquáticos em espécies biomonitoras, como P. reticulata.

Detecção de Toxoplasma gondii em órgãos do sistema reprodutivo de carneiros naturalmente infectados no Brasil

Objetivou-se com esse estudo detectar o DNA genômico de T. gondii em amostras de testículo e epidídimo de ovinos comercializados em abatedouros do Estado de Pernambuco Região Nordeste do Brasil. Foram coletadas 50 amostras de soro sanguíneo, 50 amostras de testículos e 50 de epidídimos. Para a triagem dos animais foi utilizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e posteriormente empregou-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nos animais positivos na sorologia. Observou-se 24% (12/50) dos animais positivos na RIFI e o DNA genômico foi detectado no epidídimo em 8,3% (1/12) das amostras. A identidade molecular dos produtos amplificados foi confirmada por sequenciamento. Relata-se a primeira ocorrência da presença do DNA de T. gondii em órgãos do sistema reprodutivo de carneiros naturalmente infectados no Brasil.

Análise de detecção de cluster na caracterização espaço-temporal da tuberculose bovina no estado da Bahia

A tuberculose bovina (BTB) é uma enfermidade causada pela infecção pelo Mycobacterium bovis que acomete o homem e diversas espécies de mamíferos. A BTB tem grande importância por causar prejuízos econômicos nas regiões infectadas e por seu impacto na saúde pública. Foi realizado inquérito epidemiológico no Estado da Bahia, entre 2008 e 2010, com o objetivo de estimar a prevalência e conhecer a distribuição espaço temporal da enfermidade. O Estado foi estratificado em quatro regiões, cada uma com características epidemiológicas e demográficas homogêneas representativas de formas de produção pecuária. Um total de 18.810 cabeças com idade superior a 2 anos foi amostrado em 1350 propriedades. O teste cervical comparativo foi aplicado em cada animal selecionado, sendo considerados positivos os animais reagentes positivos ou duas vezes inconclusivos. Latitude e Longitude foram tomadas para cada propriedade amostrada com o auxilio do aparelho de Global Positioning System (GPS). O teste de Cuzick-and-Edwards e a análise de rastreio espacial (spatial scan statistic) foram utilizados para identificar qualquer agrupamento espacial de BTB. A prevalência de rebanho na Bahia, indicando a proporção de propriedades foco, foi de 1,6% (IC 95%: 1,0% - 2,69% por região). Nenhuma evidência significativa (P<0.05) de aglomeração espacial ou clustering foi detectada, possivelmente devido à baixa prevalência da doença. Estes resultados sugerem que a BTB tem baixa prevalência no estado da Bahia e que, nestas condições epidemiológicas, os focos encontrados não podem ser explicados por fatores espacialmente estruturados.

Detecção de anticorpos IgG anti-Trypanosoma vivax em bovinos através do teste de Imunofluorescência indireta

Trypanosoma vivax infecta uma grande variedade de animais ungulados selvagens e domésticos, podendo causar grande impacto na produção de ruminantes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a detecção de anticorpos IgG anti-Trypanosoma vivax em bovinos provenientes do estado de Pernambuco, Brasil. Para tanto, foram analisadas 2,053 amostras de soro sanguíneo de bovinos provenientes de rebanhos de municípios do estado de Pernambuco, os quais foram analisados através da Reação de Imunofluorescência Indireta. Das amostras testadas 13,93% (286/2.053) foram reagentes para anticorpos IgG anti-Trypanosoma vivax. As freqüências, por mesorregião, variaram de 11,90% a 15,99%. Assim, os dados obtidos permitiram a caracterização do estado de Pernambuco como uma área de instabilidade enzoótica e sugere que o estado Pernambuco é área endêmica para Trypanosoma vivax e este parasito está distribuído por todo o estado.

Detecção sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos na Ilha de Marajó, Pará

O objetivo do estudo foi testar a prevalência sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos do municipio de Soure, Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Para a pesquisa sorologica foram selecionados randomicamente 800 animais e para a pesquisa molecular 50 destes animais foram aleatoriamente escolhidos. Para quantificar a prevalência sorológica utilizou-se o ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (iELISA) com antígeno total contendo proteínas de superfície externa e para quantificar a prevalência molecular utilizou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), envolvendo a amplificação de fragmento gênico da proteína de superfície maior 5 (MSP5). A prevalência de animais positivos no ELISA para A. marginale foi de 25% (200/800). Na PCR foi detectada a presença de A. marginale em 2% (1/50) dos animais. Embora apenas um animal tenha sido positivo na PCR, observou-se que o mesmo foi negativo no ELISA. A presença do agente, mesmo em baixa prevalência, mostra que os bubalinos podem funcionar como um importante reservatório desse patógeno para os rebanhos bovinos da região norte do Brasil.

Detecção de Brucella abortus em tecidos bovinos utilizando ensaios de PCR e qPCR¹

Objetivou-se no presente estudo avaliar as técnicas reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em Tempo Real (qPCR) para detectar Brucella abortus, a partir de tecidos bovinos com lesões sugestivas de brucelose. Para isto, 21 fragmentos de tecidos bovinos coletados em abatedouros de Mato Grosso do Sul foram processados e submetidos ao cultivo microbiológico e extração do DNA genômico para realização das reações de PCR e qPCR. No cultivo microbiológico, oito amostras apresentaram crescimento bacteriano e cinco foram confirmadas como B. abortus por PCR. Diretamente das amostras de tecido, DNA do gênero Brucella (oligonucleotídeos IS711) foi detectado em 13 (61,9%) amostras de tecido e 17 (81%) amostras de homogeneizado. Já com os oligonucleotídeos espécie-específicos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R, 14 (66%) amostras de tecido e 18 (85,7%) amostras de homogeneizado foram amplificadas. Seis amostras positivas na PCR espécie-específica foram sequenciadas e o best hit na análise BLASTn foi B. abortus. Na qPCR, 21 (100%) amostras de tecidos e 19 (90,5%) amostras de homogeneizado foram positivas para B. abortus. Dez amostras de DNA de sangue bovino de rebanho certificado livre foram utilizadas como controle negativo nas análises de PCR e qPCR utilizando-se os oligonucleotídeos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R. Na PCR nenhuma amostra amplificou, enquanto que na qPCR 2 (20%) amplificaram. Conclui-se que as duas técnicas detectam a presença de B. abortus diretamente de tecidos e homogeneizados, porém a qPCR apresentou maior sensibilidade. Os resultados obtidos indicam que a qPCR pode representar uma alternativa rápida e precisa para a detecção de B. abortus diretamente de tecidos, e ser utilizada em programas de vigilância sanitária, por apresentar sensibilidade e especificidade satisfatórias.

Padronização da técnica de nanopartícula de ouro não modificada (AuNPs) para detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae em pulmões de suínos

Testes diagnósticos baseados na detecção de ácidos nucleicos sem amplificação prévia através da utilização de nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido descritos para várias enfermidades. Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma técnica de AuNPs não modificada para detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae (App). Utilizaram-se 70 amostras de pulmão de suínos, 17 sem lesão e 53 com lesões características de pneumonia, objetivando a detecção de App. O oligonucleotídeo utilizado foi baseado no gene ApxIV. O teste de AuNPs apresentou sensibilidade de 93,8% e especificidade de 84,6% quando comparado com a detecção pela PCR. Os resultados mostraram boa concordância entre os testes de AuNPs e a PCR, sendo que a técnica pode ser utilizada como alternativa aos testes convencionais, já que é de fácil e rápida execução e não exige infraestrutura e mão de obra especializada.

Utilização de três métodos imuno-histoquímicos na detecção de aspergilose e zigomicose em animais

Visando a otimização do uso da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) na detecção de Aspergillus spp. e zigomicetos (membros da família Mucoraceae), utilizaram-se dois anticorpos monoclonais fungo-específicos em fragmentos de tecidos de animais (fixados em formol e embebidos em parafina) com diagnóstico histomorfológico prévio de aspergilose e zigomicose, os quais foram submetidos a três sistemas de detecção diferentes (dois biotinilados e um não biotinilado). Os dois anticorpos apresentaram alta especificidade e sensibilidade nos tecidos examinados. Não ocorreram reações cruzadas entre os anticorpos utilizados e os agentes etiológicos avaliados (incluindo casos de aspergilose, zigomicose, candidíase e pitiose). No entanto, reações inespecíficas foram observadas nas hifas em alguns casos, as quais puderam ser eliminadas através de um dos métodos de detecção utilizados. Para a aspergilose, o método da estreptavidina-biotina-fosfatase alcalina não apresentou reações inespecíficas nas hifas. Enquanto que nos casos de zigomicoses, as reações inespecíficas não ocorreram no método por polímero (não biotinilado). A técnica de IHQ mostrou-se uma ferramenta muito útil na detecção e confirmação dos casos de aspergilose e zigomicose neste estudo retrospectivo.